Name: Les cellules souches pluripotentes dérivées de cellules cardiaques pour réparation myocardique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Découvrez la différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en cardiomyocytes, cellules endothéliales et cellules musculaires lisses pour la réparation myocardique. Cette méthode améliore l'engrèvement cellulaire par livraison de cytokines.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du Service de santé publique des États-Unis NIH RO1 HL67828, HL95077, HL114120 et UO1 HL100407-projet 4 (à JZ), une subvention de développement scientifique de l’American Heart Association (16SDG30410018) et un prix Research Voucher de l’Université de l’Alabama au Birmingham Center for Clinical and Translational Science (à WZ).

Toutes les procédures expérimentales sont réalisées en conformité avec les lignes directrices animales de l&#39;Université d&#39;Alabama à Birmingham. 1. Différencier hiPSCs dans hiPSC-CMs <ol><li> Revêtir les puits d&#39;une plaque à 6 puits avec un mélange de protéines gélatineux prérefroidie aux facteurs de croissance réduite à 4 ° C pendant une nuit. Aspirer le mélange de protéines gélatineux avant utilisation. Ensemencer les hiPSCs sur les plaques pré-revêtues, et la culture des cellules (1 x 10 5 cellules par puits) à 5% de CO 2 et 37 ° C en milieu mTeSR1 supplément avec un inhibiteur de ROCK 10 pm. </li><li> Actualiser le moyen quotidien jusqu&#39;à ce que les cellules atteignent 90% de confluence; Ensuite, ajouter le mélange de protéines gélatineux facteurs de croissance réduite dans le milieu (mélange 0,5 mg gélatineux de protéines par plaque à 6 puits, 2 ml de milieu par puits) et culture des cellules pendant 5% de CO 2 et 37 ° C encore deux jours. <ol><li> Pour remplacer le milieu, aspirer délicatement le moyen de la boîte de Pétri via vide avecà toucher les cellules, et ajouter un nouveau milieu à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert. </li></ol></li><li> Initier la différenciation en remplaçant le milieu par du milieu RPMI1640 additionné de facteurs de croissance réduit mélange protéique gélatineuse, sans B27 insuline et 100 ng / ml d&#39;activine A; la culture des cellules à 5% de CO 2 et 37 ° C pendant 24 heures. </li><li> Remplacer le milieu par du milieu RPMI1640 qui a été complémenté avec B27 sans insuline, 10 ng / ml de protéine morphogénique de l&#39;os 4 (BMP-4), et le facteur 10 ng / ml de croissance basique des fibroblastes (bFGF); la culture des cellules à 5% de CO 2 et 37 ° C pendant 96 heures. </li><li> Remplacer le milieu par du milieu RPMI1640 additionné de B27 et poursuivre la culture des cellules à 5% de CO 2 et 37 ° C; rafraîchir le milieu tous les 3 jours. </li><li> Observer des amas de cellules contracter sous le microscope ~ 3 jours après le début de la différenciation. Recueillir les grappes ~ 7 jours après la première observation des contractions et les laver dans une solution saline équilibrée de Hanks. <ol><li> Dissocier les cellules groupées dans la plaque en les incubant dans un tampon Hanks contenant 100 U / ml de collagénase IV pendant 10 min à 37 ° C en agitant doucement; puis, ajouter 0,25% de trypsine dans de l&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pendant 5 min. </li><li> Neutraliser la solution d&#39;enzyme avec 10% de sérum de fœtus bovin dans du RPMI / moyen B27, puis remettre en suspension les cellules dans du milieu RPMI / B27. </li><li> Comptez le nombre de cellules par hémocytomètre. Cultiver les cellules sur les boîtes de 10 cm à 5% de CO 2 et 37 ° C pendant au moins 3 heures, ce qui permettra aux cellules non cardiomyocytes à adhérer à la surface de la boîte de culture. </li></ol></li><li> Recueillir la suspension cellulaire, qui contient le hiPSC CMS et maintenir les cellules (environ 1 x 10 6 cellules par boîte de 10 cm) en les cultivant sur une surface du mélange revêtu de protéine gélatineux. </li></ol> 2. Différencier hiPSCs dans hiPSC-CEs <ol><li> Dissocier