In Utero électroporation approches pour étudier l'excitabilité des neurones sous - populations et connectivité unicellulaire

L’objectif global de cette approche d’électroporation in utero est de caractériser la connectivité structurelle et l’excitabilité des neurones corticaux dans des conditions normales et expérimentales. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en neurobiologie du développement, telles que la dissection de la structure et de la connectivité fonctionnelle du cerveau et la biologie des troubles cognitifs. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de marquer une population clairsemée de neurones et permet d’habiller les dendrites et d’accéder aux neurones individuels, ce qui conduit à une analyse quantitative plus efficace et plus fimétique.

Avant l’injection, préparez dix microlitres de mélange d’ADN par chirurgie pour le marquage sur cellule unique ou l’étude standard par patch clamp. Ensuite, manipulez doucement les embryons avec les doigts pour localiser le télencéphale. Ensuite, placez un capillaire en borosilicate préparé dans une pipette à bouche.

Passez la pointe de l’aiguille dans l’utérus, en évitant les vaisseaux sanguins, jusqu’à ce qu’elle atteigne le ventricule latéral. Après cela, injectez lentement environ un microlitre de solution d’ADN de couleur verte rapide jusqu’à ce qu’une grande tache bleue soit observée. Une étape critique de cette procédure est l’injection de l’ADN.

Cela doit être fait aussi doucement que possible. Maintenant, placez les électrodes de platine de sept millimètres latéralement sur la tête d’un embryon et appliquez une tension via les électrodes de platine. Dans cette procédure, cryoprotégez les cerveaux fixes dans dix millilitres de saccharose à 30 % dans du PBS à quatre degrés Celsius pendant un à deux jours jusqu’à ce qu’ils coulent.

Préparez ensuite un cube cube de cubes de papier d’aluminium d’un centimètre et remplissez les cubes aux 2/3 ou de la manière avec de l’OCT. Ensuite, mettez les cerveaux dans les cubes et congelez-les sur de la glace sèche. Conservez ensuite les cerveaux congelés à 80 degrés Celsius.

Pour sectionner les cerveaux dans le cryostat, placez une goutte d’OCT sur la surface du disque de l’échantillon. Décollez la feuille d’aluminium du bloc d’histologie et positionnez le bloc à l’orientation souhaitée sur le dessus de l’OCT liquide. Appliquez une pression ferme jusqu’à ce que le bloc histologique soit fixé.

Insérez ensuite le disque de l’échantillon dans la tête de l’échantillon du cryostat et orientez l’échantillon pour la section. Ensuite, coupez des sections de 50 à 100 micromètres d’épaisseur et transférez les cryosections flottantes sur PBS à l’aide d’un pinceau fin. Par la suite, bloquez les sections pendant une heure à température ambiante avec 5 % de sérum fœtal bovin dans du PBS, contenant 0,5 % de Triton X-100.

Ensuite, incubez-les pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec un anticorps primaire 1:500 dilué dans une solution bloquante. Le lendemain, lavez les sections trois fois dans PBS. Ajouter 1:500 d’anticorps secondaires dilués dans une solution bloquante et incuber les sections pendant une heure à température ambiante.

Ensuite, lavez les sections trois fois dans du PBS. Ensuite, colorez les sections avec du dapE dans du PBS contenant 0,5 % de Triton X-100 pendant dix minutes. Rincez les sections avec du PBS et montez-les avec du support de montage.

Pour reconstruire les neurones, acquérez des images des sections du cerveau avec un fort grossissement et une haute résolution. Ensuite, sélectionnez Tile Scan dans le logiciel d’acquisition pour couvrir la zone d’intérêt, couvrant toutes les dendrites et tous les processus axonaux. Acquérez un nombre suffisant de piles sur l’axe Z pour éviter la perte d’informations.

Après cela, ouvrez l’image et sélectionnez l’option de ligne segmentée dans le menu. Tracez une ligne suivant la structure du neurone. Par la suite, allez dans Analyser, Outils, puis Gestionnaire de ROI, puis Ajouter pour enregistrer la ligne.

