Name: Léchelle du laboratoire: Production et purification dun anticorps thérapeutique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Apprenez la production d'anticorps thérapeutiques à l'échelle laboratoire en utilisant des cellules HEK-293 adaptées à un milieu sans sérum. Cette méthode optimise la transfection stable et la purification par chromatographie d'affinité.

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La recherche a été soutenue par l’Université de Sydney. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ était un don d’Andrew Beavil (plasmide Addgene # 61883). Nous remercions Tihomir S. Dodev pour les discussions utiles concernant pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ.

NOTE: Un vecteur d&#39;expression de mammifère approprié doit être utilisé pour ce protocole. Ici, une construction unique contenant deux cassettes d&#39;expression est utilisée (c. -à- expression lourde et légère chaîne est entraînée par des promoteurs séparés). chaînes lourdes et légères trastuzumab ont déjà été clones dans le vecteur. Ce vecteur est un cadeau de Andrew Beavil, obtenu grâce à un bénéfice non-plasmide référentiel 13. 1. Recovery and Scale-up de l&#39;ADN vecteur NOTE: L&#39; ADN du vecteur a été reçu comme une culture stab agar mou dans la souche Escherichia coli XL-1 Blue; vecteur porte résistance à l&#39;hygromycine. <ol><li> Insérez un coup d&#39;inoculation stérile ou boucle dans l&#39;agar mou de la culture stab puis strie un Luria Bertani (LB) plaque de gélose préparée avec 75 pg / ml d&#39;hygromycine pour les colonies isolées. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 18-24 h. </li><li> Inoculer une seule colonie dans 5 ml de bouillon Terrific (TB) contenant 75 pg / ml d&#39;hygromycine. Incubate la culture à 37 ° C pendant 18-24 h avec 225 rpm agitation. </li><li> Utilisez la culture de la nuit pour préparer un stock de glycérol d&#39;ADN vecteur en mélangeant doucement 800 ul de la culture avec 200 ul de 80% de glycérol dans un cryovial et congeler à -80 ° C. <ol><li> Ajouter 100 ul de la culture d&#39;une nuit à 100 ml de TB contenant 75 pg / ml d&#39; hygromycine dans un flacon d&#39;agitation à déflecteur (soit 1 / 1.000 de dilution). Incuber la culture à 37 ° C pendant 18-24 h avec 225 rpm agitation. </li></ol></li><li> Après une nuit de culture, extraire et purifier l&#39;ADN selon les instructions du kit de préparation midi / maxi à l&#39;exception suivante du fabricant; au cours de l&#39;étape finale de l&#39;ADN, éluer ou resuspendre avec de l&#39;eau (pH 7,0-8,5). </li><li> Vérifiez la concentration et la pureté de l&#39;ADN par des lectures d&#39;absorbance à 260 et 280 nm, puis stocker l&#39;ADN à -20 ° C. REMARQUE: en option (fortement recommandé): l&#39;ADN de séquence en utilisant des amorces spécifiques de vecteur pour confirmer l&#39;identité. </li></ol> 2. Transfection stable de cellules HEK-293 <ol><li> Cultiver et de maintenir des cellules HEK-293 (cellules de suspension) selon des protocoles classiques dans un milieu sans sérum supplémenté avec 0,1% de tensioactif non ionique dans des erlenmeyers. Maintenir à 2 x 10 5 cellules / ml et sous - culture tous les quatre jours. Des cellules de culture à 37 ° C avec 5% de CO 2 et de 120 tours par minute de rotation. NOTE: Les cellules doivent avoir été en culture pendant au moins 4 jours et pas plus de 4 semaines avant la transfection. Cellules HEK-293 cultivées en monocouches dans des milieux contenant du sérum peuvent également être utilisés pour cette procédure. </li><li> Le jour avant la transfection, les graines cellules HEK-293 à 3 x 10 5 cellules / ml dans des puits d&#39;une plaque à 12 puits dans 2 ml de milieu Eagle modifié Dulbecco (DMEM) supplémenté avec du sérum inactivé à la chaleur 10% de fœtus bovin ( FBS). Le jour de la transfection, vérifier que les cellules ont atteint une confluence de 80 à 90% </li><li> Diluer l&#39;ADN et la polyéthylèneimine (PEI) séparément dans les milieux de transfection puis mélanger.