la population hiPSC en cellules isolées par incubation them avec un agent chélateur à 5% de CO 2 et 37 ° C pendant 5 min. Transférer les cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 ml contenant du milieu mTeSR1 frais. </li><li> Isoler les cellules à 200 xg pendant 5 min. Resuspendre les cellules dans un milieu mTeSR1 complété avec un inhibiteur de ROCK 10 uM. Déterminer la densité de cellules avec un hémocytomètre. </li><li> Ajouter 250 ul de 20 unités NIH / ml de solution de thrombine à un puits d&#39;une plaque à 24 puits. </li><li> Ajouter 1 x 10 6 hiPSCs 250 pi d&#39;un / ml de solution de fibrinogène de 12,5 mg. Et ajouter 250 ul de solution de fibrinogène contenant des cellules à la thrombine ainsi chargé. Observer le mélange se solidifie pour former une fibrine échafaudage contenant de hiPSC au sein min. </li><li> Transférer les, échafauds contenant des cellules solidifiées dans les puits d&#39;une plaque à 6 puits avec la pince de verre de couverture, et d&#39;initier la différenciation en cultivant les échafauds dans 2 ml de milieu EBM2 additionné de 2% B27 sans insuline, activine A (50 ng / ml) et la BMP-4 (25 ng / ml) pendant 24 heures à 5% de CO <sub&gt; 2 et 37 ° C. <ol><li> Remplacez le support en suçant doucement l&#39;ancien milieu par le vide sans toucher les cellules. Ajouter un nouveau milieu EBM2 additionné de B27, sans insuline, facteur de croissance vasculaire endothélial (VEGF 50ng / ml), l&#39;érythropoïétine (EPO, 100 ng / ml) et en transformant β1 de facteur de croissance (TGFβ1, 10 ng / ml) et de la culture le échafauds à 5% de CO 2 et 37 ° C pendant 48 h. </li><li> Actualiser le moyen et la culture les échafauds à 5% de CO 2 et 37 ° C pendant encore 48 heures; puis libérer les cellules de l&#39;échafaudage par l&#39;addition de 200 U de collagénase IV (100 U / ml) au milieu. </li><li> Isoler les cellules après leur libération. Remplacer le milieu par 2 ml de milieu EGM2-MV supplémenté avec 2% de B27, le VEGF-A (50 ng / ml), et le SB-431542 (10 uM); rafraîchir le milieu tous les deux jours. </li><li> Environ 10 jours plus tard (soit le ~ Jour 14 après différenciation a été lancé), dissocier les cellules avec 100 U / ml de collagénase IV, isoler hiPSC-ECs de la population de cellules différenciées par cytométrie de flux analyse pour l&#39;expression de protéines marqueurs EC-spécifiques (par exemple, CD31, CD144) 3. </li><li> Développez le isolé hiPSC-CEs via un protocole établi 3. </li></ol></li></ol> 3. Différencier hiPSCs dans hiPSC-CML <ol><li> Ensemencer les hiPSCs sur des plaques qui ont été enrobées avec le mélange protéique gélatineuse, et la culture des cellules dans un milieu mTeSR1 à 5% de CO 2 et 37 ° C, avec des changements de milieu tous les jours, jusqu&#39;à la confluence (~ 2 jours). </li><li> Initier la différenciation en cellules mésodermiques lignée en cultivant les cellules avec CHIR99021 (5 uM) et BMP-4 (10 ng / ml) dans du milieu RPMI 1640 et 2% de B27, ainsi que l&#39;insuline pendant 3 jours. </li><li> Pour produire hiPSC-CML avec un phénotype essentiellement synthétique: <ol><li> La culture des cellules avec le VEGF-A (25 ng / ml), de β du facteur de croissance des fibroblastes (FGFβ, 5 ng / ml) dans du RPMI1640 moi<html> dium et 2% de B27 insuline à moins de 5% de CO 2 et 37 ° C pendant 4 jours. </li><li> La culture des cellules dans VEGF-A (25 ng / ml), FGFβ (5 ng / ml) dans du milieu RPMI 1640 et 2% de B27 , ainsi que l&#39; insuline à 5% de CO 2 et 37 ° C pendant 2 jours. </li><li> La culture des cellules en β du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFβ, 10 ng / ml), TGFß (3 ng / ml) dans RPMI 1640 et 2% de B27 , ainsi que l&#39; insuline à 5% de CO 2 et 37 ° C pendant 4 jours. </li></ol></li><li> Pour produire hiPSC-CML avec un phénotype contractile principalement: <ol><li> La culture des cellules pendant 4 jours avec le VEGF-A (25 ng / ml) et FGFβ (5 ng / ml) dans RPMI 1640 et 2% de moins B27 insuline. </li><li> La culture des cellules pendant 7 jours avec PDGFβ (5 ng / ml) et de la TGFß (2,5 ng / ml) dans RPMI 1640 et 2% de B27, ainsi que l&#39;insuline. </li></ol></li><li> Purifier populations finales hiPSC-SMC en cultivant les cellules dans du lactate (4 mM) contenant du milieu RPMI 1640 métabolique pendant environ 6 jours. