Name: Démêler la fonction dun effecteur bactérien à partir dun non-cultivable Pathogen usine utilisant une levure de lécran à deux hybrides (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Découvrez comment identifier les interactions entre effecteurs bactériens et protéines hôtes chez Malus domestica grâce au double hybride dans la levure. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes moléculaires de la pathogénicité.

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Nous remercions Christine Kerschbamer, Thomas Letschka, Sabine Oettl, Margot Raffeiner et Florian Senoner du Centre de recherche Laimburg et Mirelle Borges Dias Schnetzer de Dualsystems Biotech AG pour le soutien technique et Julia Strobl pour la relecture du manuscrit. Ce travail a été réalisé dans le cadre du projet de APPL2.0 et a été partiellement financé par la Province autonome de Bozen / Bolzano, Italie et du Tyrol du Sud d&#39;Apple Consortium.

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Dans l&#39;écran de Y2H, la protéine effecteur potentiel est co-exprimé avec différentes protéines interagissant hypothétiques (étape 7). Chaque levure clone contient de plus en plus l&#39;appât, mais un (potentiellement) interacteur différent. Les protéines qui interagissent sont codés dans une banque d&#39;ADNc est clone dans des plasmides de proie. L&#39;appât et la proie plasmides chaque code co-cistronically pour une partie d&#39;un facteur de transcription de levure. Dans le cas d&#39;une interaction physique entre l&#39;appât (effecteur) et un interacteur codé par un plasmide proie, les deux parties de facteur de transcription (le domaine de liaison à l&#39;ADN et le domaine d&#39;activation) sont réunies, et l&#39;expression du gène rapporteur est induite. La levure est capable de croître sur des plaques de sélection SD et histidine adénine appauvrie. Le genre de banque d&#39;ADNc proie dépend de l&#39;effecteur tamisé et doit être choisie en conséquence. Le vecteur de proie et appât, ainsi que la souche de levure, doivent être compatibles. Dans cet écran, un ADN LexA domaine et le domai d&#39;activation Gal4 liaisonn ont été utilisés comme unités de facteur de transcription de levure compatibles. La banque d&#39;ADNc peut être construite individuellement, fabriqués sur mesure, ou obtenu dans le commerce. La préparation de la banque d&#39;ADNc proie ne fait pas partie de ce protocole. Dans ce protocole, une banque d&#39;ADNc normalisée auto-construit à partir de l&#39;ARN de feuilles Malus x domestica a été utilisé et clone dans pGAD-HA 41. L&#39;effecteur (appât) exprimant la souche de levure a été transformée avec la bibliothèque de proies, et les clones ont été sélectionnés sur des plaques de sélection SD et histidine adénine appauvrie. Pour extraire l&#39;ADN de plasmide à partir des colonies de levure, un ADN plasmidique mini kit à base de colonne pour les bactéries est recommandée en combinaison avec une étape de rupture mécanique en utilisant des billes de verre pour améliorer la lyse des levures (étape 8). Dans cette purification du plasmide, l&#39;appât et le vecteur proie sont purifiés simultanément à des concentrations relativement faibles. Cependant, la quantité d&#39;ADN plasmidique est suffisant pour identifier le partenaire d&#39;interaction par séquençage d&#39;esprithout propagation plasmidique avant (étape 8.4). En guise d&#39;alternative, l&#39;ADN a été purifié à l&#39; étape 8.4 peut être transformé dans des cellules compétentes E. coli et sélectionné avec des proies la résistance aux antibiotiques induite par vecteur (par exemple l&#39;ampicilline dans le cas de la pGAD-HA). Le E. coli choisi colonies ne transportent que la bibliothèque plasmidique pGAD-HA, et à haut rendement de purification de plasmide peut être effectué avec ces clones. La transformation réussie de pLexA-N et pGAD-HA constructions complète le tryptophane et la leucine auxotrophie de NMY51. Une interaction entre l&#39;effecteur et une protéine (codée sur pGAD-HA) conduit à l&#39;activation du système rapporteur dans NMY51 souches. Dans le cas de l&#39;auto-activation, NMY51 transformée avec l&#39;effecteur exprimant pLexA-N en combinaison avec la bibliothèque vecteur vide pGAD-HA se développe sur des plaques sélectives manquent trp-leu-his-ade, en raison de l&#39;activation involontaire du système rapporteur NMY51 40. L&#39;auto-activation peut être weak et peut se produire en l&#39;absence de trp-leu-son, ou l&#39;activation peut être forte et caractérisée par une croissance sur des plaques trp-leu-his-ade 41. Auto-activation peut causer un fond massif de clones faux positifs dans l&#39;écran réel de Y2H. Pour éviter cela, un test d&#39;auto-activation avec l&#39;appât doit être effectuée, dans lequel le vecteur d&#39;expression effecteur est co-transformée avec le vecteur vide bibliothèque. Dans ce cadre expérimental, l&#39;expression du gène rapporteur ne doit pas être induite. Si l&#39; auto-activation ( par exemple, la croissance sur des plaques sélectives) est visible lors de l&#39;essai, le milieu peut être complété avec des concentrations différentes de 3-amino-1,2,4-triazole 45 (3-AT). 3-AT est un inhibiteur de imidazoleglycerol-phosphate déshydratase (HIS3), une enzyme importante pendant 46 biosynthèse de l&#39; histidine. Supplémentation avec 3-AT peut réduire les effets faibles de l&#39; auto-activation pendant les écrans de Y2H 47,48. Différentes concentrations de 3-AT doivent être testés. Dans ce protocole, 1-40 mM de 3-AT ont été utilisées. La plus faible concentration qui conduit à la répression de l&#39;auto-activation doit être ensuite utilisée dans l&#39;écran de Y2H. Les plaques sélectives de l&#39;essai d&#39;auto-activation ne peuvent être évaluées si les plaques de SD-Trp-Leu de la co-transformation contiennent un nombre suffisant de clones. Comme ≥ indication 500 colonies par 90 mm (diamètre) boîte de Pétri sont suffisantes. Pour déterminer l&#39;efficacité de la transfection exacte, il est recommandé de préparer des dilutions en série de la levure co-transformée et les étalées sur des plaques de SD-Trp-Leu. Afin de réduire l&#39;auto-activation, l&#39;effecteur peut être clone dans pLexA-C, un vecteur d&#39;expression de l&#39;appât qui fusionne l&#39;étiquette LexA à l&#39;extrémité C-terminale de la protéine. L&#39;orientation du-A Lex tag peut atténuer l&#39; auto-activation 24. Cependant, on ne peut dans tous les cas à réduire ou supprimer l&#39;auto-activation. La formation decolonies rouges ou rougeâtres indique une interaction faible ou de faux positifs. Le gène rapporteur ADE2 de NMY51 est activé seulement en ce qui concerne une interaction protéine-protéine, ce qui bloque à son tour l&#39;accumulation d&#39;un colorant rouge dans cette souche de levure 40. En l&#39;absence d&#39;une interaction, NMY51 sont rougeâtres, tandis que les colonies portant interacteurs fortes sont blanches. L&#39;observation de la couleur des colonies sur les plaques de sélection fournit ainsi un autre indice important pour juger si les colonies respectives sont interacteurs TRUE- ou faux-positifs. Il est éventuellement nécessaire d&#39;adapter ou de modifier certains paramètres de l&#39;essai par rapport à la nature de l&#39;appât et les caractéristiques d&#39;interaction. A l&#39;heure actuelle, un certain nombre d&#39;améliorations et de techniques dérivées de la Y2H