Chargement d'un colorant de calcium dans les terminaisons nerveuses de la grenouille à travers le souche nerveuse: Inscription transitoire de calcium dans la jonction neuromusculaire de la grenouille

Bonjour, je m’appelle Dimitry Samigullin, je travaille dans le laboratoire de biophysique des processus synaptiques de l’Institut de biochimie et de biophysique de Kazan, de l’Académie russe des sciences. Dans notre laboratoire, nous étudions de vastes voies de signalisation calcique dans la jonction neuromusculaire. L’une des méthodes les plus accessibles pour mesurer le niveau synaptique de calcium est l’enregistrement optique.

Nous décrivons ici la méthode de chargement d’un colorant sensible au calcium, à travers un moignon nerveux, dans les terminaisons nerveuses de la grenouille. Nous présentons également le protocole de mesure et d’analyse d’un vaste transitoire calcique dans les terminaux de grenouilles. En utilisant cette méthode, il est possible d’étudier l’influence des médicaments actifs sur le niveau présynaptique du calcium pendant l’activité synaptique.

Préparation de la solution de chargement du colorant. Le colorant calcique Oregon Green BAPTA de fluorescéine se présente sous la forme de 500 microlitres via une petite quantité de 500 microgrammes de poudre. Ajoutez 14 microlitres de solution, contenant HEPES, à la poudre.

Solution de chargement vortex, et tournez vers le bas pour bien mélanger. Enveloppez le flacon avec la solution de chargement avec du papier d’aluminium, pour éviter l’exposition à la lumière. Conservez la solution de chargement à moins 20 degrés Celsius, dans un congélateur.

Procédure de chargement du colorant. Disséquez un muscle cutané du pectoris de l’animal. Monture du tissu disséqué dans une boîte de Pétri doublée d’argent.

Étirez le tissu avec de fines épingles en acier inoxydable. Ajoutez la solution de Ringer à la boîte de Pétri. À l’aide d’une lame de rasoir, coupez un petit morceau, environ 2 millimètres du tube de pipette de dix microlitres à partir de l’extrémité fine.

Préparez un morceau de pâte à modeler pour tenir la pipette de remplissage sur la boîte de Pétri. Connectez la pipette de remplissage à une seringue en plastique à travers un tube en silicone et des adaptateurs en tubes de pipette. Retirer la solution temporaire de Ringer de la boîte de Pétri à l’aide d’une pipette en plastique.

Préparation sèche à la seringue. Cela évitera l’aspiration de la solution dans la pipette de remplissage. Sortez le flacon avec la solution de chargement du congélateur et laissez-le décongeler à température ambiante dans un endroit sombre.

Avec une pince à épiler fine et des ciseaux, sous contrôle visuel, avec un microscope stérile, coupez le nerf près du muscle. Laissez environ deux millimètres de moignon nerveux. Fixez la pipette de remplissage à l’aide d’un tube et de la seringue sur la boîte de Pétri à l’aide de pâte à modeler.

Déplacez-le près de la branche nerveuse. Aspirez doucement le moignon nerveux dans la pipette de remplissage. Retirez le tube d’aspiration de l’extrémité émoussée de la pipette de remplissage.

Séchez le moignon nerveux dans la pipette de remplissage à l’aide de la seringue. Remontez la pipette de remplissage avec le moignon nerveux. Isolez le moignon nerveux de l’extérieur avec de la vaseline.

Une fois de plus, séchez le moignon nerveux dans la pipette de remplissage à l’aide de la seringue. Prélevez les cinq microlitres de solution de chargement à l’aide d’une pipette avec une longue pointe de pipette. Insérez délicatement la pointe de la pipette avec la solution de chargement dans la pipette de remplissage.

Éjectez le mélange directement sur le moignon nerveux. Sceller l’extrémité ouverte de la pipette de remplissage à l’aide de vaseline. Ajoutez une petite quantité de solution dans la boîte de Pétri.

Incuber la préparation à température ambiante dans un endroit sombre et humide pendant cinq heures. Après la procédure d’incubation, prenez la préparation et retirez la pipette de remplissage avec la solution de chargement. Placez la préparation dans un bain et lavez-la avec la solution de Ringer.