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 4. Création des microsphères contenant de l&#39;IGF- <ol><li> Chauffer l&#39;huile d&#39;olive à 45 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Chauffer 5 ml d&#39;une solution de gélatine à 10% à 50 ° C. </li><li> Ajouter la gélatine à l&#39;huile d&#39;olive, mélanger, puis refroidir rapidement à 5 ° C en ajoutant de la glace pour le bain d&#39;eau. </li><li> Vingt-cinq minutes plus tard, ajouter réfrigérée (4 ° C), de l&#39;acétone à l&#39;huile d&#39;olive pour induire la formation de microsphères. </li><li> Maintenir la température à 5 ° C pendant 1 heure; puis, recueillir les microsphères, les laver 5 fois avec de l&#39;acétone pré-refroidie pour éliminer l&#39;huile d&#39;olive, et leur permettre de sécher à l&#39;air à 4 ° C. </li><li> Remettre en suspension les microsphères dans une solution de 70% d&#39;éthanol et 0,25% de glutaraldéhyde pendant une nuit à 4 ° C pour induire la réticulation, puis neutraliser le mélange avec de la glycine 100 mM. </li><li> La charge de l&#39; IGF dans les microsphères par mélange de 5 mg de microsphères avec 15 ul de H 2 O distillée contenant 5 ug d&#39; IGF et 0,1% d&#39; albumine de sérum bovin pendant 30 minutes. </li></ol> 5. Création du Patch sur le site de la blessure et l&#39;injection des cellules <ol><li> Suspendre le CMs hiPSC dérivé (2 millions), CML (1 million), et endothéliales (1 million), ainsi que dans 1 ml du milieu essentiel minimum (MEM). </li><li> Suspendre 5 mg de microsphères dans 1 ml de solution de fibrinogène (25 mg / ml). </li><li> Remplir une seringue avec la solution contenant des cellules, une autre seringue contenant la solution de fibrinogène / microsphère, et une troisième seringue avec 1 ml de solution de thrombine (80 unités NIH / ml, supplémenté avec 2 ul de 400 mM de CaCl2 et 200 mM de ε-aminocaproïque acide). </li><li> Chirurgicalement induire un infarctus du myocarde dans le cœur du porc par ligature de antérieure gauche artère coronaire descendante comme décrit précédemment 2. NOTE: En bref, femelle porcine Yorkshire (~ 13 kg, 45 jours d&#39;âge) sont sous sédation avec une injection intramusculaire de Telazol / xylazine (4,4 mg / kg), et intubés sous anesthésie générale avec de l&#39;isoflurane (0,5-5%). Une 4 ème intercthoracotomie ostal est réalisée et antérieure gauche artère coronaire descendante est exposée. L&#39;artère coronaire est obstruée par une ligature pendant 60 minutes, puis la ligature est retirée. defibrillation électrique est effectuée immédiatement dans le cas de la fibrillation ventriculaire. </li><li> Placer un anneau en plastique stérile (~ 2,5 cm) sur l&#39;épicarde de la région infarcie des coeurs de porc, puis injecter simultanément les solutions microsphère / fibrinogène et de thrombine dans l&#39;anneau. </li><li> Laisser le mélange se solidifier (~ 30 sec), puis insérez l&#39;aiguille de la seringue contenant des cellules à travers le mélange solidifié dans le myocarde infarci et injecter les cellules. Fermez les couches musculaires, du tissu sous-cutané, et la paroi thoracique avec 3-0 ou 2-0 Monocryl suture selon la taille de l&#39;animal. Buprénorphine 0,01-0,02 mg / injection intramusculaire kg toutes les 8 heures sera utilisé pour contrôler la douleur pour les 3 premiers jours après la chirurgie. </li><li> Évaluer la fonction cardiaque en utilisant une résonance magnétique cardiaque(IRM) avant une intervention chirurgicale, d&#39; une semaine et quatre semaines après l&#39;intervention chirurgicale 2, 3, 4. Après les études d&#39;IRM finales, sacrifiez l&#39;animal et le traitement de leurs coeurs pour histologie et analyse moléculaire 2, 3, 4. </li></ol>

