Name: Détection de Copy Number Transformations Utilisation unique cellule de séquençage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Découvrez le séquençage à cellule unique pour détecter les altérations de nombre de copies à l'échelle du mégabase. Cette méthode améliore la sensibilité et la spécificité par rapport aux approches cytologiques traditionnelles.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions Stuart Levine pour les commentaires sur ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health Grant GM056800 et Kathy et Curt Marble Cancer Research Fund à Angelika Amon et en partie par l&#39;Institut Koch de soutien Grant P30-CA14051. Angelika Amon est aussi un enquêteur du Howard Hughes Medical Institute et la Fondation Glenn pour la recherche biomédicale. KAK est soutenu par le NIGMS Training Grant T32GM007753.

<ol><li>Kahlem, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+Level+Alterations+Reflect+Gene+Dosage+Effects+Across+Multiple+Tissues+in+a+Mouse+Model+of+Down+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Transcript Level Alterations Reflect Gene Dosage Effects Across Multiple Tissues in a Mouse Model of Down Syndrome.</a> Genome Res. 14 (7), 1258-1267 (2004).</li>
<li>Torres, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Aneuploidy+on+Cellular+Physiology+and+Cell+Division+in+Haploid+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Effects of Aneuploidy on Cellular Physiology and Cell Division in Haploid Yeast.</a> Science. 317 (5840), 916-924 (2007).</li>
<li>Itsara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+Analysis+of+Large+Copy+Number+Variants+and+Hotspots+of+Human+Genetic+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Human+Gen%22%5BJournal%5D)">Population Analysis of Large Copy Number Variants and Hotspots of Human Genetic Disease.</a> Am. J. Human Gen. 84 (2), 148-161 (2009).</li>
<li>Sudmant, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+diversity%2C+population+stratification%2C+and+selection+of+human+copy-number+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global diversity, population stratification, and selection of human copy-number variation.</a> Science. 349 (6253), aab3761(2015).</li>
<li>Navin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+tumor+progression+from+genomic+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Inferring tumor progression from genomic heterogeneity.</a> Genome Res. 20 (1), 68-80 (2010).</li>
<li>Torres, L., Ribeiro, F. R., Pandis, N., Andersen, J. A., Heim, S., Teixeira, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+genomic+heterogeneity+in+breast+cancer+with+clonal+divergence+between+primary+carcinomas+and+lymph+node+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+cancer+res+and+treat%22%5BJournal%5D)">Intratumor genomic heterogeneity in breast cancer with clonal divergence between primary carcinomas and lymph node metastases.</a> Breast cancer res and treat. 102 (2), 143-155 (2007).</li>
<li>Yates, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subclonal+diversification+of+primary+breast+cancer+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing.</a> Nat. Med. 21 (7), 751-759 (2015).</li>
<li>Forsberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+somatic+structural+changes+in+the+nuclear+genome+of+human+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Human+Gen%22%5BJournal%5D)">Age-related somatic structural changes in the nuclear genome of human blood cells.</a> Am. J. Human Gen. 90 (2), 217-228 (2012).</li>
<li>Laurie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detectable+clonal+mosaicism+from+birth+to+old+age+and+its+relationship+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Gen%22%5BJournal%5D)">Detectable clonal mosaicism from birth to old age and its relationship to cancer.</a> Nat. Gen. 44 (6), 642-650 (2012).</li>
<li>Jacobs, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detectable+clonal+mosaicism+and+its+relationship+to+aging+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Gen%22%5BJournal%5D)">Detectable clonal mosaicism and its relationship to aging and cancer.</a> Nat. Gen. 44 (6), 651-658 (2012).</li>
<li>Knouse, K. A., Wu, J., Whittaker, C. A., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+sequencing+reveals+low+levels+of+aneuploidy+across+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Single cell sequencing reveals low levels of aneuploidy across mammalian tissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (37), 13409-13414 (2014).</li>
<li>Knouse, K. A., Wu, J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+megabase-scale+somatic+copy+number+variation+using+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Assessment of megabase-scale somatic copy number variation using single-cell sequencing.</a> Genome Res. 26 (3), 376-384 (2016).</li>
<li>Nextera XT DNA Library Preparation Kit. at. , at: 
 <a target="_blank" href="http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html">http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html</a> (2016).</li>
<li>Advanced Analytical Fragment Analyzer. , at: 
 <a target="_blank" href="http://aati-us.com/product/fragment-analyzer">http://aati-us.com/product/fragment-analyzer</a> (2016).</li>
<li>KAPA Library Quantification Kit. , at: 
 <a target="_blank" href="https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/">https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/</a> (2016).</li>
<li>Illumina HiSeq 2000. , at: 
 <a target="_blank" href="http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_instruments/hiseq_2000.html">http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_instruments/hiseq_2000.html</a> (2016).</li>
<li>FASTX-Toolkit. , at: 
 <a target="_blank" href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a> (2016).</li>
<li>Burrows-Wheeler Aligner. , at: 
 <a target="_blank" href="http://bio-bwa.sourceforge.net/">http://bio-bwa.sourceforge.net/</a> (2016).</li>
<li>SAMTools. , at: 
 <a target="_blank" href="http://samtools.sourceforge.net/">http://samtools.sourceforge.net/</a> (2016).</li>
<li>HMMcopy. , at: 
 <a target="_blank" href="http://compbio.bccrc.ca/software/hmmcopy/">http://compbio.bccrc.ca/software/hmmcopy/</a> (2016).</li>
<li>DNAcopy. , at: 
 <a target="_blank" href="https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DNAcopy.html">https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DNAcopy.html</a> (2016).</li>
<li>Picard. , at: 
 <a target="_blank" href="http://broadinstitute.github.io/picard/">http://broadinstitute.github.io/picard/</a> (2016).</li>
<li>bedtools. , at: 
 <a target="_blank" href="http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/">http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/</a> (2016).</li>
<li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes%2C+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).</li>