commune ont été mis en place pour permettre l&#39;analyse des interactions des protéines plutôt difficiles dans les systèmes hôtes différents. Un examen par Stynen et al. 49 adresses d&#39; unnd décrit les différents aspects de Y2H, ses améliorations et adaptations, et fournit des informations utiles sur la façon de choisir le test d&#39;interaction appropriée ainsi. écrans Y2H et techniques dérivées sont devenus largement utilisés dans les différents domaines de recherche, où l&#39;identification des interactions entre protéines binaires est nécessaire. Même si les contrôles critiques sont effectués, tels que des tests d&#39; auto-activation de l&#39;appât et un-à-un re-transformations des protéines interagissant identifiées, l&#39;Y2H est enclin à produire de faux résultats 26, 50, 51. La levure comme modèle ne convient pas à toutes les études d&#39;interaction. La levure ne constitue pas nécessairement un environnement cellulaire qui prend en charge la modification post-traductionnelle appropriée et pliage pour chaque protéine de 24. En outre, dans le cadre de Y2H, les protéines sont sur-exprimés, et leur expression est pas le contrôleconduits par leur promoteur naturel. Le Y2H force les partenaires d&#39;interaction protéinique du noyau, qui ne sont pas nécessairement leur destination subcellulaire naturel. Les circonstances cellulaires natives de l&#39;interaction peuvent donc pas être reflétés par la levure et peut conduire à des résultats faussement négatifs ou faussement positifs. La plupart des Y2H sont basées sur la levure auxotrophie complémentation comme un principe sélectif. Cette sélection nutritionnelle est caractérisée par une sensibilité élevée, mais au prix d&#39; une diminution de la sélectivité par rapport à d&#39; autres (par exemple, reporter chromogénique) Dosages 49. Si unreducible auto-activation (voir ci - dessus) ou d&#39; autres limitations se produisent pour un certain effecteur, l&#39;Y2H est pas un dosage approprié 25. Dans le tableau 1 et la figure 1, les résultats attendus du test d&#39; auto-activation sont donnés. L&#39;absence d&#39;interactions réelles (c. -à- faux négatifs) peut être causée par la toxicité de la protéine, la protéine de traduction incorrectetraitement, l&#39; encombrement stérique de l&#39;interaction, les partenaires d&#39;interaction sous - représentés dans la bibliothèque proie, la localisation de la membrane de l&#39;appât, ou manquants composants nécessaires à l&#39;interaction 24. Il est recommandé de novo amplifier le gène de pleine longueur de la protéine interagissant identifié à partir d&#39; ADNc, sous - cloner dans pGAD-HA, et d&#39; effectuer un essai d&#39;interaction one-to-one en transformant le pGAD-HA généré construction dans l&#39;appât exprimant souche NMY51. Ceci est nécessaire étant donné que l&#39;interacteur observé présent dans la bibliothèque de proies ne peut être un fragment d&#39;une protéine plus grande. Toutefois, les informations pour le gène de pleine longueur respective est accessible uniquement si les données considérables de séquence génomique et transcriptomique est disponible. Le protocole de transformation pour le dosage d&#39;auto-activation décrit ici peut être utilisé pour un tel test en un-à-un, et l&#39;interaction entre l&#39;amorce et la interacteur doit être reproductible. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Interactions identifiées dans un écran de Y2H doit toujours être confirmé par une autre technique indépendante. Cette technique indépendante doit être plus proche de l&#39;environnement naturel de la réelle interaction protéine-protéine. Dans le cas de l&#39;ATP_00189 phytoplasme effecteur, l&#39;interaction avec les facteurs de transcription TCP de Malus x domestica a été vérifiée in planta avec bimoléculaire complémentation fluorescent (BiFC) chez Nicotiana benthamiana protoplastes 28 (ne fait pas partie de ce protocole). La ATP_00189 de protéine effectrice a été dérivé de l&#39;agent pathogène de la plante P. Mali. Dans planta BiFC a donc choisi de vérifier les interactions avec les ATP_00189 x domestica facteurs de transcription Malus précédemment identifiés dans le 28 Y2H. BiFC est une interaction dosage protéine-protéine qui ne nécessite pas la translocation subcellulaire des protéines qui interagissent au noyau afin d&#39;activer le système rapporteur &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 52. En outre, les planta dans l&#39; expression et de la machinerie de modification imite l&#39;environnement de l&#39;interaction naturelle entre l&#39;effecteur bactérien de la plante dans son plante hôte. Cependant, un écran global à l&#39;aide BiFC est impossible. Il y a plusieurs étapes dans le protocole qui doit être soigneusement pris en compte. Lors de l&#39;amplification du gène d&#39;intérêt (étape 4), il est important d&#39;exclure que les amorces se lient à l&#39;ADN de la plante. Ainsi, l&#39;ADN à partir de plantes non infectées doit être incluse en tant que contrôle négatif. La séquence du gène d&#39;intérêt ne doit pas contenir des sites de restriction Eco RI et Sal I qui sont utilisés pour le clonage directionnel de l&#39;insert. Si la séquence contient ces sites, les différentes enzymes de restriction pour le clonage doivent être choisis. transformation de la levure est une méthode centrale au cours de ce protocole. L&#39;efficacité de transfection dépend de la compétence des cellules de levure, la viabilité, l&#39;état de croissance et la qualité du REAG de transfectionent 53, 54. Pour le protocole proposé, il est fortement recommandé d&#39;utiliser la levure à partir de plaques fraîches pas plus de deux semaines (conservées à 4 ° C) lors de l&#39;exécution des transformations. Souvent, la croissance de la levure transformée est retardée lorsque des cultures liquides sélectifs sont inoculés avec les colonies de vieilles plaques de gélose. Il est également utile d&#39;utiliser une culture starter liquide comme inoculum pour les expériences réelles et ne pas utiliser la levure directement à partir de la plaque. Faible efficacité quand transfecter la proie dans la levure d&#39;appât exprimant peut conduire à la sous-représentation de certaines protéines des proies (des interacteurs potentiels) et peut donc fausser tout l&#39;écran. Dans ce protocole, une efficacité de transfection de levure de ~ 150 000 ufc / pg d&#39;ADN transfectées dans le Y2H a bien fonctionné. Connaître les défauts et les inconvénients de la technique de Y2H et interpréter les résultats d&#39;une manière critique et appropriée est indispensable à l&#39;élaboration de la correct conclusions. essais Y2H et les dérivés ont été utilisés pendant de nombreuses années et ont subi de nombreuses améliorations et adaptations par rapport aux différentes caractéristiques d&#39;appât, la localisation subcellulaire de l&#39;interaction, les partenaires de liaison attendus et d&#39;autres facteurs qui pourraient être nécessaires pour l&#39;interaction (voir Y3H 55, 56, 57). Récemment, les écrans de Y2H tableau à base ont été développées qui permettent une analyse automatisée, à haut débit de nombreux appâts contre des millions de proies 58. L&#39;avenir est plus probable dans l&#39;automatisation et à haut débit des approches à cet essai pour permettre l&#39;élucidation des voies et interactomes de signalisation complexes dans des domaines de recherche différents.