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Amélioration de rendement / pureté de hiPSC-CMs protocoles classiques pour la différenciation des cellules souches humaines dans CMs sont souvent limitées par un faible rendement et la pureté; par exemple, juste 35-66% des CSEh-CMs obtenu par Percoll séparation et la formation du corps cardiaque exprimé myosine lente chaîne lourde ou cTnT 6. La pureté des populations hiPSC-CM différenciées peut être sensiblement augmentée en sélectionnant pour l&#39;expression d&#39;un g...

Les cellules souches pluripotentes humaines induites (les hiPSCs) sont parmi les agents les plus prometteurs pour la thérapie cellulaire régénérative, car ils peuvent être différenciées en une gamme potentiellement illimitée et la quantité de cellules qui ne sont pas rejetées par le système immunitaire du patient. Cependant, leur capacité d&#39;auto-réplication et la différenciation peut aussi conduire à la formation de tumeurs et, par conséquent, hiPSCs doivent être pleinement différenciées en types de cellules spécifiques, tels que les cardiomyocytes (SGC), les cellules endothéliales (EC), et les cellules musculaires lisses (CML ), avant l&#39;administration. Une des méthodes les plus simples et les plus courantes de l&#39;administration des cellules est l&#39;injection intra-myocardique directe, mais le nombre de cellules transplantées qui sont greffées par le tissu myocardique natif est exceptionnellement bas. Une grande partie de cette attrition peut être attribuée à l&#39;environnement cytotoxique du tissu ischémique; Cependant, lorsque les cellules souches embryonnaires murines (CES) ont été injectés directement dans le myocarde des cœurs indemnes, oeul ~ 40% des 5 millions de cellules livrées ont été retenus pendant 3-5 h 1, ce qui suggère qu&#39;une proportion importante des cellules administrées a quitté le site d&#39;administration, peut - être parce qu&#39;ils ont été évincés par la piste de l&#39; aiguille par les hautes pressions produites au cours de la contraction du myocarde. Ici, nous présentons des méthodes nouvelles et sensiblement plus efficaces pour générer cardiomyocytes hiPSC dérivés (hiPSC-SGC) 2, les cellules endothéliales (hiPSC-CEs) 3, et les cellules musculaires lisses (CML) 4. Notamment, ce protocole hiPSC-SMC est le premier à imiter le large éventail de caractéristiques morphologiques et fonctionnelles observées dans somatique CML 5 en dirigeant les cellules vers un phénotype SMC essentiellement synthétique ou contractile. Nous fournissons également une méthode de livraison de cellules qui améliore le taux de cellules injectées de greffe en créant un contenant cytokine-fibrine pATCH sur le site d&#39;injection. Le patch semble améliorer à la fois la rétention des cellules, en obturant la voie de l&#39;aiguille pour empêcher les cellules de sortir du myocarde, et la survie des cellules, en libérant le facteur de croissance analogue à l&#39;insuline (IGF), pendant une période d&#39;au moins trois jours.

