Name: Quantification des bactéries histidine Kinase autophosphorylation utilisant un dosage nitrocellulose Reliure (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Découvrez une méthode optimisée de dosage sur membrane de nitrocellulose pour quantifier l'autophosphorylation des histidine kinases bactériennes. Cette technique haut débit permet de détecter des picomoles de phosphohistidine.

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Ce travail a été soutenu par le ministère de l&#39;éducation par l&#39;aide d&#39;études supérieures en zones de programme national de Need (P200A100044).

Attention: Ce protocole nécessite une formation appropriée dans l&#39;utilisation et la manipulation de matières radioactives. S&#39;il vous plaît utiliser l&#39;équipement de protection individuelle nécessaire en effectuant ce test, y compris protection contre les rayonnements bêta. Les déchets radioactifs doivent être manipulés avec précaution, car de grandes quantités de déchets sont générés au cours de la phase de lavage de l&#39;expérience. Assurez-vous que les déchets sont stockés dans un récipient en position verticale, comme un grand seau ou une bouteille qui ne sera pas facilement renversé ou renversé. Une fois que l&#39;expérience est terminée, transférer soigneusement tous les déchets liquides marqués de manière appropriée les conteneurs de déchets radioactifs. Manipuler tous les matériaux avec soin, et de garder un compteur Geiger à proximité pour surveiller l&#39;espace de travail pour la contamination. NOTE: Ce protocole est une version révisée d&#39;un essai précédemment de notre groupe. 15 phosphohistidine stabilité en H 3 PO 4 doit être testé pour toute histidine kinase non caractérisés avant d&#39;utiliser cette méthode. Le phosphohistidine sttest d&#39;aptitude a été décrit précédemment. 15 Un témoin négatif qui ne contient pas kinase doit être inclus. Ceci est nécessaire afin de soustraire le signal de fond de chaque échantillon, et veiller à ce que [γ- 32 P] -ATP est suffisamment lavé de la membrane. 1. Préparation des réactifs et des matériaux <ol><li> Purifier histidine kinases de la culture bactérienne avant d&#39;utiliser ce test. <ol><li> Purifier une histidine kinase (ID du gène 1189383) à partir de Vibrio parahaemolyticus (EB101, ATCC 17802) pour le développement de ce test. Cloner la kinase dans le vecteur d&#39;expression pET-23aHis-TEV utilisant Ndel et sites de restriction Xhol, et effectuer une mutagenèse dirigée pour obtenir le mutant construire Vp1876 D499A. </li><li> Transformer le plasmide dans E. coli BL21 (DE3) pLysS, et cultiver des cellules dans les milieux de la tuberculose à 37 ° C. des cultures de supplément avec de l&#39;ampicilline (100 pg / ml) et au chloramphenicol (34 ug / ml) et en agitant croître(250 rpm) jusqu&#39;à une DO600 de 0,6. </li><li> Induire l&#39;expression de la protéine avec de l&#39;IPTG à une concentration finale de 25 uM, et faire croître les cultures pendant une nuit à 16 ° C. Récolte des cellules par centrifugation (5000 xg), lyse par sonication, et centrifuger pour éliminer les débris cellulaires (18.000 xg). </li><li> Purifier la kinase marquée par His en utilisant Ni-NTA agarose. Confirmer la pureté par SDS-PAGE. Optimiser la purification pour chaque protéine, et de confirmer la pureté avant d&#39;utiliser ce test. </li></ol></li><li> Préparer le mM H 3 PO 4 solution 25 de lavage. À 1 litre d&#39;eau déminéralisée distillée, ajouter H 3 PO 4 à une concentration finale de 25 mM. Le pH de cette solution est d&#39;environ 2,0. Placer 25 mM H 3 PO 4 sur la glace. </li><li> Préparer une solution 13x mère de 325 mM H 3 PO 4, à utiliser pour éteindre la réaction de kinase. Le pH de cette solution est d&#39;environ 1,5. Placer 325 mM H 3 PO 4 sur la glace. NOTE: H 3 PO 4 </sub&gt; À une concentration finale de 25 mM suffisamment étanche la réaction, et contribue également à bloquer le phosphate radiomarqué qui ne soit pas lié à l&#39;histidine de se lier à la membrane de nitrocellulose. </li><li> Préparer une solution tampon de réaction du stock 4x contenant 160 mM Tris-HCl pH 8,0, KCl 600, 16 mM MgCl 2, et 40% de glycérol. </li><li> Quantifier la concentration d&#39; histidine kinase de la protéine par des procédés établis de concentration (Bradford, UV-Vis, etc.). Préparer une solution à 16,17 histidine kinase