<li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+neurons+and+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult neurons and neurospheres.</a> Nat. Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).</li>
<li>Navin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+evolution+inferred+by+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.</a> Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).</li>
<li>Szulwach, K. E., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Genetic+Analysis+Using+Automated+Microfluidics+to+Resolve+Somatic+Mosaicism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Genetic Analysis Using Automated Microfluidics to Resolve Somatic Mosaicism.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135007(2015).</li>
<li>Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Detection+of+Single-Nucleotide+and+Copy-Number+Variations+of+a+Single+Human+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Detection of Single-Nucleotide and Copy-Number Variations of a Single Human Cell.</a> Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).</li>
<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+evolution+in+breast+cancer+revealed+by+single+nucleus+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing.</a> Nature. 512 (7513), 155-160 (2014).</li>
<li>Zhang, C. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromothripsis+from+DNA+damage+in+micronuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromothripsis from DNA damage in micronuclei.</a> Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).</li>
<li>Macaulay, I. C., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Cell+Genomics%3A+Advances+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single Cell Genomics: Advances and Future Perspectives.</a> PLoS Genetics. 10 (1), e1004126(2014).</li>
<li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genome+sequencing%3A+current+state+of+the+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Gen%22%5BJournal%5D)">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nat. Rev. Gen. , 1-14 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Traditionnellement, l&#39;identification CNV et aneuploïdie au niveau des cellules individuelles requises méthodes cytologiques telles que FISH et SKY. Maintenant, le séquençage de la cellule unique a émergé comme une approche alternative pour ces questions. séquençage cellulaire unique a des avantages sur FISH et SKY car il est à la fois l&#39;ensemble du génome et de haute résolution. En outre, lorsque les méthodes de contrôle de la qualité appropriées sont appliquées, le séquençage de la cellule unique peut fournir une évaluation plus fiable du CNV et aneuploïdie comme il est pas sensible aux artefacts d&#39;hybridation et de propagation inhérents à FISH et SKY. Cependant, la plupart des applications récentes de séquençage de la cellule unique ne sont pas étayées par une évaluation approfondie de la sensibilité et la spécificité des méthodes et des analyses. En effet, certaines des approches analytiques utilisées par d&#39; autres études sont associés à des fréquences élevées (&gt; 50%) des faux positifs CNV appelle 12. L&#39;approche que nous décrivons a été rigoureusement testé en utilisant des cellules de knpropre fardeau CNV afin de déterminer les taux de découverte vrais et faux et d&#39; optimiser la sensibilité et la spécificité de la détection CNV 12. Utilisation du contrôle de la qualité et des approches analytiques décrites dans ce protocole, environ 20% des 5 gains Mb, 75% de 5 défaites Mb, et tout CNV dépassant 10 Mb peut être détectée. Bien que la détermination du taux de fausse découverte du séquençage d&#39;une seule cellule est difficile, nous avons estimé qu&#39;il soit inférieur à 25%. Ce protocole peut être appliqué à des cellules d&#39;une variété de sources, les scripts peuvent être modifiées pour ajuster la résolution de la détection NVC, ainsi que le protocole peut être adapté pour identifier d&#39;autres types d&#39;altérations génomiques. Il existe une variété de moyens de dissociation de tissus frais dans des cellules individuelles, et de nombreuses publications décrivent les procédures optimisées pour des tissus spécifiques, tels que la peau et le cerveau 24 25. Nous préférons pour isoler des cellules uniques par microaspiration car elle permet fo<html> r évaluation visuelle de chaque cellule à séquencer. Cependant, il est également possible d&#39;isoler des cellules uniques par fluorescence activée par tri cellulaire (FACS) 26 et 27 des dispositifs microfluidiques. Si l&#39;isolement d&#39;une cellule unique et l&#39;amplification du génome entier est effectuée manuellement, il est raisonnable d&#39;isoler et d&#39;amplifier jusqu&#39;à quarante cellules en une seule séance. Afin d&#39;obtenir des données de séquençage d&#39;une cellule unique de haute qualité, il est crucial que l&#39;amplification des génomes de cellules uniques est uniforme et complète. Nous constatons que la qualité des cellules individuelles isolées, ainsi que l&#39;efficacité de la lyse et l&#39;amplification a un impact significatif sur la qualité des données de séquençage. Par conséquent, les cellules doivent être récoltées à partir de leur environnement naturel, juste avant l&#39;isolement et l&#39;amplification du génome entier devrait commencer immédiatement après que les cellules sont isolées. En outre, l&#39;étape de lyse et de la fragmentation doit être suivie exactement comme décrit dans les étapes 2.3-2.6. &quot;&gt; Les algorithmes peuvent être ajustés pour changer la résolution de la détection CNV, avec des effets sur la sensibilité et la spécificité 12 opposées. Il est également possible d&#39;ajuster les seuils pour détecter l&#39; ensemble du chromosome aneuploïdie dans le cadre de tétraploïdie 11. Cependant, nous constatons que notre approche est limitée à la détection CNV supérieure à 5 Mb, comme le bruit introduit lors de l&#39; amplification du génome entier complique la détection de petites variantes 12. les améliorations futures dans les approches d&#39;amplification du génome entier devraient finalement augmenter la résolution de la détection CNV utilisant le séquençage d&#39;une seule cellule. Séquençage cellulaire unique permet une enquête non seulement des modifications du nombre de copies , mais aussi des variations de nucléotides simples 28, 29 et variation structurelle 30. Notre protocole d&#39;isolement d&#39;une cellule unique peut être appliqué pour répondre à ces autres Questions. Cependant, le choix de la méthode d&#39;amplification du génome entier dépend de l&#39;application spécifique. La méthode décrite dans ce protocole, qui est basé sur la réaction en chaîne de la polymérase, est le mieux adapté pour détecter le nombre de copies des modifications car elle est associée à des niveaux inférieurs de polarisation d&#39;amplification 32. Pour étudier d&#39; autres types d&#39;altérations génomiques, tels que des polymorphismes de nucléotides simples, d&#39; autres procédés d&#39;amplification du génome entier sont censés être plus appropriés 31, 32.