<table><tbody><tr><td>Protocol Section 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium</td><td>Technologies des cellules souches</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel à facteur de croissance réduit</td><td>Corning lifescience</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Technologies des cellules souches</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>Supplément de B27, sans sérum</td><td>Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D</td><td>338-AC-010</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>R& D</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D</td><td>232-FA-025</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase IV</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0217889</td><td></td></tr><tr><td>solution saline équilibrée (dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO<>4 anhydre)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14175079</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Fisher</td><td>Scientific 10438018</td><td></td></tr><tr><td>Assiette 6 puits</td><td>Corning Lifescience</td><td>356721</td><td></td></tr><tr><td>Antenne parabolique de 10 cm</td><td>Corning Lifescience</td><td>354732</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur de cellules</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>Protocol Section 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Fisher Scientific</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8630-5g</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7009-1KU</td><td></td></tr><tr><td>EMB2 moyen</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>ProSpec-Tany</td><td>CYT-241</td><td></td></tr><tr><td>EPO</td><td>Life Technologies</td><td>PHC9431</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&#946 ;</td><td>Peprotech</td><td>100-21C</td><td></td></tr><tr><td>EGM2-MV moyen</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>Selleckchem</td><td>S1067</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>BD Bioscience</td><td>BDB555445</td><td></td></tr><tr><td>CD144</td><td>BD Bioscience</td><td>560411</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger de 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565269</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorff Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5702R</td><td></td></tr><tr><td>Protocol Section 3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Technologies des cellules souches</td><td>720542</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-&#946 ;</td><td>Prospec</td><td>CYT-501-10ug</td><td></td></tr><tr><td>Protocol Section 4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Huile d’olive</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1514</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gélatine Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>IGF</td><td>R& D</td><td>291-G1-01M</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Fisher Scientific</td><td>15561020</td><td></td></tr><tr><td>Plaque chauffante</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP88850200</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-10Q</td><td></td></tr><tr><td>Protocol Section 5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Acide 223506</td><td></td></tr><tr><td>&#949 ;-aminocaproïque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0420000</td><td></td></tr><tr><td>MEM medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>Seringue</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482748</td><td></td></tr><tr><td>Ventilateur d’anesthésie</td><td>Datex-Ohmeda</td><td>47810</td><td></td></tr><tr><td>Ventilateur d’anesthésie</td><td>Ohio Medical</td><td>V5A</td><td></td></tr><tr><td>Défibrillateur</td><td>Physiol Control</td><td>LIFEPAK 15</td><td></td></tr><tr><td>1.5 T IRM</td><td>General Electric</td><td>Signa Horizon LX</td><td></td></tr><tr><td>7 T IRM</td><td>Siemens</td><td>10018532</td><td></td></tr><tr><td>Gadolinium Contrast Medium (Magnevist)</td><td>Berlex</td><td>50419-188-02</td><td></td></tr><tr><td>2-0 suture en soie</td><td>Ethilon</td><td>685H</td><td></td></tr><tr><td>Suture en soie 3-0</td><td>Ethilon</td><td>622H</td><td></td></tr><tr><td>Suture monofilament 3-0</td><td>Ethilon</td><td>627H</td><td></td></tr></tbody></table>

les cellules souches pluripotentes dérivées de cellules cardiaques pour réparation myocardique