<html> Levure écrans à deux hybrides (Y2H) ont été mis au point il y a environ 27 ans 1 et ont depuis été largement utilisé dans divers domaines afin de déterminer les interactions spécifiques protéine-protéine 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 . L&#39;interaction physique d&#39;un effecteur bactérien avec une protéine cible de l&#39;hôte est souvent la condition sine qua non pour la manipulation fonctionnelle de cette protéine cible. L&#39; analyse de ces interactions a été déplacée à l&#39;objet de nombreux secteurs différents de l&#39; infection de la biologie 12, 13, 14, 15,&quot;&gt; 16, 17, 18. Le principe de l&#39;écran Y2H est que l&#39;interaction de deux protéines conduit à la reconstitution d&#39;un facteur de transcription fonctionnel qui entraîne l&#39;expression des gènes rapporteurs. L&#39;effecteur connu (le« appât ») est traductionnelle fusionné au domaine de liaison d&#39;ADN (DBD) du facteur de transcription, et les partenaires d&#39;interaction potentiels ( «proie») sont fusionnées au domaine d&#39;activation (AD) du facteur de transcription correspondant. Étant donné que le partenaire d&#39;interaction est inconnue, une bibliothèque de potentiel interacteurs est clone dans le soi-disant «proie-bibliothèque.&quot; Normalement, cette bibliothèque est faite par le clonage des ADNc dans un vecteur de proie plasmide d&#39;expression approprié codant pour l&#39;AD qui est compatible avec l&#39;appât-vecteur codé DBD. Dans le cas d&#39;une interaction, la les facteurs de transcription reconstituées induisent l&#39;expression de gènes rapporteurs, qui permettent généralement la sélection d&#39;une levure de croissance. laidentification des interacteurs est obtenue par séquençage du plasmide proie avec des amorces spécifiques de plasmide. Les bactéries ont développé diverses stratégies pour manipuler et exploiter le métabolisme de leur hôte ou de se soustraire à des mécanismes de défense et de sécréter des molécules effectrices via différents systèmes de sécrétion bactériens 19, 20, 21. La détermination des partenaires de liaison de ces effecteurs bactériens est donc la première étape dans l&#39;identification de la voie de réglage dans l&#39;hôte. Cela conduit à une meilleure compréhension des mécanismes de pathogénicité spécifiques. Écrans Y2H sont effectués pour identifier les interactions effectrices bactériennes pendant phytoplasmoses, et souvent, Y2H est une première expérience cruciale pour la caractérisation plus poussée des mécanismes de pathogénicité moléculaires dans la recherche de phytoplasme 22, 23. Cependant, le rencontréDescription hod dans la plupart des publications est plutôt rare, et ces techniques sont souvent confiée à des sociétés de biotechnologie. Pour attirer l&#39;attention sur la faisabilité de cette méthode, ce protocole fournit des informations étape par étape pour identifier les partenaires d&#39;interaction d&#39;une molécule d&#39;effecteur bactérien dans son hôte naturel. Malgré la large utilisation et l&#39;approche avance rapide des écrans Y2H, il ne faut pas oublier que certaines interactions pourraient ne pas se produire dans le système de levure. Ceci est dû au fait que la cellule de levure est utilisé comme une sorte de &quot;in vivo récipient de réaction&quot; avec certaines limitations biologiques. Plusieurs auteurs se sont penchés sur les avantages et les inconvénients de Y2H et ses dérivés 11, 24, 25, 26, 27. Considérations générales sont, par exemple, que la cellule de levure peut ne pas fournir appropriél&#39;expression génique, (post) translation ou à des conditions translocation des protéines respectives à l&#39;étude. Cela peut conduire à des résultats faussement négatifs dans l&#39;écran. Les interactions positives peuvent à leur tour être artefacts et peuvent ne pas se produire dans la situation naturelle (ie, en cas d&#39;effecteurs dans l&#39;hôte approprié). Il est donc indispensable pour confirmer les interactions du système d&#39;expression de levure hétérologue par un test d&#39;interaction indépendante dans un système biologique plus étroitement liés. Dans cette étude, les partenaires de liaison de la ATP_00189 effecteur de l&#39;agent pathogène de la plante non-cultivable Candidatus Phytoplasma Mali (P. Mali) ont été identifiés. Les résultats fournissent des informations importantes sur les mécanismes moléculaires sous - jacents au développement des symptômes de la pomme prolifération 28, une maladie qui provoque des pertes économiques élevées dans les régions productrices de pommes touchées en Europe 29.