Les modifications du nombre de copies d&#39;ADN peuvent varier en taille de plusieurs paires de bases (nombre de copies variantes) (CNV) à des chromosomes entiers (aneuploïdie). Modifications du nombre de copies qui affectent les grandes régions du génome peuvent avoir des conséquences importantes phénotypiques en modifiant l&#39;expression de jusqu&#39;à des milliers de gènes 1, 2. CNV qui sont présents dans toutes les cellules d&#39;une population peut être détectée par un séquençage en masse ou des méthodes basées sur microréseaux 3, 4. Cependant, les populations peuvent également être génétiquement hétérogène, avec CNV existant dans un sous-ensemble de la population ou même des cellules individuelles. Hétérogénéité génétique est fréquente dans le cancer, entraînant l&#39; évolution de la tumeur et également présent dans les tissus normaux, avec des conséquences inconnues 5, 6, 7, 8, 9 <sup&gt;, 10. Traditionnellement, l&#39;hétérogénéité génétique a été évaluée soit par des approches cytologiques ou séquençage en vrac. Approches cytologiques, telles que l&#39; hybridation fluorescente in situ (FISH), les écarts de chromosomes, et caryotype spectral (SKY) dans, ont l&#39;avantage d&#39;identifier les altérations présentes dans les cellules individuelles , mais ont des taux d&#39;erreur élevés dus à des artefacts d&#39;hybridation et de propagation 11. Ces approches sont également limitées dans leur nombre de copies résolution uniquement révélant des changements sur plusieurs mégabases. Séquençage ou microarrays d&#39;ADN en vrac, bien plus élevé dans la précision et la résolution, est moins sensible. Afin de détecter l&#39;hétérogénéité génétique par des approches basées sur la population, les variantes doivent être présents dans une fraction substantielle des cellules dans la population. L&#39;émergence des procédés pour amplifier l&#39;ADN génomique à partir de cellules individuelles a permis de séquencer le génome des cellules individuelles. Seule cellule sequencing présente les avantages de haute résolution, haute sensibilité, et, lorsque les méthodes de contrôle de la qualité appropriées sont appliquées, de haute précision 12. Ici, nous décrivons un procédé de détection mégabases échelle du nombre de copies des altérations dans des cellules individuelles. Nous isolons des cellules individuelles par microaspiration, amplifier l&#39;ADN génomique en utilisant linker-adaptateur PCR, préparer des banques pour le séquençage de prochaine génération, et de détecter le nombre de copies des variantes à la fois par le modèle de Markov caché et la segmentation circulaire binaire.