ayant une concentration qui est de 4 fois la concentration finale souhaitée. Pour obtenir un signal adéquat, la concentration finale en protéine dans la réaction devrait idéalement être d&#39;au moins 5 um. </li><li> Préparer une radiomarqué 4x [γ- 32 P] -ATP solution avec la concentration de 4x appropriée d&#39;ATP non marqué et marqué ratio non marqué pour l&#39;expérience. NOTE: La quantité de [γ- 32 P] -ATP qui devrait être inclus dans ce mélange dépend de combien [^7; - 32 P] -ATP sera finalement repéré pour chaque réaction. Nous avons obtenu signal adéquat avec des concentrations finales comprises entre 0,1 à 5 uCi par réaction. Il est important que le marqué: le rapport de l&#39;ATP non marqué est maintenu constant pour toutes les réactions dans une expérience donnée. Des dilutions en série doivent être effectuées lorsque les concentrations d&#39;ATP multiples sont souhaitées, comme cela bien garder le étiqueté: rapport constant de l&#39;ATP non marqué dans toutes les concentrations. Les concentrations finales de l&#39;ATP sont généralement comprises entre 10 uM à au moins 1 mM, et chaque concentration doivent être dosés en triple pour obtenir des données cinétiques fiables. </li><li> 96- appareil bien dot blot <ol><li> Couper 8 cm x 12 cm morceau de membrane de nitrocellulose (taille des pores 0,2 um). </li><li> La position de la nitrocellulose dans un appareil de transfert en point, en veillant à ce que la membrane correspond de telle sorte que l&#39;appareil est fermé, et tous les puits sont complètement recouverte par la membrane. Si le montage est correct, il devrait y avoir aucune fuite d&#39;air lorsque le vide est applied. </li><li> Pour recueillir le filtrat, connectez l&#39;appareil à un ballon côté-bras secondaire. À partir de la tige de valve, raccorder un tube adéquat de sorte que l&#39;appareil peut être facilement utilisé sans faire basculer le flacon secondaire. </li><li> Connecter le secondaire flacon bras latéral à la source aspiration / dépression. </li><li> Vérifier que le dispositif est complètement scellé par application d&#39;un vide à l&#39;appareil. Si l&#39;appareil est correctement assemblé, un vide fort sera présent dans tous les puits. Toutes les connexions de tubes peuvent être enveloppés dans Parafilm ou SARAN pour assurer un joint étanche. </li><li> Le cas échéant, pour tester le vide, la pipette 100 ul de tampon de réaction dans un puits. Le vide doit être assez fort pour tirer tout le liquide à travers le puits et sur la membrane. </li><li> Éteignez vide jusqu&#39;à ce que tous les échantillons sont prêts à être repéré sur la membrane. </li></ol></li></ol> 2. Réaction Initiation et Trempe <ol><li> Le mélange des composants de la réaction <ol><li> Avant initiation, préparer tous les quatre composants de la réaction sous forme de solutions de stock 4x: tampon de réaction (voir section 1.4), l&#39; histidine kinase (1,5), [γ- 32 P] -ATP (1.6), et ddH 2 O. </li><li> Mélanger des volumes égaux de tampon de réaction, de l&#39; histidine kinase, et ddH 2 O. Laisser ces composants de réaction pour équilibrer à la température ambiante pendant une courte durée (10 minutes). Remarque: Le volume final de la réaction dépend du fait que l&#39;expérience est dépendante du temps, une enzyme dépendante, ou d&#39;un substrat dépendant. réactions dépendantes du temps doivent être plus grands, comme plusieurs aliquotes sont prises à partir de la même réaction et trempés au point de temps désiré. Le volume réactionnel dépendra du nombre de points temporels désirés. L&#39;essai est optimisé pour chaque tache sur la membrane de nitrocellulose pour contenir 30 ul de la réaction. Ainsi, si 10 points de temps sont souhaités, le volume de réaction doit être d&#39;au moins 300 pi (volume plus élevé tel que 330 ul serait préférable dans le cas d&#39;éventuelles erreurs de pipetage).Enzymes et des expériences de substrat dépendant nécessitent des volumes réactionnels plus petits. Le volume de réaction pour ces expériences peuvent être aussi petites que 30 pi, comme cela est le volume final qui sera repéré sur la membrane de nitrocellulose. </li><li> Pour amorcer la réaction, ajouter un volume de solution [γ- 32 P] -ATP à la réaction et mélanger par pipetage de haut en bas. Suivre le temps de réaction écoulé avec une minuterie et laisser la réaction se dérouler pendant