Name: La microscopie intravitale du système vasculaire associées à la tumeur en utilisant Advanced dorsale pli fenêtre Chambers sur des souris transgéniques fluorescents (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Découvrez la microscopie intravitale pour étudier la vascularisation tumorale chez la souris transgénique fluorescente. Cette technique permet d'observer en temps réel la formation des vaisseaux sanguins et l'efficacité des traitements anticancéreux.

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Nous tenons à remercier Rien van Haperen et Rini de Crom pour leur développement et leur don de la ligne eNOSTag-GFP, Joost A.P. Rens pour son assistance technique pour le travail d’animaux et les gardiens d’animaux pour leur aide. Les installations de microscopie utilisées font partie du pôle de l’imagerie optique Erasmus, et nous tenons à remercier le personnel de l’OCI pour leur service. Cette étude a été financée par grant DDHK 2000-2224 du Dutch Cancer Society, « Vereniging Trustfonds » Université Érasme de Rotterdam et « Stichting Erasmus Heelkundig Kankeronderzoek », et nous remercions les membres des comités pour leur générosité.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Comme la tumeur et le développement de tumeurs navire, ainsi que des effets thérapeutiques de tumeur, sont des processus très dynamiques, évaluation intravitale est un outil élégant de faire une évaluation correcte de ces processus de manière spatiale-dépendante du temps et. Avec la multiplication des marqueurs de cellules vivantes, la création d’animaux transgéniques et l’avancement des modalités d’imagerie, imagerie intravitale devient plus populaire. Même si l’histologie est encore couramment utilisée, et une multitude de marqueurs peut être utilisée pour identifier les cellules et structures, découpe de tissu présente des inconvénients lors de l’étude des processus dynamiques. La dissection des tissus est nécessaire, fournir uniquement des informations statiques ; fixation influe sur la qualité de tissu ; et tranchage interactions cellulaires de dommages-intérêts. En outre, lors de l’étude des processus dynamiques, dissection des tissus aux points de temps différents et souvent présumées, nécessite une grande quantité d’animaux. Avec l’imagerie intravitale, les dimensions spatiales de XYZ et la dimension supplémentaire de temps peuvent être évaluées chez le même animal, permettant le positionnement correct des différents acteurs dans l’espace et le temps. Par conséquent, points dans le temps optimale ne sont pas manqués, et le nombre d’animaux utilisé par expérience est considérablement réduit. Deuxièmement, la fenêtre de temps établie avec évaluation intravitale peut être extrapolée pour optimiser l’extraction tissulaire. En troisième lieu, la scène désirée de la croissance des vaisseaux peut être identifiée intravitally et colorée comme un tissu entier-montent.
La conception intravitale mentionnée dans ce manuscrit utilise une combinaison d’animaux transgéniques exprimant une étiquette fluorescente dans les cellules endothéliales, a mis à jour le dorsale du pli cutané modèle de chambre et un microscope multiphoton confocal dédié.
Les cellules endothéliales passent par un certain nombre d’étapes21,22 au cours de l’angiogenèse, et ces étapes peuvent souvent être vus simultanément dans une tumeur. À l’aide de la lignée de souris eNOSTag-GFP, cellules endothéliales individuelles peuvent être suivies, et même filopodes dynamique peut être retracée. C’est donc un bon modèle pour étudier le développement du navire intravitally. Selon les étiquettes intrinsèques déjà à ce jour, les agents fluorescents injectables peuvent être utilisés afin d’évaluer la formation de lumen, débit sanguin, l’extravasation et clairance sanguine. La souris est imagée en continu pendant 5 h. L’évaluation à long terme d’un animal est faisable lorsque plusieurs Précautions concernant l’anesthésie de l’animal, qui a été décrit précédemment23. Comme cette recherche se concentre sur le cancer, les tumeurs tissus ou des cellules ont été implantés. Cependant, nous avons expérimenté également métatarses et poumons embryonnaires. Toutefois, le taux de croissance du tissu sous étude est limité, car après quelques semaines, la peau commence à repousser, qui peut être un problème avec des tissus ou des tumeurs à croissance lente.
Pendant la phase de validation, la partie dorsale que du pli cutané chambre de fenêtre a été considérablement modifié par rapport au modèle classique4. Les cadres sont construits en matériaux synthétiques autoclavable et sont légers et petits, avec une zone de grand-vue de la fenêtre. Le crochet de la bague de retenue (Figure 1Bg, pointe de flèche blanche) est utilisé uniquement pour le retrait facile de l’anneau. Anneaux de retenue sans crochets peut être utilisé lorsque ceux-ci interfèrent avec l’imagerie. La peau est tendue pas trop, desserrant ne se produit pas dans ce modèle, et les infections sont rarement observées. Ces modifications réduisent l’inconfort animale et d’affiner la procédure animale significativement. Outre, les parties métalliques peuvent être facilement supprimées lorsque la tumeur à l’aide de MRI24d’imagerie.