<table><tbody><tr><td>Ensembles de tubes d’aspirateur pour pipettes microcapillaires calibrées</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Tube PVC (ID 3/16 », OD 5/16 », ~1 pied)</td><td>Tube PVC VWR</td><td>89068-500</td><td></td></tr><tr><td>(ID 5/16 », OD 7/16 », ~6 pouces)</td><td>VWR</td><td>89068-508</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue Acrodisc avec membrane HT Tuffryn (diamètre 25 mm, taille des pores 0,2 &micro ; m)</td><td>VWR</td><td>28144-040</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique (5 mL)</td><td>BioExpress</td><td>P-2837-5</td><td>Toute pipette en plastique de 5 mL devrait suffire</td></tr><tr><td>Piège à eau en ligne pour l’utilisation d’oxygène</td><td>Amazon.com</td><td>700220210813</td><td></td></tr><tr><td>Tubes capillaires à point de fusion (ID 0,8-1,1 mm, longueur 100 mm)</td><td>VWR</td><td>34502-99</td><td></td></tr><tr><td>Pâte à modeler</td><td>VWR</td><td>470156-850</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri (150 mm de diamètre)</td><td>VWR</td><td>25384-326</td><td>La surface doit être non adhérente pour faciliter l’aspiration de cellules uniques</td></tr><tr><td>. PCR semi-jupe pleine hauteur 96 puits&nbsp ; Plaques</td><td>Bio-Rad</td><td>HSS9601 N’importe</td><td>quelle plaque de PCR à 96 puits devrait suffire</td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire à 96 puits</td><td>VWR</td><td>62406-081</td><td>Toute plaque de culture tissulaire à 96 puits devrait suffire</td></tr><tr><td>GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit</td><td>Sigma</td><td>WGA4</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'A' Film</td><td>Bio-Rad</td><td>MSA5001</td><td></td></tr><tr><td>Mini spinner à plaques</td><td>Thomas Scientific</td><td>1225Z37</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096&nbsp ;</td><td>N’importe quel thermocycleur devrait suffire tant qu’il peut accueillir une plaque PCR à 96 puits</td></tr><tr><td>Agencourt Ampure Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2 Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>Toute bande de tube magnétique similaire devrait suffire Nextera</td></tr><tr><td>XT DNA Library Preparation Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1012</td><td></td></tr><tr><td>Kit complet (optimisé pour Roche LightCycler 480)</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4845&nbsp ;</td><td>Ce kit est optimisé pour la machine de PCR en temps réel Roche LightCycler 480. Si vous utilisez une autre machine, remplacez-la par un kit optimisé pour votre machine.</td></tr></tbody></table>

détection de copy number transformations utilisation unique cellule de séquençage

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Détection des changements génomiques à la résolution de la cellule unique est important pour la caractérisation de l&#39;hétérogénéité génétique et l&#39;évolution dans les tissus normaux, les cancers et les populations microbiennes. Les méthodes classiques d&#39;évaluation de l&#39;hétérogénéité génétique a été limitée par la faible résolution, la faible sensibilité et / ou une faible spécificité. séquençage cellulaire unique a émergé comme un outil puissant pour détecter l&#39;hétérogénéité génétique avec une haute résolution, une sensibilité élevée et, lorsqu&#39;elles sont analysées de manière appropriée, une spécificité élevée. Ici, nous fournissons un protocole pour l&#39;isolement, l&#39;amplification du génome complet, le séquençage et l&#39;analyse des cellules individuelles. Notre approche permet l&#39;identification fiable des variantes du nombre de copies megabase échelle dans des cellules individuelles. Cependant, certains aspects de ce protocole peuvent également être appliquées pour enquêter sur d&#39;autres types d&#39;altérations génétiques dans des cellules individuelles.

