La microscopie intravitale du système vasculaire associées à la tumeur en utilisant Advanced dorsale pli fenêtre Chambers sur des souris transgéniques fluorescents

L'objectif général de ce protocole est d'utiliser une chambre cutanée dorsale avancée pour examiner en détail le développement de la vascularisation associée aux tumeurs dans un modèle murin. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du cancer, telles que l'amélioration des thérapies et la compréhension de la progression tumorale. Le principal avantage de cette technique est que les processus sont étudiés dans le contexte approprié, en conditions réelles, et qu'ils peuvent être suivis dans le temps.

Cette procédure sera démontrée par le docteur Ann Seynhaeve, chercheuse principale de mon laboratoire. À partir d'une souris donneuse non transgénique, prélevez un fragment de tumeur non nécrotique de 10 mm de diamètre afin de l'implanter dans la chambre dorsale de la souris receveuse. Utilisez une souris donneuse normale pour une tumeur syngénique ou une souris donneuse immunodéficiente pour un xénogreffe.

La souris receveuse doit avoir au moins 12 semaines et peser vingt grammes ou plus. Réalisez toutes les interventions chirurgicales en conditions aseptiques. Par exemple, stérilisez les instruments chirurgicaux et les matériaux de la chambre par autoclavage.

Après avoir sédaté la souris receveuse, rasez les poils sur toute la face dorsale à l’aide d’un tondeuse électrique, puis appliquez un gel dépilatoire. Rincez la peau pour l’assainir et séchez-la. Enfin, nettoyez soigneusement la peau dépilée à l’aide d’éthanol.

Maintenant, tracez une ligne horizontale centrale le long de la colonne vertébrale. Ensuite, positionnez la fenêtre de visualisation à au moins 2 mm sous la ligne et marquez le périmètre de la fenêtre sur la peau. Puis, à l’aide d’un scalpel et de ciseaux, retirez soigneusement la peau située à l’intérieur de la ligne de périmètre sans endommager l’aponévrose sous-jacente.

Ensuite, relevez le pli cutané et utilisez un poinçon auriculaire pour percer des trous de 1 mm de chaque côté de la zone de la fenêtre, destinés aux boulons qui maintiendront la fenêtre en place. Positionnez le cadre arrière sur la souris et fixez-le en vissant les écrous sur les boulons. Puis, tirez la peau de deux à trois millimètres par-dessus le cadre afin de vous assurer qu'elle est bien en place.

Si tel est le cas, insérez des aiguilles de calibre 23 à travers les deux trous de suture situés en haut du cadre. Fixez le cadre en resserrant les écrous et maintenez-les à l’aide de porte-aiguilles clampés ; ne serrez pas excessivement les écrous afin d’éviter que la peau ne tourne autour des boulons. Ensuite, remplacez les aiguilles par des fils de suture pour fixer solidement le cadre à la peau.

Maintenant, tournez la souris sur le côté. Sous cet angle, insérez un morceau épais de verre de remplissage et un verre de couverture standard de 12 millimètres. Fixez-les fermement à l’aide d’un anneau de maintien afin que la fascia soit bien serrée contre le verre.

L'étape suivante consiste à hydrater la fenêtre à l'aide de chlorure de sodium à 0,9 %. Laissez tomber quelques gouttes sur la zone d'observation et absorbez l'excès. Maintenant, juste en dessous de la fenêtre, utilisez une aiguille de calibre 25 munie d'un coude à 90 degrés pour créer une poche profonde dans la fascia, capable de contenir un millimètre cube de tissu tumoral.

Insérez ensuite le tissu tumoral dans la poche. Enfin, fermez la zone d'observation à l'aide d'un couvre-objet standard de 12 millimètres et d'un anneau de maintien. Toutes les bulles d'air disparaîtront en moins d'une heure.