le temps désiré. </li><li> Pour étancher la réaction, on ajoute 1/13 du volume réactionnel total de glacé 325 mM de H 3 PO 4 à la réaction et mélanger par pipetage vers le haut et vers le bas. En variante, ajouter une aliquote de la réaction à 325 mM de H 3 PO 4. NOTE: La concentration finale de H 3 PO 4 devrait être de 25 mM pour étancher suffisamment la réaction. Par exemple, ajouter 2,5 ul de 325 mM de H 3 PO 4 à 30 ul de réaction ou d&#39; ajouter 30 uL réaction à 2,5 mM , 325 ul de H 3 PO &lt;sub&gt; 4. Le pH final de la réaction est d&#39;environ 4,0. Cette concentration de H 3 PO 4 a été testé et confirmé pour arrêter la réaction de kinase dans ce tampon sans dégrader phosphohistidine. <ol><li> Par exemple, mélanger 7,5 pi 4x tampon de réaction, 7,5 pi 4x histidine kinase, et 7,5 ul ddH 2 O. Initier réaction avec 7,5 pl [γ- 32 P] -ATP. Stopper la réaction avec 2,5 ul de 325 mM de H 3 PO 4. </li></ol></li><li> Placer immédiatement les réactions trempées sur la glace jusqu&#39;à ce que toutes les réactions ont été terminées. NOTE: Afin de maximiser l&#39;efficacité, il est conseillé d&#39;initier une réaction toutes les 15 ou 20 s jusqu&#39;à ce que toutes les réactions sont initiées, et une fois le temps de réaction désiré est passé, étancher une réaction toutes les 15 ou 20 s jusqu&#39;à ce que tous sont trempés. Pour ceux qui utilisent le test pour la première fois, un intervalle plus long peut être plus facile à gérer. </li></ol></li></ol> 3. Spotting oRéactions f Désaltérée sur nitrocellulose <ol><li> Démarrez vide sur 96 puits appareil de dot blot <ol><li> Placez l&#39;appareil dot 96 puits pré-assemblé blot (section 1.7) dans un récipient secondaire. Ce récipient doit être suffisamment grand pour que l&#39;appareil se démonte facilement en, car l&#39;appareil et de la membrane seront radioactifs après leur utilisation. </li><li> Appliquer le vide à l&#39;appareil de transfert en point à 96 puits. </li><li> Une fois que l&#39;appareil est sous vide, pipeter avec soin la réaction trempée directement sur la membrane de nitrocellulose dans chaque puits. Répétez jusqu&#39;à ce que toutes les réactions sont chargées sur la membrane. Étant donné que la capacité de liaison de nitrocellulose (75-110 ug / cm2) est supérieure à la quantité d&#39;histidine kinase qui est repéré, on peut supposer que la quasi - totalité de la kinase se lie à la membrane lorsqu&#39;elle est chargée correctement. REMARQUE: Selon l&#39;appareil utilisé, il faut prendre soin de ne pas percer la nitrocellulose. Observer que la totalité de la réaction a pris contact avec ee nitrocellulose. Il est facile pour une partie ou la totalité de la réaction de coller aux parois du puits, et ne pas atteindre la nitrocellulose. </li><li> Laver les puits avec 100 pi de glace-froid 25 mM H 3 PO 4. Ceci permettra à un volume de réaction qui peut avoir été piégé dans le puits pour atteindre la membrane, assurant le chargement complet de toutes les réactions. Permettre à tout le volume de circuler à travers la membrane. </li></ol></li><li> Appareil de démontage et de transfert de membrane de nitrocellulose <ol><li> Démontez soigneusement l&#39;appareil avant de couper le vide. Noter que tant l&#39;appareil et de la membrane de nitrocellulose sont radioactifs à ce moment. Ne retirez pas les composants de l&#39;appareil à partir du conteneur secondaire en ce moment. </li><li> Avec une pince, transférer soigneusement la membrane de nitrocellulose de l&#39;appareil à un récipient d&#39;environ 200 ml de 25 mM refroidi à la glace H 3 PO 4. Placez un couvercle sur ce récipient, comme le lavage sera radioactive. A ce moment, le vide peut être coupée. </li></ol></li></ol> 4. nitrocellulose Processing <ol><li> nitrocellulose laver <ol><li> Placer le récipient avec la membrane de lavage sur une bascule. Laisser la membrane de basculer doucement pendant 20 min. </li><li> Après 20 minutes, décanter avec précaution la solution de lavage utilisée dans un grand seau à utiliser pour le stockage temporaire des déchets. Ajouter 200 ml de glace-froid 25 mM H 3 PO 4 à la membrane et répéter. REMARQUE: Au moins trois 20 lavages min sont nécessaires pour éliminer fond [γ- 32 P] -ATP signal de la membrane. Après le troisième lavage, tester la solution de lavage utilisée pour le rayonnement avec un compteur Geiger. Continuer le lavage de la membrane comme décrit ci-dessus jusqu&#39;à ce qu&#39;aucun signal est présent dans la solution de lavage. </li></ol></li><li> séchage de nitrocellulose <ol><li> Après la membrane est suffisamment lavé, permettre à la membrane à l&#39;air brièvement sec. Cela prend généralement 5 min ou moins.