Production et administration de la thérapeutique mésenchymateuses souches / cellules stromales (MSC) Spheroids apprêté dans les cultures 3-D dans des conditions d'Xeno-libres

L'objectif général de ces expériences est de produire efficacement et d'injecter des agrégats sphériques thérapeutiques, ou sphéroïdes, de cellules souches mésenchymateuses/stromales, ou MSC, préparées dans des conditions sans composants d'origine animale, pour des applications expérimentales et cliniques. Ces méthodes peuvent aider à surmonter les principaux obstacles dans le domaine des thérapies par MSC, tels qu'une faible rétention cellulaire, une survie insuffisante et une fonctionnalité altérée, souvent observés après la transplantation de cellules dispersées et dans des conditions défavorables fréquemment associées aux lésions tissulaires.

Le principal avantage de ces procédures est que les sphéroïdes de MSC peuvent être préparés, conditionnés et injectés en l'absence de produits animaux immunogènes, tels que le SFB, ce qui limite actuellement certaines applications cliniques des cellules et peut également fausser l'interprétation de certaines données précliniques. Bien que ce mécanisme puisse être très bénéfique pour médier l'efficacité basée sur les MSC, il peut également servir à comprendre la réparation tissulaire médiée par les MSC ainsi que la manière dont d'autres formulations de milieux peuvent modifier le génome thérapeutique plus. La démonstration de ces procédures sera effectuée par Josh Beaver et Bret Clough, deux techniciens de mon laboratoire.

Après avoir semé et incubé les cellules souches mésenchymateuses selon le protocole indiqué dans le texte, utilisez une solution de trypsine et d'EDTA pour récolter les cellules, puis centrifugez-les à 450 × g. Rassemblez toutes les cellules dans un seul tube conique contenant le milieu approprié. Centrifugez les cellules et remettez en suspension le culot dans un petit volume de milieu. Ensuite, après avoir dénombré les cellules, diluez les CSM récoltées dans l'un des milieux suivants à raison de 714 cellules par microlitre afin d'obtenir des sphéroïdes d'environ 25 000 cellules.

Ensuite, déposez à l’aide d’une pipette des gouttes de 35 microlitres de cellules sur la face inférieure du couvercle d’une boîte de culture inversée de 150 millimètres. Transférez 20 millilitres de PBS à température ambiante dans le fond de la boîte, puis, d’un mouvement continu et régulier, retournez le couvercle contenant les gouttes afin que les sommets des gouttes soient orientés vers le bas. Placez ensuite délicatement le couvercle sur le fond de la boîte de culture.

Transférez la boîte au incubateur pendant trois jours sans la perturber afin de permettre un assemblage adéquat des sphères. Après l'incubation, commencez la récolte des sphéroïdes en retirant soigneusement le couvercle et en l'inversant de manière à ce que les gouttes soient à nouveau orientées vers le haut. Inclinez ensuite le couvercle d'environ 10 à 20 degrés et utilisez un extracteur de cellules pour pousser les gouttes contenant les sphéroïdes vers le bord de la plaque.

À l’aide d’une pipette de un millilitre, transférez le milieu de la sphère dans un tube conique de 15 millilitres et utilisez du PBS à température ambiante ainsi que la même pointe de pipette pour laver la plaque afin d’assurer une récupération maximale des sphéroïdes. Pour les tests de PCR en temps réel, centrifugez la suspension de sphères à 450 ×g à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, aspirez le surnageant.

Avec du PBS, lavez les sphéroïdes et répétez les deux étapes de centrifugation et d'aspiration. Pour la livraison chez les animaux, laissez les sphères se déposer au fond du tube sans centrifugation. Pour recueillir le milieu conditionné, ou milieu CM, destiné à des tests d'évaluation du potentiel immunomodulateur et anti-cancéreux, utilisez un grattoir à cellules et une pipette comme vient de l'être démontré, puis récoltez les sphéroïdes et le milieu CM dans un tube conique de 15 millilitres.

Cependant, ne lavez pas les couvercles avec du PBS. Après une centrifugation à 450 × g pendant 5 à 10 minutes, transférez le surnageant dans des tubes de 1,5 millilitre. Centrifugez le surnageant à 10 000 × g et à température ambiante pendant 5 à 10 minutes.

Ensuite, utilisez une pipette pour prélever soigneusement le surnageant clarifié et le transférer dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre destinés à être stockés à moins 80 degrés Celsius. Après avoir préparé les sphéroïdes comme vient de l'être démontré dans cette vidéo et attendu trois à quatre minutes pour qu'ils sédimentent au fond du tube, aspirez le surnageant et lavez les sphéroïdes en ajoutant du HBSS supplémenté avec 0,2 à 0,5 % d'HSA afin de maintenir des conditions sans composants xénogènes. Ensuite, aspirez le surnageant.

Recouvrir les sphéroïdes de 100 à 200 microlitres de HBSS/HSA stérile et placer les tubes sur de la glace. Après avoir anesthésié une souris selon le protocole décrit, placer l'animal dans l'enceinte BSL-2, le dos vers le bas, puis désinfecter l'abdomen inférieur de la souris à l'aide d'éthanol à 70 %. Retirer le bouchon d'un cathéter intraveineux de 20 gauge et, tout en tenant la peau de la souris d'une main, localiser le milieu d'une ligne imaginaire reliant l'articulation du genou fléchie et la région génitale ; avec la pointe de l'aiguille de l'ensemble stylet-cathéter orientée vers la ligne médiane, utiliser l'autre main pour effectuer une injection intrapéritonéale.