L&#39;aspirateur assemblé doit ressembler à celle de la figure 1A. L&#39;aiguille doit être établie de telle sorte qu&#39;elle est suffisamment large pour accueillir une seule cellule, mais pas si grand qu&#39;un volume est établi avec la cellule unique. Aspiration des cellules individuelles est plus facile quand il y a entre un et cinq cellules dans un champ 10X (figure 1B). Si l&#39; amplification du génome entier est réussie, l&#39;échantillon apparaîtra comme un frottis sur un gel d&#39; agarose (figure 2, lignes 1, 2, 4, 5, 6 et 7). Un frottis faible ou absent indique une réaction d&#39;amplification a échoué et l&#39;échantillon ne doit pas être séquencée (figure 2, pistes 3 et 8). Après la préparation de bibliothèque, la distribution de la taille des fragments des échantillons doit être évalué par électrophorèse capillaire sur un analyseur de fragment.Avec succès les bibliothèques préparées ont une distribution plutôt même des tailles de fragment de 150 à 900 pb (figure 3, A, B). Préparation de la bibliothèque Échec se traduira par une distribution asymétrique de la taille des fragments et ces bibliothèques ne doit pas être séquencés (figure 3C). Le traitement des données de séquençage au moyen du modèle de Markov caché (HMMcopy) et segmentation binaire circulaire (DNAcopy) va analyser le génome de chaque cellule en segments d&#39;un nombre de copies estimé. Ces segments peuvent ensuite être filtrés pour identifier ceux avec un nombre de copies estimé compatible avec le gain ou la perte d&#39;une seule cellule (tableau 1). Ces segments filtrés de HMMcopy et DNAcopy devraient ensuite être superposées pour identifier haute confiance CNV. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig1.jpg" /> Figure 1. isolement cellulaire unique. (<html> A) Une assemblée microaspirator. (B) champ A 10X montrant dissocié les cellules (flèches) et aiguille microaspirator (coin inférieur droit). Aspiration des cellules individuelles est plus facile quand il y a entre un et cinq cellules dans un champ 10X. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55143/55143fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig2.jpg" /> Figure 2. génome entier amplification. Agarose électrophorèse sur gel de 5 pi de produits entiers d&#39;amplification du génome. Les échantillons qui amplifient avec succès apparaîtra comme frottis lumineux de 100 pb à 1 kb (pistes 1, 2, 4, 5, 6 et 7) et peut être séquencée. Les échantillons qui n&#39;amplifient pas correctement produira des frottis faibles ou pas de frottis (voies 3 et 8) et ne doit pas être séquencés.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="figure 3" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig3.jpg" /> Figure 3. Préparation Bibliothèque. Les résultats représentatifs d&#39;un analyseur de fragment. Les graphiques montrent la taille des fragments (en pb) sur l&#39;axe X et les unités de fluorescence relative (RFU) sur l&#39;axe des ordonnées. A droite de chaque graphique est une voie de gel simulé. (A) Résultats pour un échantillon idéal, avec une répartition uniforme entre 150 et 900 pb et sans pics ou polarisation vers un côté coupants. Cet échantillon est acceptable pour le séquençage. (B) Les résultats d&#39;une échantillon correct, avec une distribution de taille biaisés vers des tailles de fragments inférieurs. Bien que ce soit pas optimal, l&#39;échantillon peut encore être séquencée. (C) Résultats d&#39;un échantillon a échoué, avec prédominance de petites tailles de fragments. Ceci est probablement dû à une incubation prolongée au cours de l&#39;étape de tagmentationpréparation de bibliothèque. Cet échantillon ne doit pas être séquencé. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55143/55143fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="7"> HMMcopy </td></tr><tr><td> Échantillon </td><td> Segment </td><td> Chr </td><td> Début </td><td> Fin </td><td> Etat </td><td> Médian </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 23 </td><td> CHR8 </td><td> 144500001 </td><td> 146500000 </td><td> 6 </td><td> 0.5008794 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 29 </td><td> chr10 </td><td> 67000001 </td><td> 134500000 </td><td> 6 </td><td> 0.4031945 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 52 </td><td> chr19 </td><td> 1 </td><td> 20000000 </td><td> 6 </td><td> 0.4616884 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 57 </td><td> Chry </td><td> 1 </td><td> 59500000 </td><td> 2 </td><td> -1,506532 </td></tr><tr><td colspan="8"> DNAcopy </td></tr><tr><td> Échantillon </td><td> Chrom </td><td> Démarrer bin </td><td> Fin bin </td><td> Début </td><td> Fin </td><td> moyenne Seg </td><td> med Seg </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chr10 </td><td> 88 </td><td> 197 </td><td> 62612945 </td><td> 129971511 </td><td> 1.4688 </td><td> 0,157 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chr19 </td><td> 0 </td><td> 31 </td><td> 0 </td><td> 28416392 </td><td> 1,4141 </td><td> 0,1674 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> CHRX </td><td> 77 </td><td> 126 </td&gt; <td> 51659160 </td><td> 95343369 </td><td> 1.3548 </td><td> 0,1874 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> Chry </td><td> 0 </td><td> 14 </td><td> 0 </td><td> 23805358 </td><td> -2,7004 </td><td> 0,3591 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Analyse des données. segments Filtré générés par HMMcopy et DNAcopy à partir d&#39;une seule cellule. Chevauchement ces deux résultats révèle un gain sur le chromosome 10 de 67 à 130 Mb ainsi qu&#39;un gain sur le chromosome 19 de 0 à 20 Mb. Nous avons constaté que les gains sur la partie proximale du chromosome 19 sont un artefact de séquençage d&#39;une seule cellule 12.

séquençage cellulaire unique est un outil de plus en plus populaire et accessible pour aborder les changements génomiques à haute résolution. Nous fournissons un protocole qui utilise le séquençage d&#39;une cellule unique pour identifier des altérations du nombre de copies dans des cellules individuelles.