</li></ol></li></ol> 5. Exposition à l&#39;écran Storage Phosphor Remarque: Cette section est facultative. Exposer la membrane à un écran de phosphore est bénéfique en ce qu&#39;elle permet la visualisation de l&#39;intensité de la kinase radiomarqué dans chaque tache sur la membrane. L&#39;intensité relative de ces points est directement proportionnelle à la quantité d&#39;histidine kinase phosphorylée dans chaque champ. L&#39;intensité peut être quantifiée avec le logiciel de traitement d&#39;image, et ces résultats peuvent être comparés à ceux générés par l&#39;article 7. En outre, cette étape permet un contrôle de la qualité. Anomalies vu dans cette analyse pourrait expliquer les résultats irréguliers obtenus à partir de comptage à scintillation. <ol><li> préparation de l&#39;écran phosphorescent <ol><li> Avant d&#39;exposer la membrane à l&#39;écran luminophore de stockage, exposer l&#39;écran de substance fluorescente à la lumière blanche pendant au moins 5 min. Cela garantit que toute image résiduelle qui peut être détenu par l&#39;écran est effacé. </li><li> Assurez-vous que l&#39;écran est propreet sec. Si nécessaire, nettoyer délicatement l&#39;écran avec une solution de nettoyage de l&#39;écran de phosphore approuvé par le fabricant de l&#39;écran, et essuyez. </li></ol></li><li> Préparation de membrane en nitrocellulose <ol><li> envelopper soigneusement la membrane de nitrocellulose sèche dans une pellicule de plastique mince pour empêcher l&#39;humidité résiduelle d&#39;endommager l&#39;écran luminescent. Vérifiez qu&#39;il n&#39;y a pas de rides ou des bulles. </li></ol></li><li> L&#39;exposition à écran luminescent <ol><li> Placez la membrane de nitrocellulose enveloppé dans la cassette d&#39;écran luminescent de stockage, placez l&#39;écran face vers le bas sur la membrane, et fermer la cassette. Ne pas ouvrir la cassette ou de déplacer la membrane jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit temps de balayer l&#39;écran luminescent, comme déplacement de la membrane lors de l&#39;exposition entraînera une double image ou tachées d&#39;être capturé. </li><li> Exposer pendant au moins 4 h, ou aussi longtemps que le fabricant de l&#39;écran luminescent suggère. </li><li> Une fois l&#39;exposition terminée, balayer l&#39;écran de phosphore et de capturer l&#39;image avec un scanner de phosphore. </li></ol></li></ol> 6. Préparer membrane de nitrocellulose pour Scintillation Counting <ol><li> Ponceau S coloration et décoloration <ol><li> immerger brièvement la membrane de nitrocellulose dans une solution de coloration de Ponceau (0,1% de Ponceau S (p / v) dans 5% d&#39;acide acétique) pendant 1 - 2 min. Mouiller la totalité de la membrane avec la tache avant décoloration. </li><li> Décanter excès Ponceau S de la membrane. </li><li> Rincer la membrane avec ddH 2 O jusqu&#39;à ce que seuls les spots de l&#39;histidine kinase sont colorées. Notez que cette procédure ne fonctionnera que si tous les points contiennent des quantités détectables de protéine. REMARQUE: Cette étape est nécessaire pour confirmer que la kinase est lié à la nitrocellulose, et que la protéine de chargement est encore dans toutes les taches. Elle permet aussi la kinase repérée à découper facilement à partir de la membrane. </li></ol></li><li> Découper taches <ol><li> Avec des ciseaux, découper chaque tache sur la membrane de nitrocellulose. Il est pas nécessaire de couper parfaitement along le bord de la tache taché; si la membrane a été lavée suffisamment fond dû à la taille variable des taches découpées sera négligeable. Il est seulement important de découper l&#39;ensemble de tache pour chaque réaction. </li><li> En utilisant des pinces, transférer soigneusement chaque tache dans des flacons de scintillation. Aucun cocktail de scintillation est nécessaire que le 32 P est facilement détectable par le rayonnement Tcherenkov. NOTE: Sinon, l&#39;endroit peut être coupé à l&#39;aide d&#39;un perce-bouchon aiguisé. Retirer chaque spot de la nitrocellulose avec le perce-bouchon, et le pousser