N’importe quel microscope puisse être adoptée à intravitally image dorsale chambres du pli cutané. La principale exigence est la quantité d’espace disponible entre la platine du microscope et la lentille de l’objectif. Un aspect important qui affecte l’imagerie est mouvement. Pour éviter les artefacts de mouvement, une plate-forme qui s’inscrit dans le tableau de microscope (après le retrait de toutes les insertions) et prend en charge de la souris doit être utilisée. Il n’est pas nécessaire de restreindre la souris lorsqu’il est sous anesthésie, et il est préférable de laisser le souffle de souris librement. Toutefois, la fenêtre est boulonnée sur la plate-forme, ce qui donne une fixation optimale du champ de vision (c.-à-d., la tumeur est visible à travers la chambre de la fenêtre). La plate-forme est chauffée à l’aide d’une garniture de chauffage électronique, tel qu’utilisé pour le chauffage des animaux. Cette plate-forme a été effectuée en interne, et les spécifications peuvent être obtenues sur demande. Un objectif de haute résolution est une nécessité lors de l’évaluation des processus intracellulaires et permet d’établir une distinction entre le cytoplasme et le noyau. L’utilisation d’une lentille conique avec une bonne résolution optique (NA élevé) mais une relativement longue distance de travail (préférence 2 mm ou plus) est recommandé. La limitation en imagerie est la profondeur de pénétration et l’intensité de fluorescence des étiquettes. En outre, le photoblanchiment, phototoxicité et la saturation doivent être évitées pendant la formation image.
Ici, un confocal-multiphoton intégré et un microscope confocal ont été utilisés. Le multiphoton est en position verticale, tandis que le confocal est un microscope inversé. L’avantage d’un microscope vertical est la facilité d’utilisation de lentilles immersion dans l’eau. Ces lentilles ont un NA élevée et une longue distance de travail, même à un grossissement élevé (p. ex., 20 ou 40 X). Plus précisément, il est recommandé d’obtenir une lentille de-immersion dans l’eau 20 X NA 1.0, qui est vendu par plusieurs entreprises. Sachez que, lorsqu’on utilise des lentilles de l’immersion, l’objectif et du liquide d’immersion doivent être chauffé à 37 ° C. Pour les meilleures images, il est recommandé d’utiliser les réglages optimaux de confocal (c.-à-d., trou d’épingle à 1 unité aérée, aussi bas que possible, gain pas trop élevé de puissance de laser (surtout si le gain introduit le bruit), line vitesse au maximum et pas avec une moyenne de scans). Surexposition, la saturation et la différence d’intensité entre images, compromettent la qualité des données. Il est recommandé d’éviter la saturation et la surexposition. Ceci peut être contourné par l’acquisition d’images à des réglages différents. Changer le gain est la meilleure façon de changer la luminosité de l’image. Le cas échéant, la puissance du laser peut être réglée. Afin de normaliser la qualité d’image, diapositives avec une intensité de fluorescence fixe peuvent être utilisés. Il faut garder à l’esprit que, même lorsque le microscope est défini de façon optimale, une qualité d’image est déterminée dans une large mesure par la qualité de la chambre de la fenêtre et les tissus
Lorsque vous numérisez simultanément plusieurs marqueurs fluorescents, cordeau, dans lequel un fluorophore est détecté dans le canal d’une autre, doit être évitée. Évitez les cordeau en utilisant une combinaison des fluorophores avec les spectres qui se chevauchent un minimum et par balayage entre les membrures séquentiel. Les images présentées ici ont été analysés à l’aide de 3 balayages séquentiels (piste 1 : GFP, DID ou fluor647 avec le laser 488 et 633 ; Track2 : rhodamine, Doxil ou mTomato avec le laser 543 ; et Track3 : Hoechst avec le laser 405).
La possibilité d’évaluer plusieurs stades de développement de tumeurs bateau, pointe cellule dynamique, formation de lumen, extravasation et blessures vasculaires est montrée ici. À l’aide de la ligne eNOStag-GFP, secteurs tumeur avec un lit vasculaire détruit sont facilement détectés par granulé restes cellulaires exprimant toujours GFP. Aucun agent injectable a été détectée dans ces domaines, indiquant l’absence de flux. Cela signifie que les administrés des agents chimiothérapeutiques n’atteindra pas non plus ces zones. Cependant, destruction du navire peut également être un résultat thérapeutique. Évaluation préliminaire de la tumeur, pour vérifier la destruction du navire avant le traitement, est une condition préalable à l’évaluation thérapeutique précise et peut être facilement réalisée à l’aide de ce dispositif expérimental.
Il y a une multitude de possibilités pour lesquelles la microscopie intravitale peut être utilisée, et discussion détaillée déborde le cadre de la présente publication. Pour donner un bref aperçu, applications possibles comprennent des études sur l’accumulation d’agents chimiothérapeutiques dans le tissu tumoral, le développement des vaisseaux (p. ex., le nombre de navires, les branches et les intersections) et la circulation sanguine, les interactions cellule-cellule, la cellule cible et transformation intracellulaire, ainsi que des exemples mentionnés ci-dessus et ci-contre. Comme l’analyse est basée sur la fluorescence, être au courant des fluctuations d’intensité en raison de la qualité de la fenêtre ou le tissu. En outre, comme un tissu tumoral est relativement épais, fluorescence par dessus ou en dessous du plan de vue a un impact sur le signal dans l’image. Il est préférable de combiner l’analyse quantitative d’image avec des mesures objectives. Par exemple, si vous êtes intéressé dans les concentrations de médicament, enlever le tissu tumoral de la fenêtre après la microscopie intravitale et déterminer le contenu à l’aide avec l’HPLC à comparer avec les images confocales de médicament.