<table><tbody><tr><td>Bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB)</td><td>Applichem</td><td>A6284</td><td>pour la préparation de l’ADN</td></tr><tr><td>Trishydroxyméthylaminométhane (Tris)</td><td>Applichem</td><td>A2264</td><td>pour milieux et tampon</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Applichem</td><td>A2942</td><td>pour milieux et tampon</td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique Sel disodique (NaEDTA)</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td>pour milieux et tampon</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosin sel sodique</td><td>Applichem</td><td>A7402</td><td>pour la préparation</td>de</tr><tr><td>l’ADN acétate d’ammonium&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td><td>9688</td><td>pour la préparation de l’ADN</td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>Applichem</td><td>A1108</td><td>pour la préparation de l’ADN</td></tr><tr><td>Isopropanol (2-Propanol)</td><td>Applichem</td><td>A3928</td><td>pour la préparation</td></tr><tr><td></td><td>de l’ADN Éthanol Sigma-Aldrich (Fluka)</td><td>51976</td><td>pour la préparation de l’ADN</td></tr><tr><td>ARNse</td><td>Applichem</td><td>A2760</td><td>pour la préparation</td></tr> <tr><td>de l’ADNChloroforme :Isoamyl 24:1</td><td>Applichem</td><td>A1935</td><td>pour la préparation de l’ADN</td></tr><tr><td>Relecture de la polymérase (par ex. iProof)</td><td>Bio-Rad</td><td>203433</td><td>pour PCR</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0271</td><td>pour le clonage</td></tr><tr><td>SalI</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0641</td><td>pour le clonage</td></tr><tr><td>Kit de purification de l’ADN sur colonne (par ex. QIAquick)</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>pour le clonage du</td></tr><tr><td>sulfate de kanamycine</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td>pour la sélection microbiologique</td></tr><tr><td>3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8056</td><td>pour le dosage d’auto-activation Monochlorhydrate</td></tr> de <tr><td>L-arginine&nbsp ;</td><td>Applichem</td><td>A3680</td><td>pour la culture de levures</td></tr><tr><td>L-Isoleucine&nbsp ;</td><td>Applichem</td><td>A3642</td><td>pour la culture de levures</td></tr><tr><td>L-lysine monohydrate</td><td>Applichem</td><td>A3448</td><td>pour la culture de levures</td></tr><tr><td>L-Méthionine&nbsp ;</td><td>Applichem</td><td>A3897</td><td>pour la culture de levures</td></tr><tr><td>L-Phénylalanine&nbsp ;</td><td>Applichem</td><td>A3464</td><td>pour la culture de levures</td></tr><tr><td>L-Thréonine&nbsp ;</td><td>Applichem</td><td>A3946</td><td>pour la culture de levures</td></tr><tr><td>L-Tyrosine&nbsp ;</td><td>Applichem</td><td>A3401</td><td>pour la culture de levures</td></tr><tr><td>L-Uracile</td><td>Applichem</td><td>A0667</td><td>pour la culture de levures</td></tr><tr><td>L-Valine&nbsp ;</td><td>Applichem</td><td>A3406</td><td>pour la culture de levures</td></tr><tr><td>L-Adénine Hémisulfate Sel&nbsp ;</td><td>Applichem</td><td>A1596</td><td>pour la culture de levures</td></tr><tr><td>0.22 & micro ; m Filtre à pores</td><td>Sartorius</td><td>16541</td><td>pour la filtration stérile</td></tr><tr><td>L-Histidine Monochlorhydrate</td><td>Applichem</td><td>A3719</td><td>pour la culture de levures</td></tr><tr><td>L-Leucine&nbsp ;</td><td>Applichem</td><td>A3496</td><td>pour la culture de levures</td></tr><tr><td>L-Tryptophane&nbsp ;</td><td>Applichem</td><td>A3410</td><td>pour la culture de levures</td></tr><tr><td>Base d’azote de levure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51483</td><td>pour la culture de levures</td></tr><tr><td>D-Glucose Monohydrate&nbsp ;</td><td>Applichem</td><td>A1349</td><td>pour la culture de levures</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2641-1</td><td>pour la culture de levures et de bactéries</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Applichem</td><td>A2208</td><td>pour la culture de levures</td></tr><tr><td>Polyéthylène glycol 4000 (PEG)</td><td>Applichem</td><td>A1249</td><td>pour la transformation de levures</td></tr><tr><td>Acétate de lithium dihydraté (LiOAc)</td><td>Applichem</td><td>A3478</td><td>pour la transformation de levures</td></tr><tr><td>ADN de spermatozoïde de saumon&nbsp ;</td><td>Applichem</td><td>A2159</td><td>pour la transformation de levure</td></tr><tr><td>Anticorps contre l’étiquette Lex-A (par exemple région de liaison à l’ADN anti-LexA)</td><td>Millipore</td><td>06-719</td><td>pour Western blot</td></tr><tr><td>Plasmid Miniprep kit (par exemple GenElute Plasmid Miniprep Kit)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PLN350</td><td>pour la purification de plasmides à partir de levures et de bactéries</td></tr><tr><td>Perles de verre lavées à l’acide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>pour la purification de plasmides à partir de levures</td></tr><tr><td>Ampicilline Sel de sodium</td><td>Applichem</td><td>A0839</td><td>pour la sélection microbiologique</td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Applichem</td><td>A1552</td><td>pour la culture de levures</td></tr><tr><td>Concentrateur sous vide centrifugeuse (par exemple Concentrateur 5301)</td><td>Eppendorf</td><td>Z368245 (Sigma)</td><td>pour la préparation de l’ADN</td></tr><tr><td>Vecteur d’appât (par exemple pLexA-N)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>pour</td></tr><tr><td>le vecteur de proie Y2H (par ex. pGAD-HA)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td> pour <td></td></tr><tr><td>le vecteur de proie de contrôle Y2H (par exemple pLexA-p53)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>pour Y2H</td></tr><tr><td>Vecteur d’appât de contrôle (p.ex. pACT-largeT)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>pour Y2H</td></tr><tr><td>Électrocompétent E. coli (p. ex. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)</td><td>Invitrogen</td><td>C640003</td><td>pour le clonage d’une</td></tr><tr><td>souche rapporteure de levure (NMY51 :MATahis3&Delta ; 200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2 ::(lexAop)4-HIS3 ura3 ::(lexAop)8-lacZ ade2 ::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>pour Y2H</td></tr><tr><td>Film de paraffine plastique (p.ex. Parafilm M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td>pour la culture de levures et de bactéries</td>Scellant</tr><tr><td>perméable aux gaz (p.ex. BREATHseal)</td><td>Greiner</td><td>676 051</td><td>pour la culture de levures</td></tr><tr><td>Cycleur PCR (par ex. Thermocycleur T100)</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td>pour PCR</td></tr><tr><td>Cycler PCR quantitatif (e.ex. CFX96 Touch Système de détection PCR en temps réel)</td><td>Bio-Rad</td><td>1855195</td><td>pour PCR quantitative</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse (par ex. Centrifugeuse 5417 R)</td><td>Eppendorf</td><td>5417 R</td><td>équipement</td></tr> <tr><td>général de laboratoireCentrifugeuse (par exemple Centrifugeuse 5804 R)</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td>équipement général de laboratoire</td></tr><tr><td>Eau sans nucléases (sans DNAse, sans RNAse, sans