dans un flacon de scintillation avec une épingle. Avec ce procédé, la membrane n&#39;a pas besoin d&#39;être touché, ce qui réduit davantage l&#39;exposition aux rayonnements. </li></ol></li><li> Détermination de CPM / pmol de [γ- 32 P] -ATP solution <ol><li> Spot plusieurs dilutions de [γ- 32 P] -ATP solution (section 1.5) sur 1 cm x 1 cm carrés de nitrocellulose. En bref air sec. </li><li> En utilisant des pinces, transférer soigneusement chaque carré en scintillationflacons. Aucun cocktail de scintillation est nécessaire. Ces échantillons seront utilisés pour générer une courbe standard pour déterminer le CPM / pmol de la solution d&#39;ATP. </li></ol></li></ol> 7. Scintillation Counting <ol><li> Chargez tous les flacons de scintillation en scintillation contre cassettes. cassettes de charge dans un compteur à scintillation. </li><li> Exécutez le programme de comptage de scintillation pour mesurer CPM pour chaque flacon. Ces données, ainsi que le CPM / pmol du mélange ATP radiomarqué (de la section 6.3), peuvent être utilisés pour calculer la quantité de phosphorylée histidine kinase présent dans chaque point, et donc le taux d&#39;autophosphorylation. 18,19 </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

L&#39;essai de liaison nitrocellulose nous avons décrit présente de nombreux avantages par rapport aux méthodes précédemment utilisées pour caractériser histidine kinases. En comparaison avec SDS / autoradiographie traditionnel basé PAGE, notre méthode est un débit plus élevé et moins de temps. La membrane de nitrocellulose est plus facile à manipuler que des gels de SDS, et n&#39;a pas besoin d&#39;être réparé. Coloration Ponceau la nitrocellulose permet aux taches protéiques à visualiser. Cela fournit un moyen facile ...

réponse adaptative est cruciale pour la survie des bactéries. Afin de détecter et de réagir aux changements environnementaux, les bactéries utilisent un système stimulus-réponse connue sous le nom de signalisation à deux composants. 1,2 Dans un système à deux composants typique, l&#39;histidine kinase détecte un stimulus apparenté, autophosphoryle son résidu d&#39;histidine conservé, puis transfère le phosphate à un résidu aspartate conservé sur le domaine de récepteur d&#39;une protéine régulatrice de la réponse. 3 Cet événement déclenche un changement dans l&#39;activité du régulateur de réponse, ce qui stimule un effet en aval. 4,5 Ainsi, les bactéries sont capables de détecter et d&#39; adaptation aux changements dans l&#39;environnement local. Certains systèmes de signalisation à deux composants dévient de cet archétype. Dans certains cas, le domaine sensorielle de l&#39;histidine kinase est une protéine autonome qui détecte directement l&#39;entrée sensorielle et modifie l&#39;activité de la kinase par l&#39;intermédiaire d&#39;une interaction protéine-protéine. 6-8 Toutefois, le fondsprocessus amental et le rôle global du système reste le même. signalisation à deux composants est un système de stimulus-réponse ubiquitaire qui est essentielle pour la survie des bactéries et histidine kinases jouent un rôle critique dans la transduction du signal. 9 Malgré l&#39;importance des histidine kinases à la biologie bactérienne, ils restent mal caractérisés. Ceci est dû à l&#39;instabilité inhérente de phosphohistidine, et l&#39;absence d&#39;une méthode pratique pour la mesure de l&#39;autophosphorylation. Phosphohistidine est plus labile que la phosphosérine, la phosphothréonine et la phosphotyrosine. 10 Ainsi, les techniques qui sont couramment utilisés pour analyser kinases Ser / Thr / Tyr ne sont pas applicables pour les kinases histidine. 11 essais in vitro pour étudier histidine kinases ont été largement limitée à SDS-PAGE autoradiographie. 12,13 Dans ce procédé, [γ- 32 P] -ATP est mis en incubation avec la kinase et la phosphorylation de la kinase est analysée par Polélectrophorèse sur gel de yacrylamide (PAGE) suivie par une autoradiographie du gel. Cette méthode peut être utilisée pour surveiller l&#39;autophosphorylation de kinase, ainsi que phosphotransfert de la kinase à un régulateur de réponse. Cependant, cette méthode présente des inconvénients notables. des analyses basées sur PAGE-sont bas débit et de temps. Ces limitations ne sont pas propices à la caractérisation d&#39;une protéine et déterminer ses paramètres cinétiques. Une méthode alternative pour l&#39;étude des histidine kinases qui a été publié récemment, utilise des anticorps pour détecter phosphohistidine autophosphorylation. 