Détection de Copy Number Transformations Utilisation unique cellule de séquençage

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les altérations du nombre de copies d’ADN à l’échelle mégabase dans des cellules uniques. Afin de catégoriser l’hétérogénéité génomique dans les populations cellulaires, il est nécessaire d’identifier les changements génomiques à la résolution d’une seule cellule. Traditionnellement, cela était réalisé à l’aide d’approches cytologiques, mais ces méthodes étaient limitées dans leur sensibilité et leur spécificité.

Le séquençage unicellulaire peut détecter une variété de changements génomiques, avec une sensibilité et une spécificité accrues par rapport aux approches précédentes, mais seulement lorsqu’il est exécuté avec soin. Ici, nous décrivons comment utiliser le séquençage de cellule unique pour détecter de manière fiable les altérations du nombre de copies à l’échelle de la mégabase dans les cellules uniques. Pour assembler le micro-aspirateur, commencez par retirer l’extrémité en plastique transparent de l’ensemble du tube d’aspirateur et insérez l’extrémité étroite dans une extrémité d’un tube en PVC d’un pied de long avec un diamètre intérieur de 3/16e de pouce.

Insérez la sortie d’un filtre de seringue de 0,2 micromètre dans l’autre extrémité du tube en PVC d’un pied de long avec un diamètre intérieur de 3/16e de pouce. Insérez ensuite l’entrée du filtre de seringue de 0,2 micromètre dans une extrémité d’un tube en PVC de six pouces de long avec un diamètre intérieur de 5/16e de pouce. Cassez une pipette sérologique en plastique de cinq millilitres à la graduation d’un millilitre et insérez l’extrémité cassée dans l’extrémité ouverte du tube en PVC avec un diamètre intérieur de 5/16e de pouce.

Ensuite, insérez la sortie de la pipette sérologique en plastique de cinq millilitres dans l’extrémité flexible d’un tube d’aspirateur, puis utilisez un tube en plastique stérile pour couvrir l’embout buccal rouge de l’ensemble de tube pour le stockage. Tirez un tube capillaire en verre d’un diamètre intérieur de 10 à 30 micromètres en positionnant le milieu du tube près d’une flamme et en appliquant une tension à chaque extrémité du tube. Cassez le tube étiré en deux moitiés pour créer deux aiguilles d’aspirateur potentielles.

Répétez cette étape avec plusieurs tubes pour vous assurer qu’un nombre suffisant d’aiguilles sont préparées avec un diamètre intérieur approprié pour le prélèvement de cellules individuelles. Pour préparer les cellules d’adhérence, telles que les lignées cellulaires de fibroblastes humains, récoltez les cellules par trypsinisation et transférez-les dans un tube conique contenant le milieu approprié. Installez un capot pour l’amplification du génome entier en utilisant de l’eau de Javel à 10 % pour pulvériser sur la surface du capot, des boîtes d’embouts de pipette et des pointes de pipette.

Ensuite, utilisez une serviette en papier pour les essuyer tous avant de répéter le lavage avec de l’éthanol à 70 %. Ajoutez huit microlitres d’eau du kit d’amplification du génome entier, ou WGA, à des puits individuels sur une plaque PCR de 96 puits. Couvrez ensuite la plaque PCR à 96 puits avec un couvercle à partir d’une plaque de culture tissulaire à 96 puits et placez la plaque sur de la glace.

Ensuite, ajoutez 1 000 cellules à 10 millilitres de milieu ou de PBS dans une boîte de Pétri de 15 centimètres et placez la boîte sur de la glace pour empêcher les cellules d’adhérer à la boîte. Ensuite, alors qu’ils sont encore sur la glace, transférez les cellules de la boîte de Pétri et de la plaque de PCR à 96 puits dans un microscope optique avec un objectif 10X. Augmentez l’ouverture de l’aiguille de l’aspirateur en tapotant doucement l’extrémité allongée de l’aiguille sur une surface dure de sorte que la pointe se brise.

Insérez ensuite l’extrémité large de l’aiguille dans l’extrémité transparente du micro-aspirateur. Ensuite, placez la boîte de Pétri contenant les cellules sur la platine du microscope. Insérez l’embout buccal rouge de l’aspirateur dans la bouche.

Ensuite, lors de l’utilisation de l’un devait déplacer l’aiguille de l’aspirateur, et l’autre main pour déplacer la boîte de Pétri, identifier les cellules individuelles à séquencer. En utilisant l’aspiration buccale, aspirez une seule cellule dans l’aiguille de l’aspirateur avec environ un à deux microlitres de milieu ou de PBS. Transférez la cellule dans les huit microlitres d’eau dans un seul puits de la plaque PCR à 96 puits.

La qualité et l’utilité des données de séquençage de cellules uniques dépendent de l’état de chaque cellule et de son génome, par conséquent, lors de la préparation cellulaire et de la micro-aspiration, veillez à isoler les cellules viables et non apoptotiques. Après avoir aspiré chaque cellule et l’avoir transférée dans un puits de la plaque de PCR, marquez le puits qui a reçu une cellule. Répétez cette opération pour le nombre de cellules souhaité.