Détection de Copy Number Transformations Utilisation unique cellule de séquençage

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

L'objectif général de cette procédure est d'identifier des altérations du nombre de copies d'ADN à l'échelle du mégabase dans des cellules individuelles. Afin de catégoriser l'hétérogénéité génomique au sein des populations cellulaires, il est nécessaire d'identifier les modifications génomiques à une résolution au niveau de la cellule unique. Traditionnellement, cela était réalisé à l'aide d'approches cytologiques ; toutefois, ces méthodes présentaient des limites en termes de sensibilité et de spécificité.Le séquençage à une cellule unique peut détecter une variété de modifications génomiques, avec une sensibilité et une spécificité accrues par rapport aux approches antérieures, mais uniquement lorsqu'il est soigneusement exécuté. Ici, nous décrivons comment utiliser le séquençage à une cellule unique pour détecter de façon fiable des altérations du nombre de copies à l'échelle du mégabase dans des cellules individuelles. Pour assembler le micro-aspirateur, commencez par retirer l'extrémité en plastique transparent de l'ensemble du tube aspirateur et insérez l'extrémité étroite dans une extrémité d'un tube en PVC d'un pied de longueur et d'un diamètre intérieur de 3/16e de pouce.Insérez l'extrémité de sortie d'un filtre à seringue de 0,2 micromètre dans l'autre extrémité d'un tube en PVC d'un pied de longueur et de 3/16e de pouce de diamètre intérieur. Ensuite, insérez l'extrémité d'entrée du filtre à seringue de 0,2 micromètre dans une extrémité d'un tube en PVC de six pouces de longueur et de 5/16e de pouce de diamètre intérieur. Cassez une pipette sérologique en plastique de cinq millilitres au repère de un millilitre et insérez l'extrémité cassée dans l'extrémité ouverte du tube en PVC de 5/16e de pouce de diamètre intérieur.Ensuite, insérez l'extrémité de la pipette serologique en plastique de cinq millilitres dans l'extrémité flexible d'un ensemble de tube à pipeter, puis utilisez un tube en plastique stérile pour recouvrir l'embout buccal rouge de l'ensemble pour le stockage. Étirez un tube capillaire en verre jusqu'à un diamètre intérieur de 10 à 30 micromètres en plaçant le milieu du tube près d'une flamme et en appliquant une tension aux deux extrémités du tube. Cassez le tube étiré en deux moitiés pour obtenir deux aiguilles aspiratoires potentielles.Répétez cette étape avec plusieurs tubes afin de vous assurer qu’un nombre suffisant d’aiguilles est préparé avec un diamètre interne approprié pour sélectionner des cellules individuelles. Pour préparer les cellules adhérentes, telles que les lignées cellulaires de fibroblastes humains, récoltez les cellules par trypsination et transférez-les dans un tube conique contenant le milieu approprié. Préparez une hotte pour l’amplification du génome entier en utilisant une solution d’eau de Javel à 10 % pour vaporiser la surface de la hotte, les boîtes de pointes de pipette et les pointes de pipette.Ensuite, utilisez une serviette en papier pour les essuyer tous avant de répéter le lavage avec de l’éthanol à 70 %. Ajoutez huit microlitres d’eau du kit d’amplification du génome entier, ou WGA, dans des puits individuels d’une plaque PCR à 96 puits. Puis recouvrez la plaque PCR à 96 puits avec un couvercle de plaque de culture tissulaire à 96 puits, et placez la plaque sur de la glace.Ensuite, ajoutez 1 000 cellules à 10 millilitres de milieu ou de PBS dans une boîte de Pétri de 15 centimètres et placez la boîte sur de la glace pour empêcher les cellules d'adhérer à la boîte. Puis, toujours sur glace, transférez les cellules dans la boîte de Pétri et la plaque PCR 96 puits vers un microscope optique équipé d'un objectif 10X. Augmentez l'ouverture de l'aiguille d'aspiration en tapotant doucement l'extrémité étirée de l'aiguille sur une surface dure afin que la pointe se brise.Insérez ensuite l'extrémité large de l'aiguille dans l'extrémité transparente du micro-aspirateur. Placez ensuite la boîte de Pétri contenant les cellules sur la platine du microscope. Insérez l'embout buccal rouge de l'aspirateur dans la bouche.Ensuite, tout en utilisant une main pour déplacer l'aiguille d'aspiration et l'autre main pour déplacer la boîte de Pétri, identifier les cellules individuelles à séquencer. À l'aide d'une aspiration buccale, aspirer une cellule unique dans l'aiguille d'aspiration avec environ un à deux microlitres de milieu ou de PBS. Transférer la cellule dans les huit microlitres d'eau contenus dans un puits individuel d'une plaque PCR 96-puits.La qualité et l'utilité des données de séquençage à une cellule unique dépendent de l'état de chaque cellule et de son génome ; par conséquent, manipulez avec précaution les cellules lors de la préparation et de la micro-aspiration afin d'isoler des cellules viables et non apoptotiques. Après avoir aspiré chaque cellule et transféré celle-ci dans un puits de la plaque PCR, marquez le puits ayant reçu une cellule. Répétez cette opération pour le nombre souhaité de cellules.Entre-temps, décongeler le tampon de lyse et de fragmentation 10X pour cellules uniques provenant