L’évaluation de la réponse tumorale peut être effectuée aussi bien à l’aide de ce modèle, mais avec quelques précautions. On doit réaliser que les tumeurs poussent également vers l’intérieur, dans la peau. Mesures 3D peuvent être effectuées si la pénétration est assez profonde pour couvrir la tumeur entière. Dans un tel cas, colorants rouge sombre devraient être utilisés. La chambre de fenêtre comme décrit ici traite de tumeurs dans un environnement de peau et il est important de souligner que la fenêtre maintienne une température légèrement inférieure à la température de corps de souris normales. Par conséquent, il est préférable d’étudier des tumeurs dans le cadre environnemental droit micro pour confirmer des études intravitale avec la partie dorsale du pli cutané chambre fenêtre. Ce qui est important, la partie dorsale du pli cutané chambre offre un aperçu de la cinétique des processus et des mécanismes, fournissant une base instrumentale pour l’amélioration de la thérapie. On trouvera également des informations supplémentaires sur la biodistribution et pharmacocinétique. Classiquement, ces études de biodistribution sont effectuées en traitant les animaux porteurs de tumeurs et dissection des tumeurs et des organes pour mesurer l’absorption de drogues. En utilisant ce modèle intravital, l’emplacement intratumorale d’un médicament (c.-à-d., intravasculaire, intratumorale, intracellulaire, ou nucléaire) peut être fourni5,25,26. Est non seulement l’emplacement de la drogue, a révélé, mais également le temps fenêtre-de-occasion à saisir pour l’absorption optimale.
En utilisant le dispositif expérimental décrit dans cet article, un large éventail de paramètres peut être évalué dans un cadre temporel et spatial. Plus précisément, nous démontrons que la microscopie intravitale fournit des renseignements importants sur la dynamique de développement de navire de tumeurs et de la réponse thérapeutique.

Tandis que des études in vitro permettent une imagerie cinétique des processus, in vitro l’expérimentation ne permet pas d’évaluation dans le contexte approprié. Par exemple, l’interaction des cellules tumorales avec compartiments stromales ou de medicaments et de distribution à l’intérieur d’une tumeur ne peut être étudiée dans une plaque de culture. Modèles animaux sont donc utilisés pour imiter la physiologie humaine et la pathologie. Toutefois, l’imagerie longitudinale des processus, en particulier à une résolution subcellulaire, est un défi. Moléculaire, méthodes d’imagerie, telles que l’imagerie par résonance magnétique (IRM), émission de photon unique calculé tomographie (SPECT) et émission positons (TEP), ont des profondeurs de pénétration bonne mais manque de résolution ou ne parviennent pas à illustrer les structures anatomiques. Imagerie optique fournit haute résolution et permet l’imagerie des structures, mais elle est accompagnée de pauvres à pénétration minimale de1. L’application de la microscopie intravitale en combinaison avec la fenêtre de chambre impédancemétriques technologies, comme une dorsale ou fenêtre abdominale, permet à haute résolution d’imagerie in vivo2,3,4. Cette technologie offre des avantages distincts, car il permet l’imagerie longitudinale au fil des heures et même des jours, pour l’imagerie des processus dans le contexte approprié (par exemple, les interactions cellule-cellule dans le tissu imagé) et des résolutions aux limites optiques de avancées microscopes confocaux et multiphotoniques.
L’introduction d’animaux transgéniques avec étiquettes fluorescentes propres protéines ou cellules ouvre une multitude de possibilités pour des expérimentations in vivo et ex vivo . Pour instance, interactions cellules-cellules, la production de protéines et la réponse à la manipulation ou la thérapie peuvent être étudiés in vivo à l’aide de ces modèles5,6,7,8. Positionner ce qui est important, en lieu et temps peuvent être déterminées avec le bon équipement d’imagerie et de la méthodologie. Ici, la microscopie intravitale d’animaux exprimant un marqueur endothélial en combinaison avec des agents injectables dans une tumeur implanté dans une mis à jour le dorsal du pli cutané chambre fenêtre est présenté.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D1145</td><td>Complété par 10 % de</td></tr><tr><td>FCS Trypsin-versene (EDTA)</td><td>Lonza</td><td>BE17-161E</td><td>Préparer une solution à 0,1 % dans du PBS, PBS</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> stérile <tr><td>Cadres de fenêtre</td><td>Costum made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verre de remplissage 10 mm, 0,55 mm</td><td>Abrisia technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verre de couverture 12mm, épaisseur</td> <td>#1Thermo Scientific/VWR</td><td>631-0713</td><td></td></tr><tr><td>Gel anti-ouïe (veet)</td><td></td><td></td> <td>pour peaux sensibles</td></tr><tr><td>Pommade pour les yeux Chlorhydrate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> de<td>buprénorfine</td><td>utilisation 0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>Unité</td><td></td><td></td><td>d’anesthésie O2/Isoflurane Unité d’inhalation avec chambre et tube + seringue à insuline conique</td></tr><tr><td>0,5 ml x 12,7 mm 29g, vert</td><td>BD</td><td></td><td></td>324824</tr><tr><td>Aiguilles 23G 1 1/4"</td><td>Aiguilles</td><td>4657640</td><td></td></tr><tr><td>Braun 25G 5/8"</td><td>Braun</td><td>4657853</td><td></td></tr><tr><td>Sutures silkan 