Démêler la fonction d'un effecteur bactérien à partir d'un non-cultivable Pathogen usine utilisant une levure de l'écran à deux hybrides

L'objectif général de cette procédure est de dévoiler les stratégies de virulence et les systèmes hôte-pathogène en identifiant l'interaction entre une protéine effectrice de candidatus phytoplasma malefactor et des protéines hôtes provenant de Malus domestica. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans de nombreux domaines de recherche biologique et est utilisée ici en recherche végétale pour élucider les mécanismes moléculaires à l'origine du développement de la maladie de la prolifération du pommier. Le principal avantage de cette technique est qu'un seul effecteur pathogène peut être criblé contre des milliers d'interacteurs potentiels, ce qui en fait un point de départ facilement réalisable dans la recherche sur les infections.

Pour commencer, identifiez les arbres infectés présentant des symptômes spécifiques de la prolifération du pommier ainsi que les arbres témoins sans symptôme. À l’aide de sécateurs propres, prélèvez des échantillons de racines sur trois sites différents du système racinaire, ayant un diamètre de 0,5 à 1 cm et une longueur d’environ 5 cm. Placez les échantillons de racines dans des sacs en plastique correctement étiquetés.

Ensuite, placer les échantillons dans une boîte froide avec des accumulateurs de froid prérefroidis et les conserver à quatre degrés Celsius jusqu'au traitement ultérieur. Rincer les échantillons de racines à l'eau pour éliminer la terre. Puis transférer les échantillons dans une boîte de Petri stérile et utiliser un scalpel stérilisé pour enlever l'épiderme racinaire et le cortex.

Avec un tissu propre et sans peluches, essuyez le scalpel. Ensuite, plongez l'instrument dans de l'éthanol à 70 % et stérilisez-le à la flamme. Utilisez le scalpel pour gratter le phloème.

Hachez l'échantillon en petits morceaux et aliquotez 30 à 100 milligrammes de ces morceaux dans un tube réactionnel stérile de deux millilitres. Conservez les échantillons à 80 degrés Celsius ou utilisez-les immédiatement pour isoler l'ADN, qui servira de matrice pour l'amplification du gène effecteur et le clonage ultérieur de l'effecteur dans le vecteur appât. Après avoir isolé l'ADN polyspécifique de phytoplasmes à partir d'arbres infectés, procédez au clonage dans des vecteurs appât et vérifiez l'auto-activation et l'expression conformément au protocole décrit dans le texte.

Étaler la souche effectrice plex A ATP 00189 transformée NMY51 sur une nouvelle boîte de Petri SD-trp et l'incuber à 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours, jusqu'à l'apparition de colonies rouges. Utiliser une colonie rouge provenant de la boîte gélosée pour ensemencer trois millilitres de milieu SD-trp dans un petit flacon agité, puis incuber la culture toute la nuit à 30 degrés Celsius sous agitation à 120-150 tours par minute. Le jour suivant, ensemencer 20 millilitres de milieu SD-trp dans un flacon agité avec un millilitre de la culture de nuit et laisser croître pendant huit heures.

Utilisez le milieu SD-trp pour ajuster la culture à une DO600 de 0,2, puis inoculez deux flacons contenant chacun 100 millilitres de milieu SD-trp avec dix millilitres de cette culture. Incubez les cultures à 30 degrés Celsius avec agitation pendant la nuit. Ensuite, mesurez la DO600 de la culture et récupérez par centrifugation 120 unités de DO600.

Par exemple, si une DO600 de 1,2 est mesurée, centrifuger 100 millilitres d'échantillon, éliminer le surnageant et utiliser 800 millilitres de 2xYPAD préchauffé pour resuspendre le culot dans deux flacons d'agitation, puis incuber à 30 degrés Celsius. Incuber la culture de levure à 30 degrés Celsius et 120 à 150 tours par minute. Mesurer la DO600 toutes les 1,5 heures environ selon le protocole décrit jusqu'à l'obtention d'une DO600 de 0,6.

Après avoir préparé l'ADN de sperme de saumon, le Te Lithium OAc et le PEG Lithium OAc selon le protocole indiqué dans le texte, centrifuger 800 millilitres de culture de levure à 700 x g pendant cinq minutes afin de former un culot cellulaire. Éliminer le surnageant et resuspendre les culots dans un volume total de 200 millilitres d'eau stérile doublement distillée. Puis reprendre la centrifugation pour former un nouveau culot cellulaire et jeter le surnageant.

Resuspendre le culot dans 16 millilitres de mélange Te Lithium OAc et centrifuger à nouveau l'échantillon. Ensuite, après avoir éliminé le surnageant, utiliser 9,6 millilitres de Te Lithium OAc pour resuspendre le culot. Dans des récipients réactionnels de taille appropriée, préparer douze vials contenant sept microgrammes de la bibliothèque vectorielle d'ADN Add HAC au pic, 100 microlitres d'ADN de sperme de saumon à 2 % et 2,5 millilitres de mélange PEG Lithium OAc.

Ajouter 600 microlitres de la suspension de cellules de levure préparée précédemment dans chacun des douze flacons et mélanger vigoureusement pendant une minute. Incuber ensuite les réactions dans un bain-marie à 30 degrés Celsius pendant 45 minutes en mélangeant toutes les 15 minutes. Ajouter ensuite 160 microlitres de DMSO dans chaque flacon et mélanger vigoureusement.