protéase)</td><td>5Prime</td><td>2500010</td><td>pour la PCR et les travaux sur l’ADN</td></tr><tr><td>Scalpell</td><td>Swann-Morton</td><td>0301</td><td>pour la préparation de l’ADN</td></tr><tr><td>Filtre stérile (0,22 &micro ; m; Polyéthersulfone)</td><td>VWR-International</td><td>514-0073 (numéro de catalogue européen)</td><td>pour la culture de levures et de bactériesboîtes</td></tr><tr><td>de Pétri & Oslash ; 90 mm&nbsp ;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633180</td><td>pour la culture de levures et de bactéries</td></tr><tr><td>, boîtes de Pétri & Oslash ; 150 mm ;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>639161</td><td>pour la culture de levures</td></tr><tr><td>Photomètre (par exemple BioPhotomètre)</td><td>Eppendorf</td><td>550507804</td><td>pour la culture de levure</td></tr><tr><td>Photomètre Cuvettes</td><td>de marque 759015</td><td></td><td>pour culture de levure</td></tr><tr><td>Bain-marie (par exemple Bain-marie Memmert WB7)</td><td>Memmert</td><td>WB7</td><td>pour la transformation de levure</td></tr><tr><td>Western Blot Equipment</td><td>Bio-Rad</td><td>divers</td><td>pour la détection des protéines</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>5Prime</td><td>2201210</td><td>pour le clonage</td></tr><tr><td>Shaker (Erlenmeyer) Flacons (100 mL ; 1 000 ml ; 2 000 mL) et bouchons en coton respirant ( par exemple Flacons à col étroit Duran Erlenmeyer)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z232793, Z232858, Z232866</td><td>pour la culture de levures et de bactéries</td></tr><tr><td>Incubateur à secouer (par exemple GFL 3031)</td><td>GFL</td><td>3031</td><td>pour culture de levures et de bactéries</td></tr><tr><td></td><td>Incubateur Liant</td><td>KB 53 (E3.1)</td><td>pour culture de levures et de bactéries</td></tr><tr><td>Machine à glaçons (par ex. Machine à glaçons IF 825)</td><td>Omniwash</td><td>IF 825</td><td>équipement de laboratoire général</td></tr><tr><td>0,2 mL, 1,5 mL et 2,0 mL Flacons de réaction (polypropylène)</td><td>Eppendorf</td><td>0030.124.332 (0,2 ml) ; 0030.123.328 (1,5 ml) ; 0030.123.344 (2,0 ml)</td><td>équipement de laboratoire général</td></tr><tr><td>Pipettes et pointes de pipette jetables (différentes volumines : 10 - 1 000 & micro ; L)</td><td>Eppendorf</td><td>divers</td><td>équipements de laboratoire généraux</td></tr><tr><td>Épandeur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SPR-L-S01</td><td>pour la culture de levures et de bactéries</td></tr><tr><td>Agitateur vortex (par exemple MS 3 Minishaker)</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td>équipement de laboratoire général</td></tr><tr><td>T4-Ligase</td><td>Thermo Fisher</td><td>EL0011</td><td>pour le clonage</td></tr><tr><td>Réfrigérateur (4 &deg ; C) (par ex. Liebherr Medline FKEX 5000)</td><td>Liebherr</td><td>81.767.580.4</td><td>équipement général de laboratoire</td></tr><tr><td>Congélateur (-20 &deg ; C) (par exemple Liebherr Comfort Professional G5216)</td><td>Équipement de laboratoire général</td> <td>Liebherr</td><td>G5216</td></tr><tr><td>Cylindre gradué (par exemple Marque)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z327352 ; Z327417 ; Z327441&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Équipement général de laboratoire</td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques (par ex. Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher</td><td>S55701</td><td>pour la culture de levures et de bactéries</td></tr><tr><td>Pipette mécanique (par ex. Pipetboy acu 2)</td><td>Integra-Biosciences</td><td>155000</td><td>équipement général</td></tr><tr><td>de laboratoire Cuvettes pour l’électroporation (1 mm)</td><td>Molecular Bio Products</td><td>5510-11</td><td>pour la transformation</td></tr> <tr><td>des bactériesÉlectroporateur (par ex. Eporator)</td><td>Eppendorf</td><td>4309000019</td><td>pour la transformation bactérienne</td></tr><tr><td>Système d’imagerie Gel et Blot (par ex. Système ChemiDoc MP)</td><td>Bio-Rad</td><td>1708280</td><td>équipement de laboratoire général</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger coniques (polypropylène) (50 mL)</td><td>VWR-International&nbsp ;</td><td>525-0403 (N° de catalogue européen)</td><td>matériel général de laboratoire Tubes à</td></tr><tr><td>centrifuger coniques (polypropylène) (13 mL)</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>matériel général</td></tr><tr><td>de laboratoire Dithiothreitol (DTT ; 1 M)</td><td>Thermo Scientific</td><td>P2325</td><td>pour la ligature</td></tr><tr><td>de l’adénosine triphosphate (ATP, par exemple ATP Solution (10 mM))</td><td>Ambion&nbsp ;</td><td>AM8110G (distribué par Thermo Scientific)</td><td>pour la ligature</td></tr><tr><td>Mélange de Dropout sans histidine, leucine, tryptophane et adénine (DO, par exemple Suppléments de Yeast Synthetic Drop-out Medium)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2021 Sigma&nbsp ;</td><td>pour la culture de levures (mélange prêt à l’emploi)</td></tr></tbody></table>

démêler la fonction d&#39;un effecteur bactérien à partir d&#39;un non-cultivable pathogen usine utilisant une levure de l&#39;écran à deux hybrides

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Démêler les mécanismes moléculaires de manifestations de la maladie est important de comprendre les pathologies et le développement des symptômes de la science des plantes. Les bactéries ont évolué différentes stratégies pour manipuler leur métabolisme hôte pour leur propre bénéfice. Cette manipulation bactérienne est souvent couplée avec le développement des symptômes graves ou la mort des plantes touchées. Détermination des molécules bactériennes spécifiques responsables de la manipulation de l&#39;hôte est devenu un domaine important dans la recherche microbiologique. Après l&#39;identification de ces molécules bactériennes, appelés &quot;effecteurs&quot;, il importe d&#39;élucider leur fonction. Une approche simple pour déterminer la fonction d&#39;un effecteur est d&#39;identifier son partenaire de liaison protéinique dans son hôte naturel via un écran deux hybrides de levure (Y2H). Normalement , l&#39;hôte héberge de nombreux partenaires de liaison potentiels qui ne peuvent pas être prédits de manière suffisante par tout dans l&#39; algorithme silico. Il est donc le meilleur choix pour perform un écran avec l&#39;effecteur hypothétique contre toute une bibliothèque de protéines de l&#39;hôte exprimées. Il est particulièrement difficile si l&#39;agent causal est incultivables comme phytoplasme. Ce protocole fournit des instructions étape par étape pour purification d&#39;ADN à partir d&#39;une usine de phytoplasme infectés ligneuse hôte, l&#39;amplification de l&#39;effecteur potentiel, et l&#39;identification subséquente de moléculaire partenaire d&#39;interaction de la plante avec un écran de Y2H. Même si les écrans Y2H sont couramment utilisés, il y a une tendance à externaliser cette technique pour les sociétés de biotechnologie qui offrent le service de Y2H à un coût. Ce protocole fournit des instructions sur la façon d&#39;effectuer une Y2H dans un laboratoire de biologie moléculaire décemment équipée en utilisant des techniques de laboratoire standard.