0.7</td><td></td><td>Braun</td> 1134019 <td></td></tr><tr><td>Nuts</td><td>Jeveka</td><td>934 A2 1</td><td></td></tr><tr><td>Boulons</td><td>Jeveka</td><td>84 A2 1 10</td><td></td></tr><tr><td>0.9 % NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope + logiciel</td><td></td><td></td><td>L’espace entre la table et l’objectif doit être suffisamment large pour contenir l’animal</td></tr><tr><td>Plate-forme chauffée à température contrôlée</td><td>Costum fabriqué Support</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de fenêtre</td><td>Costum fabriqué</td> tétraméthylrhodamine <td></td><td></td></tr><tr><td>2 000 000 MW dextran</td><td>Invitrogen</td><td>D7139</td><td>100 &micro ; g/souris</td></tr><tr><td>Alexa-fluor 647 10 000 MW dextran</td><td>Invitrogen</td><td>D22914</td><td>100 &micro ; g/souris</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td>25 &micro ; g/mouse</td></tr><tr><td>Nanoparticules</td><td></td><td></td> pégulées <td>ref 5</td></tr><tr><td>LEICA TCS SP5 Microscope multiphotonique</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF Software</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la microscopie intravitale du système vasculaire associées à la tumeur en utilisant advanced dorsale pli fenêtre chambers sur des souris transgéniques fluorescents

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumeur et le développement de tumeurs navire, ainsi que la réponse tumorale aux méthodes thérapeutiques, est des processus biologiques hautement dynamiques. L’histologie fournit des informations statiques et n’est souvent pas suffisant pour une interprétation correcte. Intravitale évaluation, dans laquelle un processus est suivi dans le temps, fournit des informations supplémentaires et souvent inattendues. Avec la création d’animaux transgéniques exprimant des marqueurs spécifiques des cellules et des traceurs de cellules vivantes, des améliorations d’équipement d’imagerie et le développement de plusieurs chambres d’imagerie, la microscopie intravitale est devenu un outil important pour mieux comprendre processus biologiques. Cet article décrit un modèle expérimental pour l’étude du développement de navire des tumeurs et des effets thérapeutiques de façon spatiale et temporelle. En utilisant cette configuration, le stade de développement de navire, formation cellulaire et lumen de pointe, la circulation sanguine, extravasation, un lit vasculaire établie et la destruction vasculaire peut être visualisé et suivi. En outre, des effets thérapeutiques, intratumorale sort et la localisation des composés chimiothérapeutiques peuvent également être suivis.

Le principal attribut d’imagerie intravitale est la visualisation longitudinale de processus cellulaires sans intervention invasive. Pour ce faire, les animaux transgéniques exprimant un marqueur fluorescent constitutif ou inductible dans les cellules d’intérêt sont utilisés. La figure 2 illustre l’expression d’étiquettes fluorescentes eNOStag-vert fluorescent protein (GFP)9 et Rosa-mTmG souris lignes10. L’eNOStag-GFP est une lignée de souris qui a été produite interne utilisant un gène tronqué eNOS comme une balise de GFP. Ce qui est important, eNOS est fortement exprimée dans les cellules endothéliales, et le signal de la GFP est clairement visible dans th eGolgi et de la membrane cellulaire (Figure 2 a). Rosa-mTmG souris ont un allèle de journaliste de Cre axés sur la membrane de la fluorescence de deux couleurs. Cette ligne exprime mTomato fluorescence dans les cellules généralisées et mGFP dans les cellules exprimant une recombinase Cre et est largement utilisée pour le traçage de la lignée. Comme un morceau de la tumeur est transplanté provenant d’un donneur non transgéniques, fluorescence rouge est principalement exprimé par pièces de stroma dans la tumeur (par exemple, dans la membrane des cellules vasculaires, cellules, s’est infiltré dans les cellules sanguines et associées à la tumeur fibroblastes (Figure 2 b)).
Formation de vaisseaux est étroitement contrôlée, et un excellent modèle pour étudier c’est le développement rétine12,13. En outre, la croissance tumorale navire est un processus cinétique qui est semblable dans son principe au développement des vaisseaux rétiniens. Cependant, bateaux de tumeur manque d’organisation et, qu’une tumeur est une rénovation en continu, est donc la vascularisation associées à la tumeur. Cela peut avoir ses avantages lorsque la tumeur est utilisé comme un modèle angiogénique, comme tous les stades de développement de navire peuvent souvent être trouvées dans la tumeur même en même temps. Il s’agit d’un front de germination endothélial développe dans une partie non vascularisée de la tumeur (Figure 2) ; vaisseaux endommagés (Figure 2D) ; et un lit vasculaire établi (Figure 2E-j’ai) avec mature, ramifiée navires (Figure 2E-II). Cependant, les cellules endothéliales angiogéniques trouvera aussi dans ces domaines. Quand ils sont stimulés par des stimuli angiogéniques, une cellule endothéliale dépasse filopodes (Figure 2E-III) et peut avancer dans une cellule de pointe, à l’aide de ces filopodes migration directionnelle et du balayage (Figure 2E-IV). Cette cellule de pointe migre dans l’interstitium de tumeur et est suivie par la Division des cellules de tige. Une cellule unique pointe endothéliales possède plusieurs filopodes en expansion, se rétracter et renouveler à tout moment et peut être suivie à l’aide de la microscopie intravitale (Figure 2F).