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

Humaines induite par les cellules souches pluripotentes (hiPSCs) doivent être entièrement différenciées en types de cellules spécifiques avant l&#39;administration, mais des protocoles classiques pour différencier hiPSCs en cardiomyocytes (hiPSC-SGC), les cellules endothéliales (hiPSC-CEs), et les cellules musculaires lisses (CML) sont souvent limitée par un faible rendement, la pureté, et / ou une mauvaise stabilité phénotypique. Ici, nous présentons de nouveaux protocoles pour générer hiPSC-CMs, -ECs et -SMCs qui sont sensiblement plus efficaces que les méthodes conventionnelles, ainsi qu&#39;une méthode pour combiner l&#39;injection de cellules avec un patch contenant une cytokine créée sur le site de l&#39;administration. Le patch améliore à la fois la rétention des cellules injectées, en obturant la voie de l&#39;aiguille pour empêcher les cellules d&#39;être pressé hors du myocarde, et la survie des cellules, en libérant le facteur de croissance analogue à l&#39;insuline (IGF), pendant une période prolongée. Dans un modèle porcin d&#39;infarctus lésions d&#39;ischémie-reperfusion, le taux de prise de greffe était plus de deux fois plus élevée lorsque lales cellules ont été administrés avec le patch contenant les cytokines sont comparés aux cellules sans correction, et un traitement avec à la fois les cellules et le patch, mais non avec les cellules seules, a été associée à une amélioration significative de la fonction cardiaque et la taille de l&#39;infarctus.

Caractérisation des Differentiated hiPSC-CMs, -ECs et -SMCs La capacité différentielle de hiPSCs ont été évaluées 2, 3, 4. Débit analyse cytométrie de la troponine T cardiaque (cTnT) expression suggèrent que la pureté de la finale population hiPSC-CM peut dépasser 90% (figure 1A, 1B, panneau B1). Presque...

Nous présentons trois protocoles nouveaux et plus efficaces pour différencier les cellules souches pluripotentes humaines induites dans les cardiomyocytes, les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses et une méthode de distribution qui permet d&#39;améliorer la prise de greffe de cellules transplantées en combinant l&#39;injection de cellules avec la livraison de cytokines pièce à médiation.

Les cellules souches pluripotentes dérivées de cellules cardiaques pour réparation myocardique

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

L'objectif général de cette vidéo est de présenter une technique permettant de différencier des cellules souches pluripotentes humaines en cardiomyocytes, et de démontrer l'utilisation de ces cellules pour étudier la réparation myocardique après une lésion d'ischémie-reperfusion. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant l'ingénierie des tissus cardiaques à l'aide de cellules iPS humaines dérivées de cellules cardiaques pour la réparation myocardique. Le principal avantage de cette procédure est qu'elle permet aux scientifiques de recueillir des cardiomyocytes, des cellules musculaires lisses et des cellules endothéliales purifiées, et de générer un tissu cardiaque à partir de ces cellules progénitrices.Ling Gao est un post-doctorant dans le propre laboratoire du docteur Zhang à l'UAB et Greg Walcott est cardiologue à l'hôpital de l'UAB. Trina est spécialiste en IRM à l'hôpital de l'UAB. Pour induire des cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes, commencez par recouvrir les puits d'une plaque à six puits d'un mélange protéique gélatineux réduit en facteurs de croissance refroidi à 4 degrés Celsius.Ensuite, réfrigérez la plaque toute la nuit à 4 degr

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Nous avons établi un protocole pour l'induction de cardioblasts direct pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines maintenues dans des conditions définies avec de petites molécules, qui permet la dérivation d'une offre importante de progéniteurs cardiaques humaines et fonctionnel pour les cardiomyocytes cardiovasculaires réparation.

Dérivation efficace des ressources humaines précurseurs cardiaques et les cardiomyocytes à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

La génération de tissu myocardique alignés est une exigence essentielle pour adapter les progrès récents de la biologie des cellules souches à des fins utiles en clinique. Ici nous décrivons une approche impression par microcontact pour le contrôle précis de la forme et la fonction cellulaire. Utilisation populations hautement purifiées de cellules souches embryonnaires dérivées progéniteurs cardiaques, nous avons ensuite générer anisotrope tissu fonctionnel du myocarde.