du kit d'amplification du génome entier. Pour éviter toute contamination pendant l'amplification du génome entier, ajouter tous les réactifs à l'intérieur d'une hotte de culture tissulaire. Utiliser des pointes de pipette munies de filtres et changer la pointe de pipette entre chaque puits.Pour chaque série de 32 cellules au maximum, mélanger 32 microlitres de tampon de lyse et de fragmentation 10X pour cellules uniques et deux microlitres de solution de protéinase K dans un tube de microcentrifugeuse, puis vortexer le tube pour homogénéiser le contenu. Ajouter un microlitre de la solution dans chaque puits et pipeter plusieurs fois vers le haut et vers le bas pour bien mélanger. Couvrir la plaque et sceller tous les puits avec un film plastique.Ensuite, centrifuger brièvement la plaque dans une mini-centrifugeuse à plaques. Puis, faire passer la plaque dans le thermocycleur en utilisant le programme suivant. Ensuite, refroidir la plaque sur de la glace et la centrifuger brièvement.Pour préparer une solution tampon de préparation de bibliothèque working à partir du kit d'amplification du génome entier, combiner, pour chaque cellule, deux microlitres de tampon de préparation de bibliothèque 1X pour cellule unique et un microlitre de solution de stabilisation de bibliothèque. Une lyse cellulaire adéquate et une fragmentation complète du génome sont essentielles afin de minimiser les biais lors de l'amplification du génome entier et de garantir la préparation de bibliothèques de séquençage de haute qualité. Par conséquent, veiller à exécuter ces étapes exactement comme indiqué.Retirez le film plastique du plateau et ajoutez trois microlitres de la solution dans chaque puits. Passez le contenu du puits plusieurs fois dans la pipette pour bien mélanger, puis remettez le film plastique. Après avoir fait tourner brièvement le plateau, incubez les cellules à 95 degrés Celsius pendant deux minutes, refroidissez ensuite le plateau sur de la glace et centrifugez de nouveau le plateau brièvement.Retirez maintenant le film plastique, ajoutez un microlitre d'enzyme de préparation de bibliothèque dans chaque puits, puis aspirez et expulsez le contenu du puits plusieurs fois pour homogénéiser. Remettez ensuite le film plastique en place. Après avoir effectué une brève centrifugation de la plaque, placez-la dans le thermocycleur et exécutez le programme suivant. Une fois la plaque refroidie, effectuez une nouvelle brève centrifugation, puis préparez un mélange d'amplification working à partir du kit d'amplification complète du génome en combinant, pour chaque cellule, 48,5 microlitres d'eau, 7,5 microlitres de mélange maître d'amplification 10X et 5 microlitres de polymérase WGA.Gardez le mélange de travail sur de la glace. Retirez le film plastique de la plaque. Ajoutez 61 microlitres du mélange d'amplification de travail dans chaque puits, puis pipetez le contenu de chaque puits plusieurs fois pour homogénéiser, puis remettez le film plastique en place.Faire une courte centrifugation de la plaque, puis effectuer le thermocyclage selon les étapes suivantes. Séquencer les échantillons et réaliser l'analyse des données conformément au protocole décrit. Comme illustré sur cette figure, si l'amplification du génome entier est réussie, l'échantillon apparaîtra sous forme d'une trainée diffuse sur un gel d'agarose.Une traînée faible ou absente indique un échec de la réaction d'amplification, et l'échantillon ne doit pas être séquencé. Comme illustré ici, l'analyse des tailles de fragments a été réalisée par électrophorèse capillaire sur un analyseur de fragments. Les bibliothèques correctement préparées présenteront une distribution relativement uniforme des tailles de fragments allant de 150 à 900 paires de bases.Une préparation ratée de la bibliothèque entraînera une distribution biaisée des tailles de fragments, et de telles bibliothèques ne doivent pas être séquencées. À l'aide du modèle de Markov caché et de la segmentation binaire circulaire, le génome de chaque cellule a été divisé en segments de nombre de copies estimé. Ce tableau présente les résultats superposés d'une cellule unique et révèle un gain sur le chromosome 10 entre 67 et 130 mégabases, ainsi qu'un gain sur le chromosome 19 entre 0 et 20 mégabases.L'isolement et l'amplification du génome complet de cellules uniques peuvent et doivent être réalisés en une seule journée. La préparation des banques de séquençage, le séquençage du génome complet et l'analyse des données peuvent ensuite être effectués selon un calendrier flexible. Lorsque l'isolement cellulaire et l'amplification du génome complet sont correctement réalisés, et que l'analyse des données est menée rigoureusement comme décrit, des altérations du nombre de copies dépassant cinq mégabases peuvent être détectées avec une grande sensibilité et spécificité.Bien que notre protocole décrive spécifiquement l'utilisation du séquençage en simple cellule pour la détection de modifications du nombre de copies, certaines étapes de ce protocole, telles que l'isolement des cellules uniques et la préparation des bibliothèques, peuvent être appliquées pour détecter d'autres modifications génomiques.