Deuxièmement, la microscopie intravitale peut servir à déterminer la formation de lumen à un front angiogénique, la circulation tout au long de la tumeur et extravasation sanguine. Selon déjà à ce jour des signaux fluorescents intrinsèques chez l’animal, les différents composés fluorescents peuvent être administrés. Extravasation et du débit sanguin peuvent être visualisées à l’aide de Hoechst, dextrans fluorescents ou BSA-FITC. Pour les longues études sur extravasation flux et particules de sang, circulation longue fluorescent étiqueté pégylé nanoparticules de 100 nm peut être utilisé. Pour plus d’informations sur la préparation de ces nanoparticules, voir une précédente publication5. L’emploi de ces composés est illustré dans la Figure 3. Les cellules endothéliales chez une souris de Rosa-mTmG peuvent être clairement vus envahir le tissu tumoral. Flux sanguin fonctionnelle est démontrée par la fluorescence mauve de nanoparticules systémiquement injectées dans la lumière des tubes vasculaires (Figure 3 a-I). NANOPARTICULES atteint étroitement des cellules endothéliales qui illustrent la formation d’une lumière dans la zone de cellules de tige (Figure 3 a-II). La livraison des agents chimiothérapeutiques administrés systématiquement dépend d’une vascularisation fonctionnelle afin d’atteindre l’interstitium de tumeur, et tel qu’illustré à la Figure 3 b, agents injectables, indépendamment de leur taille, ne pénètrent pas dans les zones avec des navires détruits, compressé de bateaux ou navires avec stase du sang.
Dans la plupart des organes, le revêtement endothélial forme une barrière fonctionnelle entre le sang et les tissus sous-jacents et le passage des molécules est étroitement contrôlée. Associées à la tumeur vasculaire, cependant, est connu pour être perméable, et coupure de pores dépend beaucoup de la tumeur type14. Les dextranes conjugué fluorescent avec différentes tailles peuvent être injectés pour évaluer le débit sanguin, la perméabilité et l’extravasation. Hoechst (615 Da) se diffuse rapidement dans le tissu tumoral et est absorbé par les cellules environnantes (Figure 3-J’ai). Peu de temps après l’injection, dextran de 10 KDa (Figure 3CII) et 2 MDa (Figure 3C-III) se trouvent dans le sang. Cependant, dextran que 10 KDa se retrouve également dans l’interstitium de tumeur, ce qui indique la perméabilité de la paroi endothéliale des molécules plus petites, qui est une caractéristique attribuée aux vaisseaux de la tumeur. 40 min après que injection (Fig. 3C-IV), dextran 10 KDa est éliminé de la circulation sanguine (Figure 3C-V) et l’intensité de fluorescence de dextran 2MDa est diminué ainsi (Figure 3C-VI). Cependant, grands dextranes ne se trouvent pas dans l’interstitium de tumeur, démontrant l’absence de la perméabilité aux grosses molécules dans ce laps de temps.
Physiopathologie des tumeurs, avec ses espaces très proliférantes, nécrotiques et non vascularisées, peut être très instructif lorsque la tumeur est utilisé comme un modèle angiogénique. Toutefois, cela pose un problème de traitement efficace et des enquêtes. L’hétérogénéité du système associées à la tumeur vasculaire entraîne une distribution hétérogène des médicaments administrés, laissant l’ensemble des zones exemptes de drogue15. Afin d’améliorer l’administration de médicaments, plusieurs stratégies peuvent être appliquées15,16,17, et la progression thérapeutique peut être examinée à l’aide de cette conception intravitale. Le système associées à la tumeur vasculaire peut être manipulé à l’aide d’agents vasoactifs pour améliorer la livraison de drogue17. Les résultats de la manipulation de navire de tumeur utilisant alpha de nécrose de tumeur (TNF) comme agent vasoactif en combinaison avec Doxil, la formulation liposomale encapsulée de la doxorubicine, un agent chimiothérapeutique sont présentés dans ce manuscrit5, 18 , 19. à la différence de dextrans, pégylé nanoparticules sont faites pour circuler pendant plusieurs heures, voire plusieurs jours, dans la circulation de sang20.