14 Bien que cette méthode a l&#39;avantage de distinguer entre 1-phosphohistidine et 3-phosphohistidine, en fonction de l&#39;instrumentation utilisée pour la détection, cette méthode ne peut pas offrir une large gamme dynamique ou limite supérieure de détection élevé. Ainsi, il existe un besoin pour un test plus rapide, moins pénible et plus sensibles qui peuvent être utilisés pour étudier ces protéines importantes. Ici, nous décrivons et demonstrate soigneusement mis au point un essai de nitrocellulose de liaison qui peut être utilisé pour quantifier autophosphorylation de kinase histidine bactérienne purifiée in vitro. Ce test est un débit plus élevé et moins de temps que des analyses basées sur PAGE. Le procédé utilise également Cherenkov rayonnement pour phosphohistidine quantification, qui offre une limite supérieure de détection élevée et une grande plage dynamique. Le dosage peut être utilisé pour déterminer les paramètres cinétiques pour histidine kinases.

<table><tbody><tr><td>Acide phosphorique</td><td>VWR</td><td>AAAA18067-AP</td><td>Pour les réactions d’extinction et le lavage de la nitrocellulose</td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>RPI</td><td>T60040-5000.0</td><td>Tris-HCl pH 8,0, pour tampon de réaction kinase</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>RPI</td><td>P41000-2500.0</td><td>Pour tampon de réaction kinase</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>RPI</td><td>M24000-500.0</td><td>Pour tampon</td></tr> <tr><td>de réaction kinaseGlycérol</td><td>RPI</td><td>G22020-4000.0</td><td>Pour tampon de réaction kinase</td></tr><tr><td>5'-ATP</td><td>Promega</td><td>E6011</td><td>Substrat kinase</td></tr><tr><td>[&gamma ;-32P]-5'-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG002Z250UC&nbsp ;</td><td>6 000 Ci/mmol</td></tr><tr><td>Appareil de transfert de points à 96 puits</td><td>Bio-rad</td><td>1706545</td><td>Pour le repérage des réactions</td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>Whatman</td><td>32-10401396-PK</td><td>Pour le repérage des réactions</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma aldrich</td><td>P3504-50G</td><td>Pour la coloration de la nitrocellulose</td></tr></tbody></table>

quantification des bactéries histidine kinase autophosphorylation utilisant un dosage nitrocellulose reliure

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Nous démontrons une méthode utile pour quantifier l’autophosphorylation des histidines kinases bactériennes purifiées. Les histidine kinases sont connues pour leur implication dans la transduction du signal à deux composants, un système ubiquitaire par lequel les bactéries détectent et répondent aux stimuli environnementaux. La signalisation à deux composants comprend l’autophosphorylation d’une histidine kinase, suivie d’un phosphotransfert vers le domaine récepteur d’une protéine régulatrice de réponse, ce qui conduit finalement à une réponse de sortie. L’autophosphorylation de l’histidine kinase répond à la présence d’un stimulus environnemental apparenté, donnant ainsi aux bactéries un moyen de détecter et de répondre aux changements dans l’environnement. Malgré leur importance en biologie bactérienne, les histidines kinases restent mal comprises en raison de la labilité inhérente à la phosphohistidine. Les méthodes conventionnelles d’étude de ces protéines, telles que l’autoradiographie SDS-PAGE, présentent des lacunes importantes. Nous avons mis au point un test de liaison à la nitrocellulose qui peut être utilisé pour caractériser les histidine kinases. Le protocole de ce test est simple et facile à exécuter. Notre méthode a un débit plus élevé, prend moins de temps et offre une plus grande plage dynamique que l’autoradiographie SDS-PAGE.

<html> Un ensemble de données représentatives a été généré avec une image capturée avec un imageur de phosphore (figure 1), Ponceau S tache de la membrane de nitrocellulose (Figure 2), et les données de comptage de scintillations (figure 3). La figure 3A montre les constantes cinétiques enzymatiques dans une parcelle Lineweaver-Burk. Ces résultats ont été obtenus en utilisant une histidine kinase purifiée à partir d&#39; ...