Répétez ce processus pour chaque axone ou dendrite du neurone analysé. Dans le menu Gestionnaire de retour sur investissement, appuyez sur Mesurer pour obtenir la longueur. Exportez les mesures dans un fichier texte ou une feuille de calcul pour analyse.

Pour effectuer un enregistrement du neurone exprimé par la GFP à partir d’une souris électroporée de la GFP, placez le cerveau dans une boîte de culture réfrigérée. Coupez le cervelet avec de petits ciseaux. Ensuite, prenez le cerveau avec une spatule et séchez-le sur une serviette en papier.

Collez le plan caudal ventral du cerveau sur un support de vibratome. Placez le support sur un vibratome rempli d’ACSF glacé et assurez-vous que la chambre du vibratome a une carbogénation continue. Ensuite, obtenez des coupes aiguës en coupant des sections coronales de 300 micromètres en 15 minutes.

Ensuite, incubez les tranches aiguës à 25 degrés Celsius pendant au moins 60 minutes dans de l’ACSF tout en les faisant bouillonner avec du carbogène. Après 60 minutes, transférez une tranche dans la chambre d’enregistrement à l’aide d’une pipette Pasteur ou d’un petit pinceau. Maintenez la tranche avec une harpe et abondez-la d’ACSF à raison de deux millilitres par minute.

Pour patcher un neurone GFP positif, localisez la zone d’intérêt à travers le microscope à 10x. Trouvez ensuite une cellule GFP positive à l’aide de l’objectif 60x. Ensuite, remplissez l’électrode d’enregistrement avec une solution intracellulaire.

Ensuite, placez une pipette en verre dans le porte-pipette. Ensuite, placez l’embout de la pipette dans le bain et concentrez-vous sur l’embout. Une fois la pipette dans le bain, appliquez une pression positive à travers le système de contrôle de la contre-pression.

Approchez-vous de la cellule d’intérêt sous guidage visuel tout en maintenant la contre-pression dans la pipette. À l’apparition d’une petite fossette à la surface de la cellule, relâchez la pression. À ce stade, un joint étanche avec une résistance supérieure à un giga-ohm peut se former.

Sinon, appliquez une légère pression négative pour faciliter cela. Pendant que le joint est formé, amenez la pince de tension de maintien à 60 millivolts. Une fois que le joint giga-ohm est formé, appliquez une impulsion d’aspiration pour rompre la membrane cellulaire et passer en mode cellule entière.

Une fois qu’il est en mode cellule entière, passez du mode pince de tension au mode pince de courant et commencez l’enregistrement. Ces images montrent l’administration de vecteurs aux neurones de la couche 2/3 par électroporation in utero au 15e jour embryonnaire, et les coupes coronaires ont été préparées au 16e jour postnatal. Le vecteur CAG DsRed2 a été cotransfecté en tant que contrôle.

La GFP n’est exprimée que dans les neurones qui ont également incorporé cre, permettant la recombinaison des sites LoxP dans le vecteur GFP CALNL. Voici une image confocale à fort grossissement des arborescences dendritiques d’un autre neurone GFP peu marqué. Il s’agit d’un neurone pyramidal électroporé avec GFP qui a été observé dans des conditions de champs clairs et de fluorescence verte.

Voici une réponse de dopage typique et régulière d’un neurone de contrôle électroporé CAG-GFP au niveau de la couche 2/3. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 minutes pour les électroporations in utero et en une demi-journée pour l’enregistrement par patch clamp si elle est réalisée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de faire l’opération le plus rapidement possible pour réduire le stress de la mère et augmenter les chances de survie des chiots.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’expression peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la relation entre l’expression de gènes spécifiques et leur influence dans le développement de la mère porteuse. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences du développement pour explorer la connectivité et la morphologie des neurones chez la souris. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser le fonctionnement in utero pour décrire la structure et la connectivité des neurones au niveau de la cellule unique et l’excitabilité des neurones marqués par fluorescence.