Quantification des bactéries histidine Kinase autophosphorylation utilisant un dosage nitrocellulose Reliure

L’objectif global de ce protocole est de quantifier l’autophosphorylation des histidines kinases bactériennes purifiées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation à deux composants. Comme l’effet des stimuli apparentés dans les interactions protéine-protéine sur l’autophosphorylation des histidine kinases.

Les principaux avantages de cette technique sont qu’il s’agit d’une méthode à haut débit qui peut être utilisée pour détecter avec précision les picomoles de phosphohistadine formés et obtenir des paramètres cinétiques pour les histidine kinases. En tant que post-doctorant, j’utilise la filtration sur des membranes de nitrocellulose pour quantifier les ligands radioactifs liés aux protéines. Par conséquent, il était logique de développer une technique similaire pour quantifier la phosphorylation de l’histidine dans les kinases bactériennes de l’histidine.

Commencer cette procédure par la préparation des réactifs et des matériaux comme décrit dans le protocole de texte. Pour installer l’appareil à 96 puits, coupez un morceau de membrane de nitrocellulose de huit centimètres sur 12 centimètres. Positionnez la nitrocellulose dans l’appareil à dot-plot.

Assurez-vous que la membrane est bien ajustée de manière à ce que l’appareil soit scellé et que tous les puits soient complètement recouverts par la membrane. Pour recueillir le filtrat, connectez l’appareil à une fiole secondaire de l’arme de poing. À partir de la tige de la vanne, connectez le tube adéquat pour permettre à l’appareil d’être utilisé confortablement sans basculer le ballon secondaire.

Ensuite, connectez le flacon de l’arme latérale secondaire à une source de vide d’aspirateur. Vérifier que l’appareil est complètement scellé en appliquant un vide à l’appareil. Si l’appareil est correctement assemblé, un fort vide sera présent dans tous les puits.

Tous les raccords de tubes peuvent être enveloppés dans du Parafilm ou du Saran pour assurer une étanchéité parfaite. Avant l’initiation, préparer les quatre composants de la réaction sous forme de quatre solutions mères X, comme décrit dans le protocole textuel. Mélangez des volumes égaux de tampon de réaction, d’histidine kinase et d’eau distillée deux fois.

Laissez ces composants réactionnels s’équilibrer à température ambiante pendant une courte période. Pour amorcer la réaction, ajoutez un volume de solution de gamma-32 P ATP et mélangez en le faisant en soufflant de haut en bas. Suivez le temps de réaction écoulé à l’aide d’une minuterie et laissez la réaction se poursuivre pendant le temps souhaité.

Éteignez la réaction. Ajouter une partie aliquote de la réaction à 325 millimolaires d’acide phosphorique. Placez immédiatement les réactions éteintes sur de la glace jusqu’à ce que toutes les réactions soient terminées.

Placez l’appareil préassemblé à 96 puits dans un récipient secondaire. Ce récipient doit être suffisamment grand pour que l’appareil puisse être facilement démonté, car l’appareil et la membrane seront radioactifs après utilisation. Appliquez un vide à l’appareil à 96 puits.

Une fois l’appareil sous vide, pipetez soigneusement la réaction éteinte directement sur la membrane de nitrocellulose de chaque puits. Répétez ce processus jusqu’à ce que toutes les réactions soient chargées sur la membrane. Étant donné que la capacité de liaison de la nitrocellulose est supérieure à la quantité d’histidine kinase tachetée, on peut supposer que presque toute la kinase se lie à la membrane lorsqu’elle est correctement chargée.

Selon l’appareil utilisé, veillez à ne pas percer la nitrocellulose. Observez que toute la réaction a été en contact avec la nitrocellulose. Il est facile pour une partie de la réaction de coller aux parois du puits.

Lavez les puits avec 100 microlitres d’acide phosphorique glacé à 25 millimolaires. Cela permettra à tout volume de réaction qui aurait pu être piégé dans le puits d’atteindre la membrane, assurant ainsi un chargement complet de toutes les réactions. Laissez tout le volume s’écouler à travers la membrane.

Démontez soigneusement l’appareil avant d’éteindre l’aspirateur. Veuillez noter que l’appareil et la membrane de nitrocellulose sont radioactifs à l’heure actuelle. Ne retirez aucun composant de l’appareil du récipient secondaire.