Conservez le bain avec la préparation toute la nuit dans un réfrigérateur à une température de huit degrés Celsius. Préparez le tissu pour la microscopie. Prenez la préparation du bain.

Montez la préparation dans une chambre doublée d’argent et étirez légèrement le tissu. Rincez le mouchoir avec une solution fraîche de Ringer. Prenez l’électrode de stimulation par aspiration.

Placez l’électrode d’aspiration de stimulation dans la chambre avec son extrémité proche de l’extrémité coupée du nerf. Tirez le nerf vers l’électrode. La construction de l’électrode est décrite dans l’article de Khazokoff, un lien vers l’article se trouve dans les matériaux.

Fixez la chambre de préparation sur la platine du microscope. Placez la sonde de température. Connectez les tubes d’entrée dans un cordon d’alimentation pour l’élément Peltier dans la chambre de préparation.

Placez le tube de sortie dans la chambre de préparation. Allumez une pompe de perfusion. Activez le terme unité de contrôle.

Réglez la température sur l’unité de contrôle pour qu’elle atteigne 20 degrés Celsius. Installez un bouclier de protection contre les ultraviolets. Configurez la durée du délai et la période sur le stimulateur.

Connectez un fil de l’électrode d’aspiration au stimulateur. Allumez-le. Sous un objectif à faible grossissement, vérifiez la contraction musculaire en activant le stimulus.

Remplissez le système de perfusion avec une solution de Ringer à faible teneur en calcium et à haute teneur en magnésium. Réglez le taux de perfusion d’environ deux millilitres par minute. Remplacez l’objectif par un grossissement de 40 fois.

Allumez le V polychrome. Sélectionnez la longueur d’onde d’émission et l’éclairage en mode continu. Ouvrez l’obturateur. Sous un grossissement d’objectif de 40 fois, les éclairages en mode fluorescence assurent que les terminaux sont chargés.

Trouvez le terminal et concentrez-vous dessus. Le nerf chargé et les terminaisons nerveuses motrices bien chargées sont représentés sur la figure. Capture vidéo avec caméra CCD Neuro Red-Short.

Exécutez le logiciel Turbo-SM. Sélectionnez Modifier les paramètres. Le nombre d’images d’entrée est de 500.

Entrez le nom de l’expérience. La configuration de base est de 1000 images par seconde. 80 par 80.

Choisissez le déclencheur externe. Entrez le temps de pré-déclenchement. Moins dix millisecondes.

Entrez le nombre de répétitions, 20. Dans le logiciel Polychrome, sélectionnez le mode d’éclairage à déclenchement externe. Exécutez le logiciel Clampex.

Protocole de stimulation de charge. Le protocole peut être téléchargé à partir de la page de notre laboratoire sur le site Web de l’Université fédérale de Kazan. Avant l’enregistrement, capturez une image sombre dans le logiciel Turbo-SM.

Sur le cube trinoculaire, sélectionnez les niveaux d’échange de chemin lumineux. 100 % pour l’appareil photo. Exécutez le protocole de stimulation.

Sélectionnez la région d’intérêt et vérifiez le signal. En réponse à la stimulation nerveuse, nous enregistrons le changement d’intensité de fluorescence qui reflète l’entrée du calcium dans la terminaison nerveuse. Analyse des données.

Dans le logiciel Turbo-SM, sélectionnez fichier. Ensuite, sélectionnez, faites la moyenne des fichiers. Sélectionnez les fichiers.

Entrez le nom du fichier moyen et faites la moyenne de ceux-ci. Enregistrez le fichier moyen en tant que fichier d’ajustement. Sélectionnez, enregistrez en tant que fichier d’ajustement.

Entrez le nom du fichier et enregistrez-le. Exécutez l’image J et ouvrez les instruments ci-dessous. Analyse, outils, ROI Manager.

Trouvez un fichier moyen enregistré au format Fit. Faites-le glisser et déposez-le sur l’image J.Zoomez sur la fenêtre pour une meilleure vue. Sélectionnez une région rectangulaire d’intérêt sur ce que vous pensez être l’arrière-plan.