detection-of-copy-number-alterations-using-single-cell-sequencing

Research

Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

Nous décrivons la préparation de banques d'ADN code-barres et ultérieure capture d'exon base hybridation pour la détection de mutations clés associés au cancer dans des échantillons de tumeurs cliniques par séquençage massivement parallèle "prochaine génération". Séquençage de l'exon ciblée offre les avantages d'un débit élevé, faible coût, et la couverture de séquence profond, donnant ainsi une grande sensibilité pour la détection de mutations de basse fréquence.

Détecter des altérations génétiques somatiques dans des échantillons de tumeurs par Exon et le séquençage massivement parallèle

CGH array pour la détection des variantes du nombre de copies génomiques a remplacé l'analyse du caryotype G-bandes. Cet article décrit la technologie et son application dans un laboratoire de services de diagnostic.

Tableau hybridation génomique comparative (CGH array) pour la détection des variantes génomiques du nombre de copies

Nous présentons ici des gouttelettes adressable microarrays (SMA), une méthode de tableau basé de gouttelettes en mesure de déterminer l’abondance absolue de protéine dans des cellules individuelles. Nous démontrent la capacité des SMA pour caractériser l’hétérogénéité dans l’expression de la tumeur suppresseur protéine p53 dans une lignée de cellules cancéreuses humaines.

Comptage des protéines dans des cellules individuelles avec gouttelettes adressable Microarrays

Cet article décrit une technique de détection des mutations de basse fréquence dans ADNct, ER-suiv. Cette méthode se distingue par son utilisation unique de correction d’erreur bidirectionnelle, un fond spécial filtre et acquisition moléculaire efficace.

Détection des Mutations rares dans ADNct à l’aide de prochaine génération séquençage

Ce manuscrit décrit l’analyse de variation numéro de copie exécutée dans l’ADN de sérum ou de plasma à l’aide de la méthode PCR en temps réel. Cette méthode convient pour la prédiction de la pharmacorésistance chez des patients de cancer de la prostate résistant à la castration, mais ça pourrait être instructif aussi pour d’autres maladies.

Sérum et Plasma copie numéro détection par PCR en temps réel

Le manuscrit décrit une puce numérique PCR pour détecter une variante rare du transcript CDH1 (CDH1a) en mode normal frais-congelé et tissus tumoraux obtenus de patients atteints de cancer gastrique.

Détection d’une variante de transcription Rare CDH1 dans les tissus frais congelés de Cancer gastrique par puce numérique PCR

Le séquençage de prochaine génération (NGS) est un outil puissant pour la caractérisation génomique qui est limité par le taux élevé d’erreurs de la plateforme (~0.5–2.0%). Nous décrivons nos méthodes de séquençage de l’erreur-corrigé qui nous permettent d’éviter le taux d’erreur NGS et détecter les mutations aux fractions d’allèle variant aussi rares que 0,0001.

Détection des événements rares en utilisant l’erreur corrigée ADN et le séquençage de l’ARN

Cet article décrit une méthode pour identifier des altérations clonales et subclonales parmi différents spécimens d'un patient donné. Bien que les expériences décrites ici se concentrent sur un type spécifique de tumeur, l'approche est largement applicable à d'autres tumeurs pleines.

Analyse comparative des lésions par une approche de séquençage ciblée

Le protocole présente l’ensemble des procédures en laboratoire requises pour les tests génétiques préimplantatoires pour l’aneuploïdie sur une plate-forme de séquençage de nouvelle génération à base de semi-conducteurs. Nous présentons ici les étapes détaillées de l’amplification du génome entier, de la sélection des fragments d’ADN, de la construction de la bibliothèque, de la préparation du modèle et du flux de travail de séquençage avec des résultats représentatifs.

Test génétique préimplantatoire pour l’aneuploïdie sur une plateforme de séquençage de nouvelle génération à base de semi-conducteurs

Nous présentons ici un protocole pour mesurer le nombre absolu de copies d’ADN mitochondrial (mt) et les niveaux d’hétéroplasmie de délétion de l’ADNmt dans des cellules individuelles.

Mesure du nombre de copies d’ADN mitochondrial unicellulaire et de l’hétéroplasmie à l’aide d’une réaction en chaîne par gouttelettes numériques par polymérase

Ce protocole décrit un flux de travail de séquençage de nouvelle génération automatisé et accrédité par ISO15189 pour détecter les altérations génomiques ciblables dans les tissus contenant de la paraffine fixée au formol pour le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC).

Détection d’altérations ciblables dans le cancer du poumon non à petites cellules à l’aide du séquençage de nouvelle génération

Découvrez le séquençage à cellule unique pour détecter les altérations de nombre de copies à l'échelle du mégabase. Cette méthode améliore la sensibilité et la spécificité par rapport aux approches cytologiques traditionnelles.

Détection de Copy Number Transformations Utilisation unique cellule de séquençage

Explorer plus de vidéos