À l’aide d’une pince, transférez avec précaution la membrane de nitrocellulose de l’appareil dans un récipient d’environ 200 millilitres d’acide phosphorique glacé de 25 millimolaires. Placez un couvercle sur ce récipient, car le lavage sera radioactif. À ce moment, l’aspirateur peut être coupé.

Placez le récipient avec la membrane de lavage sur une bascule. Laissez la membrane se balancer doucement pendant 20 minutes. Après 20 minutes, décantez soigneusement la solution de lavage usagée dans un grand seau à utiliser pour le stockage temporaire des déchets.

Ajoutez 200 millilitres d’acide phosphorique glacé à 25 millimolaires sur la membrane. Lavez la membrane de cette manière au moins trois fois pour éliminer le signal de fond gamma-32 P ATP de la membrane. Après le troisième lavage, testez la solution de lavage utilisée pour détecter les radiations à l’aide d’un compteur Geiger.

Continuez à laver la membrane jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de signal dans la solution de lavage. Une fois que la membrane est suffisamment lavée, laissez-la sécher brièvement à l’air, ce qui prend généralement cinq minutes ou moins. Après l’exposition de la nitrocellulose à un vert de phosphore, comme décrit dans le protocole de texte, préparez-vous à la coloration et à la décoloration de Ponceau S.

Immergez brièvement la membrane de nitrocellulose dans la solution de coloration Ponceau S pendant une à deux minutes. Mouillez toute la membrane avec la teinture avant de la décolorer. Ensuite, décantez l’excédent de Ponceau S de la membrane.

Rincez la membrane avec de l’eau distillée deux fois jusqu’à ce que seules les taches de l’histidine kinase soient colorées. Notez que cette procédure ne fonctionnera que si toutes les taches contiennent des quantités détectables de protéines. À l’aide de ciseaux, découpez chaque endroit sur la membrane de nitrocellulose.

Il n’est pas nécessaire de couper parfaitement le long du bord de la tache tachée. Si la membrane a été suffisamment lavée, le fond dû à la taille variable des taches découpées est négligeable. Il est seulement important de découper tout l’endroit pour chaque réaction.

À l’aide d’une pince, transférez soigneusement chaque point dans des flacons à scintillation. Aucun cocktail à scintillation n’est nécessaire, car le phosphore 32 est facilement détectable par le rayonnement Tcherenkov. Ensuite, repérez plusieurs dilutions de la solution d’ATP gamma-32 P sur des carrés d’un centimètre sur un centimètre de nitrocellulose.

À l’aide d’une pince, transférez soigneusement chaque carré dans des flacons à scintillation sans cocktail de scintillation. Ces échantillons seront utilisés pour générer une courbe standard permettant de déterminer les comptages par minute par picomole de la solution ATP. La coloration Ponceau de la membrane nitrocellulosique est illustrée ici.

La coloration est uniforme dans tous les échantillons, ce qui indique que tous les échantillons sont chargés de manière égale. Les résultats de la fluorographie de la membrane de nitrocellulose montrent le niveau relatif de phosphohistidine radiomarquée à chaque endroit. Les quatrième et huitième rangées sont des témoins négatifs démontrant que l’excès d’ATP est éliminé de la membrane de nitrocellulose.

Les résultats représentatifs de la quantification de l’autophosphorylation de l’histidine kinase sont présentés ici. Ces données sont générées à partir du comptage de la scintillation de chaque point découpé dans la membrane. La courbe standard du nombre de comptages par minute par picomole d’ATP illustrée ici est également générée à partir du comptage par scintillation et est utilisée pour calculer les picomoles de phosphohistidine présents dans chaque échantillon.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que l’introduction de stimuli apparentés ou de protéines dont on suppose qu’elles modulent l’activité des kinases, peuvent être ajoutées à l’expérience pour répondre à des questions supplémentaires telles que l’effet de ces additifs sur l’activité des kinases. N’oubliez pas que travailler avec de la radioactivité peut être extrêmement dangereux. Des précautions telles qu’une formation appropriée en matière de radioprotection et l’utilisation d’un équipement de protection individuelle et d’un blindage doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.