En attendant, décongelez 10X le tampon de fragmentation de lyse unicellulaire du kit d’amplification du génome entier. Pour éviter la contamination lors de l’amplification du génome entier, ajoutez tous les réactifs à l’intérieur d’une hotte de culture tissulaire. Utilisez des pointes de pipette avec des filtres et changez la pointe de la pipette entre les puits.

Pour chaque ensemble de 32 cellules maximum, combinez 32 microlitres de tampon de lyse et de fragmentation 10X Single Cell et deux microlitres de solution de protéinase K dans un tube de microcentrifugation, puis vortex le tube pour mélanger le contenu. Ajoutez un microlitre de solution dans chaque puits et pipetez de haut en bas pour mélanger. Couvrez la plaque et utilisez un film plastique pour sceller tous les puits.

Ensuite, centrifugez brièvement la plaque dans une mini essoreuse de plaques. Ensuite, passez la plaque dans le thermocycleur à l’aide du programme suivant. Ensuite, refroidissez la plaque sur de la glace et centrifugez-la brièvement.

Pour préparer une solution tampon de préparation de banque fonctionnelle à partir du kit d’amplification du génome entier, pour chaque cellule, combinez deux microlitres de tampon de préparation de banque de cellules uniques 1X et un microlitre de solution de stabilisation de bibliothèque. Une lyse cellulaire adéquate et une fragmentation complète du génome sont essentielles afin de minimiser les biais lors de l’amplification du génome entier et d’assurer la préparation de banques de séquençage de haute qualité. En tant que tel, prenez soin d’effectuer ces étapes exactement comme écrit.

Retirez le film plastique du plat et ajoutez trois microlitres de solution dans chaque puits. Pipetez le contenu du puits de haut en bas pour mélanger, puis replacez le film plastique. Après avoir brièvement fait tourner la plaque, incubez les cellules à 95 degrés Celsius pendant deux minutes, puis refroidissez la plaque sur de la glace et centrifugez-la à nouveau brièvement.

Maintenant, retirez le film plastique, ajoutez un microlitre d’enzyme de préparation de bibliothèque dans chaque puits, et pipetez le contenu du puits de haut en bas pour mélanger, puis replacez le film plastique. Après avoir brièvement fait tourner la plaque, placez-la dans le thermocycleur et exécutez le programme suivant. Après avoir refroidi la plaque et donné un bref tournage, préparez un mélange d’amplification fonctionnel à partir du kit d’amplification du génome entier en combinant 48,5 microlitres d’eau, 7,5 microlitres de mélange principal d’amplification 10X et 5 microlitres d’ADN polymérase WGA, pour chaque cellule.

Gardez le mélange de travail sur de la glace. Retirez le film plastique de la plaque. Ajoutez 61 microlitres du mélange d’amplification de travail dans chaque puits, et pipetez le contenu de chaque puits de haut en bas pour mélanger, puis replacez le film plastique.

Centrifugez brièvement la plaque et le thermocycle comme suit. Séquencez les échantillons et effectuez l’analyse des données selon le protocole texte. Comme le montre cette figure, si l’amplification du génome entier réussit, l’échantillon apparaîtra comme un frottis sur un gel d’agarose.

Un frottis faible ou absent indique un échec de la réaction d’amplification et l’échantillon ne doit pas être séquencé. Comme le montre ici, l’analyse de la taille des fragments a été effectuée à l’aide de l’électrophorèse capillaire sur un analyseur de fragments. Les bibliothèques préparées avec succès auront une distribution assez uniforme de tailles de fragments de 150 à 900 paires de bases.

L’échec de la préparation de la bibliothèque entraînera une distribution asymétrique de la taille des fragments et ces bibliothèques ne doivent pas être séquencées. À l’aide du modèle de Markov caché et de la segmentation binaire circulaire, le génome de chaque cellule a été analysé en segments de nombre de copies estimé. Ce tableau montre les résultats superposés d’une seule cellule et révèle un gain sur le chromosome 10 de 67 à 130 mégabases, et un gain sur le chromosome 19 de 0 à 20 mégabases.

L’isolement et l’amplification du génome entier de cellules uniques peuvent et doivent être effectués en une seule journée. La préparation des banques de séquençage, le séquençage du génome entier et l’analyse des données peuvent ensuite être effectués selon un calendrier flexible. Lorsque l’isolement cellulaire et l’amplification du génome entier sont effectués correctement, et que l’analyse des données est effectuée rigoureusement comme décrit, les altérations du nombre de copies dépassant cinq mégabases peuvent être détectées avec une sensibilité et une spécificité élevées.

Bien que notre protocole décrit spécifiquement l’utilisation du séquençage de cellules uniques pour la détection des altérations du nombre de copies, des aspects de ce protocole, tels que l’isolement de cellules uniques et la préparation de banques, peuvent être appliqués pour détecter d’autres changements génomiques.