Tel que mentionné précédemment, la tumeur peut être préalablement numérisées afin d’identifier les secteurs tumeur correct selon la question de recherche. Sort de la drogue peut être évaluée dans les zones avec une vascularisation fonctionnelle par rapport aux zones avec un lit vasculaire déjà endommagé (données non présentées). Pour enquêter sur le sort des agents chimiothérapeutiques sans interférence cytotoxique, nanoparticules avec la même composition que l’agent thérapeutique peuvent être utilisés comme une drogue de modèle. Un animal eNOStag-GFP a été traitée i.v. avec ces nanoparticules et imagés 24h plus tard. NANOPARTICULES étaient encore présents dans le système vasculaire, avec extravasation minime dans l’interstitium de tumeur (Figure 4 a-I). Toutefois, lorsque les nanoparticules ont été administrés en combinaison avec le TNF, extravasation observa de la circulation sanguine dans l’interstitium de tumeur (Figure 4 a-II), en augmentant les medicaments intratumorale. La localisation intracellulaire d’un composé à l’aide de lentilles de l’objectif à haute résolution, peut être reconnue, comme illustré ici par la localisation nucléaire de Hoechst dans les cellules endothéliales verts et de l’interstitium de tumeur (Figure 4 b). En outre, comme beaucoup d’agents chimiothérapeutiques, comme la doxorubicine, intercaler avec l’ADN, la localisation de ces composés peut être évaluée. Doxorubicine a des propriétés fluorescentes rouges, et le nanocarrier peut être étiqueté avec, par exemple, perchlorate de tetramethylindotricarbocyanine (DiD). Un animal eNOStag-GFP a été injecté i.v. avec Doxil-fait en combinaison avec le TNF, et les images ont été prises 24 heures après le traitement. Doxil-extravasé hors des vaisseaux sanguins et a été transporté vers le haut en l’entourant d’un tissu tumoral (Figure 4-j’ai). Une évaluation plus détaillée des différentes cellules (Figure 4C-II) a montré que le transporteur se trouvent dans le cytoplasme, tandis que la doxorubicine libéré a été observée dans le noyau cellulaire.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55115/55115fig1.jpg"> Figure 1 : Instruments, dorsales pli cutané chambre et installation de l’équipement requis pour le mode opératoire. (A) tumeur fragments (a) et les instruments chirurgicaux nécessaires à l’implantation. Instruments non standards sont un perforateur d’oreille (b), un tournevis micro (c) et une aiguille tordue (d). (B) dorsale du pli cutané chambre fenêtre. Recto (a) et (b) la fenêtre de retour (flèche : trous pour sutures ; flèche : trous pour les boulons), 2 boulons (c), 2 écrous (d), 1 remplissage verre (e), 2 verres de couverture (f) et 2 fixation anneaux (g). En outre, circlips sans crochets (flèche blanche) peut être utilisé lorsque requis. (C) chambre sur mesure porte b, boulons pour la chambre-à porte (b), plate-forme de contrôle de la température (c), les boulons pour fixer le support de la chambre à la plate-forme (d), et le titulaire avec l’anesthésie tube (e). (D) Animal monté dans le porte de la chambre sur la plate-forme. Une tumeur B16BL6 (flèche) est visible dans la zone d’affichage de la fenêtre. (E) l’équipement nécessaire pour l’évaluation intravitale. Ordinateur avec imagerie et microscope contrôle logiciel (a), standard fluorescent lumière (b) et le microscope. Un multiphoton confocal a été utilisé (c) avec un appareil d’anesthésie (d). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55115/55115fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55115/55115fig2.jpg"> Figure 2 : fluorescence intrinsèque d’animaux transgéniques. Toutes les images présentées ici sont des projections de Z-pile entre 50 et 70 µm d’épaisseur. (A) dans la ligne d’eNOSGFP-tag, GFP est exprimée dans le Golgi (astérisque) et la membrane de la cellule (flèche) des cellules endothéliales. Echelle = 100 µm. (B) intratumorale expression de mTomato dans la ligne de Rosa-mTmG est principalement trouvée dans la membrane cellulaire des cellules vasculaires (flèche) et des cellules sanguines (astérisque). Echelle = 100 µm. (C) A projection de croissance angiogéniques front dans une tumeur non vascularisée. Echelle = 100 µm. (D) A projection d’une partie de la tumeur avec des navires établis et abîmés (astérisque). (E) une projection de la vascularisation tumorale établie (AE) montrant tique mature navires (IIe) ; cellules endothéliales angiogéniques avec filopodes (EIII, pointe de flèche) ; et un navire de maturité, d'où une seule cellule endothéliale s’étend un filopodium (EIV, pointe de flèche) dans l’interstitium. Echelle = 100 µm. mouvement (F) des filopodes, suivi pendant 1 h. Toutes les 15 min, une Z-pile a été prélevée ; une projection maximale est présentée ici. Étendez les filopodes (flèche blanche), stagnant (=), rétractable (flèche rouge), ou même complètement disparaître (-). Echelle = 25 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55115/55115fig2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/55115/55115fig3.jpg"> Figure 3 : Administration des étiquettes injectables pour illustrer l’extravasation et la circulation sanguine. Souris de mTmG Rosa (A), A a été injectée avec des nanoparticules fluorescentes violets, et une Z-pile d’un front de cellule pointe invasion a été prise 10 min plus tard (AI). Une projection montrant que des germes plus endothéliales ont une lumière fonctionnelle (AII, flèche). Que rarement choux endothéliales