Avant l&#39;écran réel Y2H peut être effectuée l&#39;appât doit être testé pour l&#39;auto-activation. Ce résultat est obtenu en transformant le vecteur d&#39;expression de l&#39;appât en même temps que la bibliothèque de proies vecteur vide et de contrôle de croissance sur des plaques sélectives. Pour analyser si la ATP_00189 de protéine phytoplasme est auto-activation, le test d&#39; auto-activation a été réalisée comme décrit dans la section 5. Le plasmide appât complète le trp et la proie plasmid l&#39;auxotrophie leu de S. cerevisiae NMY51 40. Une co-transformation réussie est donc caractérisé par une croissance sur des plaques sélectives manquent trp et leu. L&#39;interaction de l&#39;appât et une protéine proie conduit à une complémentation de la sienne et ade auxotrophie de NMY51. Si l&#39;auto-activation par l&#39;appât en l&#39;absence d&#39;une interaction apparaît, la levure se développe sur des plaques sélectives manquent son et ade. auto forte et faibleactivation peut se produire. Une forte auto-activation de l&#39;appât est caractérisée par une croissance de la levure co-transformée sur trp-leu-his-ade appauvri des plaques de sélection. Faible auto-activation conduit à la croissance sur trp-leu-son mais pas sur trp-leu-his-ade appauvri plaques de sélection. contrôles positifs appropriés sont indispensables pour interpréter les résultats du test d&#39;auto-activation. Un résumé des résultats attendus de l&#39;essai d&#39; auto-activation et leur interprétation sont fournis dans le tableau 1 et visualisés sur la figure 1. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" /> Figure 1: Exemple de Bait Tests d&#39; auto-activation d&#39;un appât Avant d&#39; effectuer un écran de Y2H. S. cerevisiae NMY51 a été co-transformé avec interaction appât (pLEX-p53) et la proie (Pact-LARGET) comme témoin positif (panneau de gauche: ac), une auto-activation , plus une proie vide libra faiblementvecteur ry (panneau du milieu: df) et un appât pas d&#39;auto-activation , plus une bibliothèque de proies vecteur vide (panneau de droite: gi). La levure de co-transformées ont été cultivées sur des plaques de SD dépourvues trp et leu (panneau supérieur: a, d, g), trp, leu et son (panneau du milieu: b, e, h) et trp, leu, son et ade (inférieure panneau: c, f, i). La sélection sur un milieu dépourvu de trp et leu est un contrôle positif pour la co-transformation réussie, en tant que vecteur appât complète le auxotrophie trp et le vecteur proie l&#39;auxotrophie leu de NMY51 (croissance sur SD-trp-leu). Dans le cas d&#39;une interaction entre l&#39;appât et la proie ou une auto-activation de l&#39;appât, l&#39;expression de rapporteur de NMY51 est allumé et complète le sien et ade auxotrophie (croissance sur SD-trp-leu-his-ade). Une faible auto-activation se caractérise par une croissance sur SD-trp-LEU-ses plaques (panneau du milieu, df). Faible auto-activation d&#39;un appât doit être diminuée avant pour analyser l&#39;appâtdans un écran de Y2H, par exemple en ajoutant 3-AT aux médias sélectifs. épuisements d&#39;acides aminés sont indiqués par &quot;-&quot; dans le nom du support respectif. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> aucun </td><td> colonies </td><td> pas de croissance </td><td> pas de croissance </td><td> pas de croissance </td><td> pas de croissance </td></tr><tr><td> aucun </td><td> pGAD-HA </td><td> pas de croissance </td><td> colonies </td><td> pas de croissance </td><td> pas de croissance </td><td> pas de croissance </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> aucun </td><td> colonies </td><td> pas de croissance </td><td> pas de croissance </td><td> pas de croissance </td><td> pas de croissance </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> pGAD-HA </td><td> colonies </td><td> colonies </td><td&gt; colonies </td><td> pas de croissance </td><td> pas de croissance </td></tr><tr><td> pLexA-p53 </td><td> Pact-LARGET </td><td> colonies </td><td> colonies </td><td> colonies </td><td> colonies </td><td> colonies </td></tr><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> pGAD-HA </td><td> colonies </td><td> colonies </td><td> colonies </td><td> pas de croissance </td><td> pas de croissance </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Résultats attendus dans un Bait Assay auto-activation. La transformation de S. cerevisiae donne NMY51 à croissance différentielle sur des milieux sélectifs en fonction des caractéristiques de l&#39; appât et la proie de co-transformé. La croissance sur des plaques sélectives a été évaluée lors de la transformation de différentes combinaisons de vecteurs (af) après 72 heures d&#39;incubation à 30 ° C. Faible auto-activation est caractérisée par la croissance de la levure sur SD-trp-leu-son et une forte auto-activation par la croissance sur la sélection SD-trp-leu-his-ade plates en l&#39;absence d&#39;un partenaire d&#39;interaction. Le pLexA-N phytoplasme codé effecteur ATP_00189 ne présentent pas d&#39;auto-activation, qui est caractérisé par l&#39;incapacité du vecteur appât transformé NMY51 à croître en l&#39;absence de son et ade. En fonction de l&#39;appât, un écran de Y2H peut obtenir de nombreux clones de levure en croissance sur des plaques sélectives. Tous les clones doivent être analysées et vérifiées pour les licenciements possibles. Même si une banque d&#39;ADNc normalisée a été utilisé, il est très probable qu&#39;une interacteur est représentée dans plusieurs clones différents. En fonction de la technique de clonage bibliothèque, il est également possible que seuls des fragments du gène complet sont insérés dans des vecteurs proies. Il est donc conseillé de novo amplifier ( à partir d&#39; ADNc) et sous - cloner le gène de la longueur de l&#39;interacteur et de tester l&#39;interaction dans une analyse de Y2H one-to-one (Figure 2). <img alt = &quot;Figure 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55150 / 55150fig2.jpg&quot; /&gt; Figure 2: Exemple d&#39;une interaction entre l&#39; appât et proie dans une expérience de Y2H. Un écran à deux hybrides de levure (Y2H) a été effectuée et ont été purifiés à partir de plasmides clones Interactor positifs. Le vecteur de proie a été séquencée et les Malus x domestica partenaires d&#39;interaction hôte MdTCP24 et MdTCP25 ont été identifiés. En tant que MdTCP34 de contrôle négatif (pour lesquels aucun interacteur a été identifié dans l&#39;écran de la bibliothèque Y2H) a été sous-cloné en parallèle. Les gènes de longueur complète ont été amplifiés à partir de la pomme d&#39; ADNc, sous - cloné dans le vecteur proie (exprimant la co-cistronically le domaine d&#39; activation AD) et de novo , la co-transformée avec le vecteur appât exprimant le ATP_00189 effecteur bactérien couplé au domaine de liaison à l&#39; ADN (BD). Ce chiffre est tiré de 28. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande</a>version de ce chiffre.