Nous rapportons et démontrons un test de liaison à la nitrocellulose optimisé qui peut être utilisé pour quantifier l’autophosphorylation des histidine kinases bactériennes purifiées. Notre méthode présente plusieurs avantages par rapport aux techniques traditionnelles basées sur SDS-PAGE, offrant une alternative précieuse pour caractériser ces protéines importantes.

Quantification des bactéries histidine Kinase autophosphorylation utilisant un dosage nitrocellulose Reliure

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

L'objectif général de ce protocole est de quantifier l'autophosphorylation de kinases histidiniennes bactériennes purifiées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation à deux composants, telles que l'effet des stimuli cognates sur les interactions protéine-protéine en ce qui concerne l'autophosphorylation des kinases histidiniennes.Les principaux avantages de cette technique sont qu'il s'agit d'une méthode à haut débit permettant de détecter précisément des picomoles de phosphohistidine formés et d'obtenir les paramètres cinétiques des histidine kinases. En tant que chercheur postdoctoral, j'utilise la filtration sur membranes en nitrocellulose pour quantifier les ligands radioactifs liés aux protéines. Par conséquent, il semblait logique de développer une technique similaire pour quantifier la phosphorylation de l'histidine dans les histidine kinases bactériennes.Commencez cette procédure par la préparation des réactifs et des matériaux, comme décrit dans le protocole écrit. Pour installer l'appareil de dot-plot en plaque de 96 puits, découpez un morceau de membrane de nitrocellulose de huit centimètres sur douze centimètres. Placez la nitrocellulose dans l'appareil de dot-plot.Veillez à ce que la membrane soit bien ajustée afin que l'appareil soit hermétiquement scellé et que tous les puits soient entièrement recouverts par la membrane. Pour recueillir le filtrat, reliez l'appareil à un flacon secondaire muni d'un branchement latéral. À partir de la tige de la vanne, fixez un tuyau de longueur appropriée afin de permettre une utilisation confortable de l'appareil sans risque de renversement du flacon secondaire.Ensuite, reliez le flacon latéral secondaire à une source de vide aspirateur. Vérifiez que l'appareil est parfaitement étanche en appliquant un vide à l'appareil. Si l'appareil est correctement assemblé, un vide puissant sera présent dans tous les puits.Toutes les connexions de tubulure peuvent être enveloppées dans du Parafilm ou du film plastique afin d'assurer un joint étanche. Avant le démarrage, préparez les quatre composants de la réaction sous forme de quatre solutions mères X, comme décrit dans le protocole écrit. Mélangez des volumes égaux de tampon de réaction, de kinase à histidine et d'eau doublement distillée.Laisser ces composants réactionnels s'équilibrer à température ambiante pendant une courte période. Pour initier la réaction, ajouter un volume de solution d'ATP gamma-32 P et mélanger par aspiration et expulsion répétées à l’aide d’une pipette. Surveiller le temps écoulé de la réaction à l’aide d’un minuteur et laisser la réaction se dérouler pendant la durée souhaitée.Arrêter la réaction. Ajouter un aliquot de la réaction à de l'acide phosphorique 325 millimolaire. Placer immédiatement les réactions arrêtées sur de la glace jusqu'à ce que toutes les réactions soient terminées.Placer l'appareil préassemblé de type dot-plot à 96 puits dans un contenant secondaire. Ce contenant doit être suffisamment grand pour permettre de démonter facilement l'appareil, car l'appareil et la membrane seront radioactifs après utilisation. Appliquer un vide sur l'appareil de type dot-plot à 96 puits.Une fois l'appareil sous vide, pipeter soigneusement la réaction arrêtée directement sur la membrane de nitrocellulose dans chaque puits. Répéter ce processus jusqu'à ce que toutes les réactions soient chargées sur la membrane. Étant donné que la capacité de fixation de la nitrocellulose est supérieure à la quantité de kinase histidine déposée, on peut supposer que presque toute la kinase se fixe à la membrane lorsqu'elle est chargée correctement.En fonction de l'appareil utilisé, veillez à ne pas percer la nitrocellulose. Vérifiez que toute la réaction est entrée en contact avec la nitrocellulose. Il est fréquent qu'une partie de la réaction adhère aux parois du puits.Lavez les puits avec 100 microlitres d'acide phosphorique glacé à 25 millimolaires. Cette étape permettra à tout volume de réaction qui pourrait être piégé dans le puits d'atteindre la membrane, assurant ainsi un chargement complet de toutes les réactions. Laissez l'ensemble du volume traverser la membrane.Démontez soigneusement l'appareil avant d'arrêter le vide. Sachez que l'appareil et la membrane de nitrocellulose sont radioactifs à ce stade. Ne retirez aucun composant de l'appareil du récipient secondaire.