Avant de séder la souris, préchauffez une plateforme personnalisée contrôlée en température à 37 degrés Celsius. Après avoir sédaté la souris, placez-la sur la plateforme chauffée. Fixez un embout nasal pour délivrer de l'isoflurane et, si l'évaluation dure plus de cinq minutes, appliquez un produit ophtalmique.

Maintenant, fixez la chambre à l’aide des boulons de la fenêtre sur un support sur mesure et arrimez le support à la plateforme. Ensuite, nettoyez la fenêtre en verre avec de l’eau et du coton. Puis, au microscope, vérifiez le développement des vaisseaux dans la tumeur à l’aide de l’objectif 10 fois, en lumière blanche et en lumière fluorescente.

Après l'examen macroscopique, allumez les lasers confocaux. Réglez le panneau de contrôle du microscope sur un gain intelligent de 100 volts par tour. Un décalage intelligent de 10 % par tour, un zoom moyen, un positionnement moyen en X et Y, et 100 micromètres de position en Z par tour.

Définissez le mode d'acquisition sur XYZ ou XYZT. Sélectionnez une résolution. Choisissez une vitesse d'acquisition de deux ou 400 hertz.

Réglez le diaphragme sur une unité airy. Et sélectionnez l'option X bidirectionnelle. Lors de l'évaluation de plusieurs fluorophores possédant une plage spectrale potentiellement superposée, sélectionnez la numérisation séquentielle entre les images afin d'éviter les interférences et configurez les trajets de faisceau corrects.

Paramétrez la moyenne de ligne à quatre, puis sélectionnez enfin un nouveau jeu de données pour l'expérience. À présent, concentrez-vous sur le tissu d'intérêt ; pour ce faire, il est préférable d'utiliser des objectifs à sec ayant des ouvertures numériques plus élevées. Ensuite, utilisez la numérisation rapide en direct pour obtenir le meilleur rapport signal sur bruit possible en ajustant le gain et le décalage de manière à éviter toute surexposition.

Maintenant, sélectionnez la pile Z dans l'onglet d'acquisition. Effectuez un balayage Z rapide. À partir de ce balayage rapide, déterminez les positions initiale et finale du balayage complet.

Ensuite, réglez la taille du pas Z en fonction de la taille du diaphragme et procédez à l'analyse complète. Les souris hôtes exprimant des marqueurs fluorescents ont été imagées après l'implantation de la tumeur en utilisant le protocole décrit. Le marqueur eNOStag-GFP s'exprime dans le Golgi et la membrane cellulaire des cellules endothéliales.

Le marqueur ROSAmT/mG exprime une fluorescence rouge de manière ubiquitaire et une fluorescence verte dans les cellules exprimant la recombinase Cre. Une application de cette technologie concerne l'étude du développement des vaisseaux, car toutes les étapes sont observables dans les tumeurs. Par exemple, on peut observer des fronts endothéliaux en train de bourgeonner vers des zones non vascularisées.

Les tumeurs possèdent également des vaisseaux endommagés et des lits vasculaires établis avec des vaisseaux ramifiés matures. Une autre application consiste à étudier la formation de la lumière, le flux sanguin et l'extravasation en appliquant des marqueurs au sang, tels que des nanoparticules fluorescentes. Ainsi, le flux sanguin peut être observé dans la lumière des tubes vasculaires et à proximité des cellules endothéliales de bout.

Dans les cellules apicales, la formation d'un lumen au sein de l'élément de stockage est observable. La microscopie intravitale peut également être utilisée pour étudier l'effet d'agents chimiothérapeutiques. Par exemple, 24 heures après l'injection de nanoparticules chez un animal eNOStag-GFP, les nanoparticules sont restées dans la vascularisation avec une extravasation minimale vers l'interstitium tumoral.

Cependant, lorsque les nanoparticules ont été administrées en association avec le TNF, une extravasation a été observée dans l'interstitium tumoral. Cela constitue une preuve d'une augmentation de la distribution intratumorale du médicament. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment installer une chambre d'observation cutanée dorsale et comment étudier les processus liés à la tumeur à l'aide de la microscopie confocale.