sont visibles sans écoulement (AII, pointe de flèche). Echelle = 250 µm. (B) cette projection Z-pile montre une zone de navire détruit tumeur chez un animal eNOStag-GFP avant le traitement (BI). L’animal a été injectée avec des nanoparticules (violet, BII) et Hoechst (bleu, BIII). Nanoparticules et Hoechst n’atteignent pas des zones détruites, indiquées par les débris cellulaires granulé exprimant toujours GFP. Echelle = 250 µm. (C) une souris eNOStag-GFP a été injectée avec deux dextrans de différentes tailles (rouge = Dextran 2 MDa ; violet = dextran 10 KDa) et Hoechst (bleu = 615 Da), et le seul plan images sont présentés ici. 10 min après l’injection, la présence dans le sang et l’extravasation sont visibles dans la même image. Hoechst extravasates presque immédiatement sur les vaisseaux sanguins et est absorbé par les cellules voisines (CI). Dextran 10 KDa (CII) peut être vu dans les vaisseaux et dans l’interstitium de tumeur. Dextran 2 MDa (CIII) se trouvent dans les vaisseaux. 40 min après l’injection (CIV), Dextran 10 KDa disparaît du sang (CV), et l’intensité de fluorescence de Dextran 2 MDa était aussi réduite (CVI). Echelle = 100 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55115/55115fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/55115/55115fig4.jpg"> Figure 4 : enquêter sur le sort des agents chimiothérapeutiques. (A) un animal eNOStag-GFP a été traitée i.v. avec des nanoparticules et imagés 24h plus tard. Les nanoparticules sont encore présents dans les vaisseaux, avec extravasation minime dans l’interstitium de tumeur (AI). Nanoparticules sont associées au TNF, extravasation est observée de la circulation sanguine dans l’interstitium de tumeur (AII). Echelle = 250 µm. (B) en utilisant des lentilles à haute résolution, le cytoplasme endothélial (vert) et noyau (bleu) d’une cellule individuelle peuvent être reconnus. Echelle = 50 µm. (C), un animal eNOStag-GFP a été injecté i.v. avec Doxil-fait en combinaison avec le TNF, et les images ont été prises 24 heures plus tard. Ici, l’extravasation de Doxil-a fait sortir les vaisseaux dans la tumeur interstitium est évidente (CI). Une évaluation plus détaillée des cellules individuelles (CII) montre que le transporteur pourpre se trouvent dans le cytoplasme (flèche), tandis que la doxorubicine libéré (rouge) est observée dans le noyau cellulaire (pointe de flèche). Echelle = 50 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55115/55115fig4large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Ce protocole décrit l’imagerie intravitale des souris transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents spécifiques des cellules. Intravitale imagerie fournit une méthode non invasive pour les observations à haute résolution dans les animaux vivants à l’aide de windows implantables permettant la visualisation microscopique des processus est possible. Cette méthode est particulièrement utile pour étudier les processus longitudinales.

La microscopie intravitale du système vasculaire associées à la tumeur en utilisant Advanced dorsale pli fenêtre Chambers sur des souris transgéniques fluorescents

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

L'objectif général de ce protocole est d'utiliser une chambre cutanée dorsale avancée pour examiner en détail le développement de la vascularisation associée aux tumeurs dans un modèle murin. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du cancer, telles que l'amélioration des thérapies et la compréhension de la progression tumorale. Le principal avantage de cette technique est que les processus sont étudiés dans le contexte approprié, en conditions réelles, et qu'ils peuvent être suivis dans le temps.Cette procédure sera démontrée par le docteur Ann Seynhaeve, chercheuse principale de mon laboratoire. À partir d'une souris donneuse non transgénique, prélevez un fragment de tumeur non nécrotique de 10 mm de diamètre afin de l'implanter dans la chambre dorsale de la souris receveuse. Utilisez une souris donneuse normale pour une tumeur syngénique ou une souris donneuse immunodéficiente pour un xénogreffe.La souris receveuse doit avoir au moins 12 semaines et peser vingt grammes ou plus. Réalisez toutes les interventions chirurgicales en conditions aseptiques. Par exemple, stérilisez les instruments chirurgicaux et les matériaux de la chambre par autoclavage.Après avoir sédaté la souris receveuse, rasez les poils sur toute la face dorsale à l’aide d’un tondeuse électrique, puis appliquez un gel dépilatoire. Rincez la peau pour l’assainir et séchez-la. Enfin, nettoyez soigneusement la peau dépilée à l’aide d’éthanol.Maintenant, tracez une ligne horizontale centrale le long de la colonne vertébrale. Ensuite, positionnez la fenêtre de visualisation à au moins 2 mm sous la ligne et marquez le périmètre de la fenêtre sur la peau. Puis, à l’aide d’un scalpel et de ciseaux, retirez soigneusement la peau située à l’intérieur de la ligne de périmètre sans endommager l’aponévrose sous-jacente.Ensuite, relevez le pli cutané et utilisez un poinçon auriculaire pour percer des trous de 1 mm de chaque côté de la zone de la fenêtre, destinés aux boulons qui maintiendront la fenêtre en place. Positionnez le cadre arrière sur la souris et fixez-le en vissant les écrous sur les boulons. Puis, tirez la peau de deux à trois millimètres par-dessus le cadre afin de vous assurer qu'elle est bien en place.Si tel