À l’aide de pinces, transférer délicatement la membrane de nitrocellulose de l’appareil vers un récipient contenant environ 200 millilitres d’acide phosphorique glacé à 25 millimolaire. Fermer le récipient avec un couvercle, car le lavage sera radioactif. À ce stade, il est possible d’arrêter le vide.Placer le récipient contenant la membrane de lavage sur un agitateur rotatif. Laisser la membrane agiter doucement pendant 20 minutes. Au bout de 20 minutes, verser soigneusement la solution de lavage utilisée dans un grand seau destiné au stockage temporaire des déchets.Ajoutez 200 millilitres d'acide phosphorique 25 millimolaire glacé sur la membrane. Lavez la membrane de cette manière au moins trois fois afin d'éliminer le signal de fond de l'ATP gamma-32 P de la membrane. Après le troisième lavage, vérifiez la solution de lavage utilisée pour détecter toute radioactivité à l'aide d'un compteur Geiger.Continuez à laver la membrane jusqu'à ce qu'aucun signal ne soit présent dans la solution de lavage. Une fois que la membrane a été suffisamment lavée, laissez-la sécher brièvement à l'air, ce qui prend généralement cinq minutes ou moins. Après exposition de la nitrocellulose au vert phosphore, comme décrit dans le protocole écrit, préparez-vous à la coloration par le Ponceau S et à la décoloration.Immerger brièvement la membrane de nitrocellulose dans la solution de coloration au Ponceau S pendant une à deux minutes. Mouiller entièrement la membrane avec le colorant avant la décoloration. Ensuite, verser l'excès de Ponceau S présent sur la membrane.Rincez la membrane avec de l'eau doublement distillée jusqu'à ce que seules les taches provenant de la kinase histidine soient colorées. Notez que cette procédure ne fonctionnera que si toutes les taches contiennent des quantités détectables de protéine. À l'aide de ciseaux, découpez chaque tache sur la membrane de nitrocellulose.Il n'est pas nécessaire de découper parfaitement le long du bord de la tache colorée. Si la membrane a été suffisamment lavée, le fond parasite dû à la taille variable des découpes est négligeable. Il est seulement important de découper entièrement chaque tache pour chaque réaction.À l’aide de pinces, transférez soigneusement chaque spot dans des vials de scintillation. Aucun cocktail de scintillation n’est nécessaire, car le phosphore 32 est facilement détectable par la radiation de Tcherenkov. Ensuite, déposez plusieurs dilutions de solution d’ATP gamma-32 P sur des carrés de nitrocellulose d’un centimètre sur un centimètre.À l’aide de pinces, transférer soigneusement chaque carré dans des vials de scintillation sans ajout de cocktail de scintillation. Ces échantillons serviront à établir une courbe standard afin de déterminer les impulsions par minute par picomole de la solution d’ATP. La coloration au Ponceau de la membrane de nitrocellulose est présentée ici.La coloration est uniforme dans tous les échantillons, ce qui indique que tous les échantillons sont chargés de manière équivalente. Les résultats de la fluorographie de la membrane de nitrocellulose montrent le niveau relatif de phosphohistidine radiomarquée dans chaque point. La quatrième et la huitième rangée sont des contrôles négatifs, démontrant que l'excès d'ATP est éliminé de la membrane de nitrocellulose.Des résultats représentatifs de la quantification de l'autophosphorylation de la kinase à histidine sont présentés ici. Ces données sont obtenues par comptage en scintillation de chaque spot découpé sur la membrane. La courbe standard des impulsions par minute par picomole d'ATP, illustrée ici, est également générée par comptage en scintillation et est utilisée pour calculer le nombre de picomoles de phosphohistidine présents dans chaque échantillon.Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que l'introduction de stimuli cognats ou de protéines dont on suppose qu'elles modulent l'activité des kinases, peuvent être ajoutées à l'expérience afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l'effet de ces additifs sur l'activité des kinases. N'oubliez pas que le travail avec des matières radioactives peut être extrêmement dangereux. Des précautions telles qu'une formation adéquate en sécurité radiologique, ainsi que l'utilisation d'équipements de protection individuelle et de blindages, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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