Retirer délicatement l'aiguille métallique du dispositif d'aiguille du cathéter. Vérifier la présence de sang, d'urine ou de matières fécales sur l'aiguille et la jeter. Confirmer le positionnement correct du cathéter en plastique en insérant une pointe de pipette de 100 à 200 microlitres contenant 100 microlitres de HBSS/HSA stérile dans l'adaptateur de seringue du cathéter, en formant un joint étanche.

Ensuite, injectez lentement le liquide à l'intérieur de la cavité péritonéale. À l'aide d'une pipette de 100 à 200 microlitres, prélève les sphéroïdes MSA ainsi que le HBSS/HSA et transfère l'ensemble du volume dans la cavité péritonéale à travers le cathéter, comme vient de l'être démontré. Ensuite, rince le tube contenant les sphéroïdes avec 100 microlitres de HBSS/HSA et transfère l'intégralité du volume de sphéroïdes dans la cavité péritonéale.

Placer un tampon de gaze imbibé d'antiseptique sur le cathéter et retirer lentement le cathéter de la cavité péritonéale, puis le jeter. Examiner le cathéter pour détecter la présence éventuelle de sphéroïdes résiduels. Ensuite, masser doucement la cavité péritonéale avec les doigts afin de garantir une répartition uniforme des sphéroïdes.

Immédiatement après l'administration des sphéroïdes chez les souris, évaluer le niveau d'activation des sphéroïdes préparés pour les injections en transférant de 40 à 120 sphères dans un cathéter placé dans une plaque de 12 ou 6 puits contenant un à deux millilitres d'Alpha MEM supplémenté avec 2 % de FBS et un volume équivalent de pénicilline-streptomycine. Six heures plus tard, transférer le milieu des puits dans des tubes de 1,5 ou 15 millilitres et centrifuger les tubes à 450 × g à température ambiante pendant cinq minutes. Enfin, transférer le surnageant clarifié dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre et utiliser un kit ELISA commercial selon le protocole fourni pour doser la concentration de PGE-2.

Comme on le voit ici, lorsque environ 25 000 CSM sont en suspension dans des gouttes de 35 microlitres de CCM, les cellules s'assemblent d'abord en petits agrégats, puis finissent par se coalescer pour former une sphère unique et compacte au sommet de la goutte après 72 heures. Cette figure montre que la formation de sphères uniques et compactes et de XFM-1 nécessite un supplément de 13 milligrammes par millilitre d'HSA, une concentration qui reflète la teneur totale estimée en protéines dans le CCM. Lors de l'assemblage des sphères, le phénotype des CSM change radicalement et, lorsqu'elles sont cultivées dans un milieu chimiquement défini et sans composant d'origine animale, l'expression de nombreux facteurs anti-inflammatoires, notamment le PGE2 et le TSG6, est augmentée.

Cependant, la production de TSG6 et de PGE2 n'est pas nettement augmentée dans les CSM cultivées sous forme de sphéroïdes dans le XFM-2 ou le XFM-1 sans HSA. Enfin, de manière similaire aux effets in vitro, les sphéroïdes XFM-1 HSA injectés dans la cavité péritonéale de souris immédiatement après l'induction d'une inflammation systémique par administration intraveineuse de LPS ont accru les taux de PGE2 et d'IL-10 dans le péritoine tout en réduisant le taux de TNF alpha pro-inflammatoire. Une fois maîtrisée, chaque plaque de gouttes suspendues peut être préparée en une à deux minutes.

Et l'administration intrapéritonéale de sphéroïdes intacts peut être réalisée en 5 à 10 minutes par animal lorsqu'elle est effectuée correctement. Lors de la production de sphéroïdes de CSM par la technique de la goutte pendante, il est important de garder à l'esprit que différentes formulations de milieux sans xénogène ne sont pas équivalentes en ce qui concerne la formation des sphères et l'augmentation de l'expression des gènes thérapeutiques. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme la microscopie confocale, peuvent être utilisées pour comprendre l'organisation des CSM dans les sphéroïdes ainsi que les voies de signalisation supplémentaires qui pourraient être activées dans les CSM situées dans différentes régions du sphéroïde.

Après ce développement, cette méthode a permis aux scientifiques travaillant sur les CSM d'étudier d'autres conditions de culture en 3D et leur impact sur l'amorçage des CSM et l'expression des gènes thérapeutiques. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment amorcer les CSM sous forme de sphéroïdes à l'aide de la technique de la goutte pendante, comment évaluer leur efficacité thérapeutique in vitro, et comment délivrer efficacement des sphéroïdes intacts chez la souris pour des tests d'efficacité in vivo. Et n'oubliez pas que le travail avec des cellules souches humaines adultes nécessite un équipement et une formation spécifiques, et peut présenter des risques si les cellules ne sont pas manipulées correctement.

Une EPI appropriée doit être portée en tout temps lors de la manipulation de cellules souches humaines adultes.