protéines effectrices bactériennes sont importantes pour établir des infections réussies. Ce protocole décrit l&#39;identification expérimentale des partenaires de liaison protéiques d&#39;une protéine bactérienne effecteur dans son hôte naturel de plantes. L&#39; identification de ces interactions effectrices via levure écrans à deux hybrides est devenu un outil important dans le décryptage des stratégies de pathogénicité moléculaires.

Démêler la fonction d&#39;un effecteur bactérien à partir d&#39;un non-cultivable Pathogen usine utilisant une levure de l&#39;écran à deux hybrides

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

L'objectif général de cette procédure est de dévoiler les stratégies de virulence et les systèmes hôte-pathogène en identifiant l'interaction entre une protéine effectrice de candidatus phytoplasma malefactor et des protéines hôtes provenant de Malus domestica. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans de nombreux domaines de recherche biologique et est utilisée ici en recherche végétale pour élucider les mécanismes moléculaires à l'origine du développement de la maladie de la prolifération du pommier. Le principal avantage de cette technique est qu'un seul effecteur pathogène peut être criblé contre des milliers d'interacteurs potentiels, ce qui en fait un point de départ facilement réalisable dans la recherche sur les infections.Pour commencer, identifiez les arbres infectés présentant des symptômes spécifiques de la prolifération du pommier ainsi que les arbres témoins sans symptôme. À l’aide de sécateurs propres, prélèvez des échantillons de racines sur trois sites différents du système racinaire, ayant un diamètre de 0,5 à 1 cm et une longueur d’environ 5 cm. Placez les échantillons de racines dans des sacs en plastique correctement étiquetés.Ensuite, placer les échantillons dans une boîte froide avec des accumulateurs de froid prérefroidis et les conserver à quatre degrés Celsius jusqu'au traitement ultérieur. Rincer les échantillons de racines à l'eau pour éliminer la terre. Puis transférer les échantillons dans une boîte de Petri stérile et utiliser un scalpel stérilisé pour enlever l'épiderme racinaire et le cortex.Avec un tissu propre et sans peluches, essuyez le scalpel. Ensuite, plongez l'instrument dans de l'éthanol à 70 % et stérilisez-le à la flamme. Utilisez le scalpel pour gratter le phloème.Hachez l'échantillon en petits morceaux et aliquotez 30 à 100 milligrammes de ces morceaux dans un tube réactionnel stérile de deux millilitres. Conservez les échantillons à 80 degrés Celsius ou utilisez-les immédiatement pour isoler l'ADN, qui servira de matrice pour l'amplification du gène effecteur et le clonage ultérieur de l'effecteur dans le vecteur appât. Après avoir isolé l'ADN polyspécifique de phytoplasmes à partir d'arbres infectés, procédez au clonage dans des vecteurs appât et vérifiez l'auto-activation et l'expression conformément au protocole décrit dans le texte.Étaler la souche effectrice plex A ATP 00189 transformée NMY51 sur une nouvelle boîte de Petri SD-trp et l'incuber à 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours, jusqu'à l'apparition de colonies rouges. Utiliser une colonie rouge provenant de la boîte gélosée pour ensemencer trois millilitres de milieu SD-trp dans un petit flacon agité, puis incuber la culture toute la nuit à 30 degrés Celsius sous agitation à 120-150 tours par minute. Le jour suivant, ensemencer 20 millilitres de milieu SD-trp dans un flacon agité avec un millilitre de la culture de nuit et laisser croître pendant huit heures.Utilisez le milieu SD-trp pour ajuster la culture à une DO600 de 0,2, puis inoculez deux flacons contenant chacun 100 millilitres de milieu SD-trp avec dix millilitres de cette culture. Incubez les cultures à 30 degrés Celsius avec agitation pendant la nuit. Ensuite, mesurez la DO600 de la culture et récupérez par centrifugation 120 unités de DO600.Par exemple, si une DO600 de 1,2 est mesurée, centrifuger 100 millilitres d'échantillon, éliminer le surnageant et utiliser 800 millilitres de 2xYPAD préchauffé pour resuspendre le culot dans deux flacons d'agitation, puis incuber à 30 degrés Celsius. Incuber la culture de levure à 30 degrés Celsius et 120 à 150 tours par minute. Mesurer la DO600 toutes les 1,5 heures environ selon le protocole décrit jusqu'à l'obtention d'une DO600 de 0,6.Après avoir préparé l'ADN de sperme de saumon, le Te Lithium OAc et le PEG Lithium OAc selon le protocole indiqué dans le texte, centrifuger 800 millilitres de culture de levure à 700 x g pendant cinq minutes afin de former un culot cellulaire. Éliminer le surnageant et resuspendre les culots dans un volume total de 200 millilitres d'eau stérile doublement distillée. Puis reprendre la centrifugation pour former un nouveau culot cellulaire et jeter le surnageant.Resuspendre le culot dans 16 millilitres de mélange Te Lithium OAc et centrifuger à nouveau l'échantillon. Ensuite, après avoir éliminé le surnageant, utiliser 9,6 millilitres de Te Lithium OAc pour resuspendre le culot. Dans des récipients réactionnels de taille appropriée, préparer douze vials contenant sept