Incubez ensuite les tubes à 42 degrés Celsius pendant 20 minutes supplémentaires. Après avoir centrifugé les cellules, éliminez le surnageant et utilisez trois millilitres de 2xYPAD pour resuspendre chaque culot. Rassemblez les cellules provenant des douze tubes dans un flacon de 100 millilitres pour agitateur et incubez la levure pendant 90 minutes à 30 degrés Celsius et 120 tours par minute.

Après l'incubation, après avoir centrifugé les cellules et éliminé le surnageant, utilisez une pipette serologique de dix millilitres et 4,5 millilitres de chlorure de sodium stérile à 0,9 % pour resuspendre complètement le culot en pipetant soigneusement plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Prélevez 50 microlitres de la suspension et utilisez du chlorure de sodium à 0,9 % pour préparer des dilutions dix fois successives allant de 1:10 à 1:1000. Ensuite, déposez 100 microlitres de chaque dilution sur des boîtes de Pétri de 90 millimètres contenant de l'agar SD-trp-leu.

Étaler le reste de la suspension de levure non diluée sur des boîtes de Pétri de 16x150 millimètres de diamètre contenant de l'agar SD-trp-leu-His-ade. Incuber les boîtes à 30 degrés Celsius pendant trois jours pour les boîtes SD-trp-leu et pendant quatre jours pour les boîtes SD-trp-leu-his-ade. Déterminer l'efficacité de transfection en comptant les colonies des différentes dilutions sérielles sur les boîtes de sélection SD-trp-leu.

Transférez chaque clone en utilisant une pointe de pipette stérile pour prélever et étaler la colonie sur des boîtes de culture sélectives fraîches SD-trp-leu-his-ade. Incubez les boîtes à 30 degrés Celsius pendant 24 heures. Répétez le transfert des clones chaque jour jusqu'à ce qu'un total de cinq passages soit atteint.

Pour analyser les clones, préparez sous une hotte stérile un tube réaction de deux millilitres stérile contenant un millilitre de SD-trp-leu-his-ade pour chaque clone. Utilisez une aiguille chauffée pour percer un trou dans chaque tube et recouvrez le trou avec un scellant perméable aux gaz. Inoculez chaque flacon avec du matériel de colonie fraîche provenant d'un clone et incubez les flacons à 30 degrés Celsius et 150 tours par minute pendant 24 heures.

Après avoir centrifugé les cellules et éliminé le surnageant, resuspendre le culot dans le tampon approprié et le transférer dans un nouveau tube réaction de deux millilitres. Ajouter 100 microlitres de billes de verre traitées à l'acide à la suspension et mélanger vigoureusement le tube pendant cinq minutes. Enfin, purifier l'ADN plasmidique selon le protocole décrit dans le texte.

Un résumé des résultats attendus du test d'auto-activation et de leur interprétation est fourni dans ce tableau et cette figure. Une faible auto-activation entraîne une croissance sur les milieux de sélection trp-leu-his, mais pas sur les milieux trp-leu-his-ade dépourvus de nutriments. En revanche, les levures transformées avec un appât fortement auto-activateur pousseraient sur un milieu privé de trp-leu-his-ade.

Une cotransformation réussie de l'appât et du partenaire est caractérisée par une croissance sur des plaques sélectives dépourvues de trp et de leu. L'interaction entre l'appât et une protéine partenaire conduit à une complémentation de l'auxotrophie his et ade de la souche NMY51. Voici un exemple d'interaction entre un appât et un partenaire dans une expérience de double hybride chez la levure. Les partenaires d'interaction de la plante hôte Malus domestica, MdTCP24 et MdTCP25, ont été identifiés, et l'interaction a été confirmée par une transformation *de novo* avec l'effecteur.

Une fois maîtrisée, la double hybride chez la levure peut être réalisée en une journée, à condition que tout le matériel et les équipements nécessaires, en particulier les levures, soient correctement préparés à l’avance. Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel d’éviter toute contamination et de toujours travailler dans des conditions stériles. Après cette procédure, une autre méthode indépendante doit être effectuée, comme par exemple la complémentation bimoléculaire de la fluorescence, afin de confirmer les interactions protéine-protéine observées.

Cela est particulièrement important car la levure ou l'hybride en tant que tel est relativement sujette à la production de résultats faussement positifs. Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans de nombreux domaines de recherche différents pour mieux comprendre les principes moléculaires impliqués dans les interactions entre protéines, notamment dans les interactions hôte-pathogène, ainsi que dans de nombreux autres domaines de recherche biologique. En outre, vous comprendrez que la mise en œuvre de cette méthode est facilement réalisable dans tout laboratoire de biologie moléculaire convenablement équipé.

N'oubliez pas que l'utilisation de certains produits chimiques, de scalpels et de flammes nues peut être extrêmement dangereuse ; ainsi, lors de la réalisation de cette procédure, vous devez toujours prendre certaines précautions. Cela signifie utiliser vos équipements de protection individuelle tels que les gants et les lunettes de protection, ainsi que les équipements généraux de sécurité en laboratoire.