est le cas, insérez des aiguilles de calibre 23 à travers les deux trous de suture situés en haut du cadre. Fixez le cadre en resserrant les écrous et maintenez-les à l’aide de porte-aiguilles clampés ; ne serrez pas excessivement les écrous afin d’éviter que la peau ne tourne autour des boulons. Ensuite, remplacez les aiguilles par des fils de suture pour fixer solidement le cadre à la peau.Maintenant, tournez la souris sur le côté. Sous cet angle, insérez un morceau épais de verre de remplissage et un verre de couverture standard de 12 millimètres. Fixez-les fermement à l’aide d’un anneau de maintien afin que la fascia soit bien serrée contre le verre.L'étape suivante consiste à hydrater la fenêtre à l'aide de chlorure de sodium à 0,9 %. Laissez tomber quelques gouttes sur la zone d'observation et absorbez l'excès. Maintenant, juste en dessous de la fenêtre, utilisez une aiguille de calibre 25 munie d'un coude à 90 degrés pour créer une poche profonde dans la fascia, capable de contenir un millimètre cube de tissu tumoral.Insérez ensuite le tissu tumoral dans la poche. Enfin, fermez la zone d'observation à l'aide d'un couvre-objet standard de 12 millimètres et d'un anneau de maintien. Toutes les bulles d'air disparaîtront en moins d'une heure.Avant de séder la souris, préchauffez une plateforme personnalisée contrôlée en température à 37 degrés Celsius. Après avoir sédaté la souris, placez-la sur la plateforme chauffée. Fixez un embout nasal pour délivrer de l'isoflurane et, si l'évaluation dure plus de cinq minutes, appliquez un produit ophtalmique.Maintenant, fixez la chambre à l’aide des boulons de la fenêtre sur un support sur mesure et arrimez le support à la plateforme. Ensuite, nettoyez la fenêtre en verre avec de l’eau et du coton. Puis, au microscope, vérifiez le développement des vaisseaux dans la tumeur à l’aide de l’objectif 10 fois, en lumière blanche et en lumière fluorescente.Après l'examen macroscopique, allumez les lasers confocaux. Réglez le panneau de contrôle du microscope sur un gain intelligent de 100 volts par tour. Un décalage intelligent de 10 % par tour, un zoom moyen, un positionnement moyen en X et Y, et 100 micromètres de position en Z par tour.Définissez le mode d'acquisition sur XYZ ou XYZT. Sélectionnez une résolution. Choisissez une vitesse d'acquisition de deux ou 400 hertz.Réglez le diaphragme sur une unité airy. Et sélectionnez l'option X bidirectionnelle. Lors de l'évaluation de plusieurs fluorophores possédant une plage spectrale potentiellement superposée, sélectionnez la numérisation séquentielle entre les images afin d'éviter les interférences et configurez les trajets de faisceau corrects.Paramétrez la moyenne de ligne à quatre, puis sélectionnez enfin un nouveau jeu de données pour l'expérience. À présent, concentrez-vous sur le tissu d'intérêt ; pour ce faire, il est préférable d'utiliser des objectifs à sec ayant des ouvertures numériques plus élevées. Ensuite, utilisez la numérisation rapide en direct pour obtenir le meilleur rapport signal sur bruit possible en ajustant le gain et le décalage de manière à éviter toute surexposition.Maintenant, sélectionnez la pile Z dans l'onglet d'acquisition. Effectuez un balayage Z rapide. À partir de ce balayage rapide, déterminez les positions initiale et finale du balayage complet.Ensuite, réglez la taille du pas Z en fonction de la taille du diaphragme et procédez à l'analyse complète. Les souris hôtes exprimant des marqueurs fluorescents ont été imagées après l'implantation de la tumeur en utilisant le protocole décrit. Le marqueur eNOStag-GFP s'exprime dans le Golgi et la membrane cellulaire des cellules endothéliales.Le marqueur ROSAmT/mG exprime une fluorescence rouge de manière ubiquitaire et une fluorescence verte dans les cellules exprimant la recombinase Cre. Une application de cette technologie concerne l'étude du développement des vaisseaux, car toutes les étapes sont observables dans les tumeurs. Par exemple, on peut observer des fronts endothéliaux en train de bourgeonner vers des zones non vascularisées.Les tumeurs possèdent également des vaisseaux endommagés et des lits vasculaires établis avec des vaisseaux ramifiés matures. Une autre application consiste à étudier la formation de la lumière, le flux sanguin et l'extravasation en appliquant des marqueurs au sang, tels que des nanoparticules fluorescentes. Ainsi, le flux sanguin peut être observé dans la lumière des tubes vasculaires et à proximité des cellules endothéliales de bout.Dans les cellules apicales, la formation d'un lumen au sein de l'élément de stockage est observable. La microscopie intravitale peut également être utilisée pour étudier l'effet d'agents chimiothérapeutiques. Par exemple, 24 heures après l'injection de nanoparticules chez un animal eNOStag-GFP, les nanoparticules sont restées dans la vascularisation avec une extravasation minimale vers l'interstitium tumoral.Cependant, lorsque les nanoparticules ont été administrées en association avec le TNF, une extravasation a été observée dans l'interstitium tumoral. Cela constitue une preuve d'une augmentation de la distribution intratumorale du médicament. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment installer une chambre d'observation cutanée dorsale et comment étudier les processus liés à la tumeur à l'aide de la microscopie confocale.

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