microgrammes de la bibliothèque vectorielle d'ADN Add HAC au pic, 100 microlitres d'ADN de sperme de saumon à 2 % et 2,5 millilitres de mélange PEG Lithium OAc.Ajouter 600 microlitres de la suspension de cellules de levure préparée précédemment dans chacun des douze flacons et mélanger vigoureusement pendant une minute. Incuber ensuite les réactions dans un bain-marie à 30 degrés Celsius pendant 45 minutes en mélangeant toutes les 15 minutes. Ajouter ensuite 160 microlitres de DMSO dans chaque flacon et mélanger vigoureusement.Incubez ensuite les tubes à 42 degrés Celsius pendant 20 minutes supplémentaires. Après avoir centrifugé les cellules, éliminez le surnageant et utilisez trois millilitres de 2xYPAD pour resuspendre chaque culot. Rassemblez les cellules provenant des douze tubes dans un flacon de 100 millilitres pour agitateur et incubez la levure pendant 90 minutes à 30 degrés Celsius et 120 tours par minute.Après l'incubation, après avoir centrifugé les cellules et éliminé le surnageant, utilisez une pipette serologique de dix millilitres et 4,5 millilitres de chlorure de sodium stérile à 0,9 % pour resuspendre complètement le culot en pipetant soigneusement plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Prélevez 50 microlitres de la suspension et utilisez du chlorure de sodium à 0,9 % pour préparer des dilutions dix fois successives allant de 1:10 à 1:1000. Ensuite, déposez 100 microlitres de chaque dilution sur des boîtes de Pétri de 90 millimètres contenant de l'agar SD-trp-leu.Étaler le reste de la suspension de levure non diluée sur des boîtes de Pétri de 16x150 millimètres de diamètre contenant de l'agar SD-trp-leu-His-ade. Incuber les boîtes à 30 degrés Celsius pendant trois jours pour les boîtes SD-trp-leu et pendant quatre jours pour les boîtes SD-trp-leu-his-ade. Déterminer l'efficacité de transfection en comptant les colonies des différentes dilutions sérielles sur les boîtes de sélection SD-trp-leu.Transférez chaque clone en utilisant une pointe de pipette stérile pour prélever et étaler la colonie sur des boîtes de culture sélectives fraîches SD-trp-leu-his-ade. Incubez les boîtes à 30 degrés Celsius pendant 24 heures. Répétez le transfert des clones chaque jour jusqu'à ce qu'un total de cinq passages soit atteint.Pour analyser les clones, préparez sous une hotte stérile un tube réaction de deux millilitres stérile contenant un millilitre de SD-trp-leu-his-ade pour chaque clone. Utilisez une aiguille chauffée pour percer un trou dans chaque tube et recouvrez le trou avec un scellant perméable aux gaz. Inoculez chaque flacon avec du matériel de colonie fraîche provenant d'un clone et incubez les flacons à 30 degrés Celsius et 150 tours par minute pendant 24 heures.Après avoir centrifugé les cellules et éliminé le surnageant, resuspendre le culot dans le tampon approprié et le transférer dans un nouveau tube réaction de deux millilitres. Ajouter 100 microlitres de billes de verre traitées à l'acide à la suspension et mélanger vigoureusement le tube pendant cinq minutes. Enfin, purifier l'ADN plasmidique selon le protocole décrit dans le texte.Un résumé des résultats attendus du test d'auto-activation et de leur interprétation est fourni dans ce tableau et cette figure. Une faible auto-activation entraîne une croissance sur les milieux de sélection trp-leu-his, mais pas sur les milieux trp-leu-his-ade dépourvus de nutriments. En revanche, les levures transformées avec un appât fortement auto-activateur pousseraient sur un milieu privé de trp-leu-his-ade.Une cotransformation réussie de l'appât et du partenaire est caractérisée par une croissance sur des plaques sélectives dépourvues de trp et de leu. L'interaction entre l'appât et une protéine partenaire conduit à une complémentation de l'auxotrophie his et ade de la souche NMY51. Voici un exemple d'interaction entre un appât et un partenaire dans une expérience de double hybride chez la levure. Les partenaires d'interaction de la plante hôte Malus domestica, MdTCP24 et MdTCP25, ont été identifiés, et l'interaction a été confirmée par une transformation *de novo* avec l'effecteur.Une fois maîtrisée, la double hybride chez la levure peut être réalisée en une journée, à condition que tout le matériel et les équipements nécessaires, en particulier les levures, soient correctement préparés à l’avance. Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel d’éviter toute contamination et de toujours travailler dans des conditions stériles. Après cette procédure, une autre méthode indépendante doit être effectuée, comme par exemple la complémentation bimoléculaire de la fluorescence, afin de confirmer les interactions protéine-protéine observées.Cela est particulièrement important car la levure ou l'hybride en tant que tel est relativement sujette à la production de résultats faussement positifs. Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans de nombreux domaines de recherche différents pour mieux comprendre les principes moléculaires impliqués dans les interactions entre protéines, notamment dans les interactions hôte-pathogène, ainsi que dans de nombreux autres domaines de recherche biologique. En outre, vous comprendrez que la mise en œuvre de cette méthode est facilement réalisable dans tout laboratoire de biologie moléculaire convenablement équipé.N'oubliez pas que l'utilisation de certains produits chimiques, de scalpels et de flammes nues peut être extrêmement dangereuse ; ainsi, lors de la réalisation de cette procédure, vous devez toujours prendre certaines précautions. Cela signifie utiliser vos équipements de protection individuelle tels que les gants et les lunettes de protection, ainsi que les équipements généraux de sécurité en laboratoire.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

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Identification des phénotypes inhibition de la croissance induite par l&#39;expression de bactéries de type III Effectors dans la levure

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