Génération de tissu myocardique alignés fonctionnelle grâce à l&#39;impression par microcontact

Fourniture de cellules intra-myocardique dans des modèles murins de maladies cardio-vasculaires telles que l'hypertension ou de l'infarctus du myocarde, est largement utilisé pour évaluer le potentiel thérapeutique de différents types de cellules dans les études de régénération. Par conséquent, une description détaillée et une visualisation claire de cette intervention chirurgicale aideront à définir les limites et les avantages des analyses thérapeutiques de cellules cardiovasculaires chez...

Intramyocardique cellulaire livraison: Observations aux coeurs murins

Dans ce protocole, la dérivation de cellules progénitrices cardiaques à partir de cellules souches embryonnaires de souris et d’humains sera illustrée. L’une des principales stratégies de ce protocole consiste à enrichir les cellules progénitrices cardiaques par cytométrie en flux à l’aide de rapporteurs fluorescents intégrés dans les lignées de cellules souches embryonnaires.

Dérivation des cellules cardiaques progénitrices de cellules souches embryonnaires

Ici, nous présentons une méthode pour exploiter efficacement le potentiel de différenciation cardiaques des jeunes sources de cellules souches mésenchymateuses humaines afin de générer des cellules fonctionnelles, contractants, cardiomyocyte-comme in vitro.

In Vitro Différenciation des cellules souches mésenchymateuses humaines en cellules fonctionnelles Cardiomyocyte

Nous présentons ici une méthode robuste pour reprogrammer les fibroblastes embryonnaires primaires dans les cardiomyocytes fonctionnelles par le biais de la surexpression de GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 et miR-133 (GHMT2m) aux côtés de l’inhibition de la signalisation TGF-β. Notre protocole génère des cardiomyocytes raclée dès transduction après 7 jours avec jusqu'à 60 % efficacité.

Suppression de la signalisation profibrotiques potentialise médiée par les facteurs reprogrammation des fibroblastes embryonnaires de souris dans les Cardiomyocytes induites

Ce protocole décrit une technique de différenciation endothéliale de cellules progénitrices cardiaque. Il se concentre particulièrement sur comment la concentration sérique et la densité cellulaire-ensemencement affectent le potentiel de différenciation endothéliale.

Induction de la différenciation endothéliale dans les cellules progénitrices cardiaque dans des Conditions de faible taux sérique

Ici, nous fournir une description détaillée d’un montage expérimental pour une analyse de l’évaluation de l’intégrité de l’ADN dans les cellules avant la transplantation de cellules souches.

Évaluer l’intégrité de l’ADN de cellules souches pour la thérapie cellulaire cardiaque

Le protocole actuel génère des tissus cardiaques en forme de maille contenant des cellules cardiovasculaires dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme pour permettre l’étude de la thérapie d’implantation cellulaire pour les maladies cardiaques.

Préparation de tissus cardiaques en forme de maille dérivés de cellules iPS humaines pour la réparation myocardique in vivo

Ici, nous présentons un protocole pour générer et développer de manière robuste des cardiomyocytes humains à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique du patient.

Génération et expansion de cardiomyocytes humains à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique du patient

L’administration de cellules guidée par ultrasons autour du site de l’infarctus du myocarde chez la souris est un moyen sûr, efficace et pratique de transplantation cellulaire.

Implantation de cardiomyocytes induite par ultrasons dérivée de cellules souches pluripotentes chez des souris infarctus du myocarde

Découvrez la différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en cardiomyocytes, cellules endothéliales et cellules musculaires lisses pour la réparation myocardique. Cette méthode améliore l'engrèvement cellulaire par livraison de cytokines.

Les cellules souches pluripotentes dérivées de cellules cardiaques pour réparation myocardique

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