Ajoutez-le au gestionnaire de retour sur investissement. Dans le gestionnaire de retour sur investissement, sélectionnez plus. Multi-mesures. Charger vers le bas signifie.

Copiez les données, exportez-les vers Excel. Dans Excel, utilisez la fonction moyenne pour calculer la valeur moyenne de l’arrière-plan pour un ratio. Sans fermer Excel, revenir à l’image J.Fermez la fenêtre avec calcul en arrière-plan sans sauvegarder.

Utilisez le gestionnaire de retour sur investissement, supprimez le dessin d’arrière-plan rectangulaire. Ouvrir le processus d’instrument, calculer, soustraire. Entrez la valeur moyenne calculée du seuil à partir d’Excel et soustrayez le sol des piles.

Sélectionnez une région rectangulaire d’intérêt autour d’une terminaison nerveuse. Ajoutez-le au gestionnaire de retour sur investissement. Dans le Gestionnaire de retour sur investissement, sélectionnez plus, Multi-mesure, Chargez, Moyennez.

Copiez et collez dans la fenêtre Excel. Utilisez le graphique de tracé d’instrument Excel. Sélectionnez une zone plane avant de démarrer le signal.

Chargez le graphique avec les détails depuis les premières valeurs de fluorescence au reste, jusqu’au début du signal. Déterminez ensuite le nombre de points pour faire la moyenne des valeurs de fluorescence au repos. Faites la moyenne de ces valeurs, puis trouvez le nombre moyen de fluorescence au reste.

Divisez les signaux par fluorescence au reste. Soustrayez un et multipliez par 100 pour cent. Tracez le signal et calculez l’amplitude du transitoire calcique.

Les paramètres temporels des signaux de fluorescence dépendent de la vitesse des réactions directe et/ou inverse de la formation du complexe calcium-colorant. Le temps de montée du signal calcique représente la dynamique de l’apport de calcium. C’est la diffusion dans le terminal et l’interaction du calcium avec le colorant.

La décomposition du calcium transitoire dépend de l’affinité du colorant et du taux de tamponnage du calcium et de son retrait. L’analyse de l’amplitude transitoire du calcium peut être utilisée pour étudier l’influence de différentes substances actives sur l’entrée du calcium qui participent à la libération de neurotransmetteurs. Cette technique de charge est bien adaptée à l’imagerie des modifications du calcium cytosomal.

Avec des indicateurs fluorescents et la stimulation nerveuse unique et l’activité synaptique rythmique. L’analyse de l’amplitude transitoire du calcium peut être utilisée pour étudier l’influence de différentes substances sur l’entrée du calcium qui participe à la libération de neurotransmetteurs. Il y a quelques points importants auxquels nous voulons prêter attention.

La procédure d’incubation comprend deux étapes. Incubation à température ambiante et dans un réfrigérateur. Il est important de contrôler le temps d’incubation avec le colorant à température ambiante.

En fonction de la longueur du moignon nerveux, du colorant et de la température de la pièce, le temps d’incubation peut varier. Si vous surexposez les terminaisons de pré-opération et les parties proximales, proches du moignon nerveux, peuvent être surchargées. En raison de la longue incubation dans le réfrigérateur, le colorant est uniformément réparti le long des terminaisons nerveuses.

Il est essentiel de placer le nerf dans la solution de chargement du colorant, quelques minutes après la coupe, pour permettre au colorant de pénétrer dans le nerf, car des intervalles de temps plus longs ont produit une charge inefficace, probablement en raison de la réception d’un nerf fermé. Pour réduire la compartimentation du colorant, il est possible d’utiliser la forme étendue du colorant. Il est très important d’éviter la longue lumière fluorescente du tissu car elle affecte sa survie.

Nous utilisons l’optique Nomarski dans le canal de la lumière visible pour rechercher les bornes. Pendant l’enregistrement, on limite la vue éclairée, par le diaphragme. La longue durée du processus de chargement peut être réduite à l’aide d’un tampon d’obturateur du nerf.

Dans ce cas, un micro-bypass en verre peut être utilisé.