<ol><li> Diluer 1,25 pg vecteur ADN par puits (15 pg pour 12 puits) dans 300 milieux de transfection ul. Incuber à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Diluer 2,5 ul d&#39; une solution à 1 mg / ml de PEI (30 ul pour 12 puits, ie rapport 1: 2 de l&#39; ADN de PEI) dans 300 ul de milieu de transfection. Incuber à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Ajouter ADN dilué à dilué PEI, mélanger délicatement et incuber à température ambiante pendant 15 min. </li></ol></li><li> Ajouter 50 ul d&#39;ADN / PEI mélange goutte à goutte à chaque puits de la plaque. Roche doucement la plaque pour distribuer le mélange de transfection puis placer la plaque à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 24 heures. </li><li> Ajouter 50 pg / ml d&#39; hygromycine B par puits et retourner la plaque à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 10 jours. Remarque: Au jour 10, les cellules transfectées par l&#39;ONU seront mortes et détachée de la surface de la plaque, tandis que les cellules transfectées de manière stable sont viables et fixé à la plaque. </li><li> Remplacer les médias dans les puits avec1/4 des médias libres sériques volume et 3/4 volume de DMEM additionné de 10% de FBS (soit 0,5 ml de milieu sans sérum + 1,5 ml DMEM = concentration de 7,5% de sérum finale) et incuber pendant 4 jours. </li><li> Remplacer les médias dans les puits avec 1/2 médias libres sériques volume et 1/2 volume de DMEM supplémenté avec 10% de FBS (ie milieux sans sérum 1 ml + 1 ml DMEM = 5% concentration finale de sérum) et incuber pendant 4 jours. </li><li> Remplacer les médias dans les puits avec 3/4 milieux sans sérum volume et 1/4 volume de DMEM supplémenté avec 10% de FBS (soit 1,5 ml de milieu sans sérum + 0,5 ml DMEM = 2,5% la concentration sérique finale) et incuber pendant 4 jours. </li><li> Remplacer les médias dans les puits avec 2 ml de milieu sans sérum additionné de 0,1% de tensioactif non ionique (ie concentration de 0% de sérum finale) et incuber pendant 4 jours. NOTE: Maintenir 50 pg / ml d&#39;hygromycine B pression sélective sur les cellules lors de l&#39;adaptation sans sérum. Les cellules adaptées à des milieux sans sérum se détachent de la surface de puits et peuvent se regrouper in suspension. Reportez-vous à l&#39;étape 2.1 pour les conditions de culture avec le supplément de 50 pg / ml d&#39;hygromycine B. </li><li> En utilisant une pipette, mélanger délicatement les cultures en suspension dans les cellules de la plaque et de la piscine de 12 puits dans un tube séparé. <ol><li> L&#39; utilisation d&#39; un hémocytomètre, énumérer les cellules mises en commun et des semences dans 30 ml de milieu sans sérum dans un flacon Erlenmeyer à 2 x 10 5 cellules / ml. Des cellules de culture à 37 ° C avec 5% de CO 2 et de 120 tours par minute de rotation. Subculture et étendre tous les quatre jours. </li></ol></li><li> Continuer à élargir la taille de la culture à la densité cellulaire nécessaire pour obtenir des 10 flacons à 1 x 10 7 cellules / flacon pour la cryoconservation dans l&#39; azote liquide. Congeler les cellules dans un milieu exempt de sérum contenant 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO). NOTE: Les milieux conditionnés contenant un anticorps peuvent être récoltées à chaque sous-culture pour confirmer la production de protéines ou utilisées pour optimiser les conditions de purification. Pour récolter des milieux conditionnés et maintenir les cellules pour la sous-culture, centrifuger la culture à300 g pendant 5 min puis filtrer-stériliser surnageant à travers un filtre de 0,22 um. surnageant filtré peut être conservé à 4 ° C pendant 1-2 semaines ou -20 ° C pour le stockage à long terme. </li></ol> 3. Large Scale Production d&#39;anticorps à partir de lots overgrow Culture NOTE: La production d&#39;anticorps peut être suivi sur l&#39;étape 2.11 où les cellules existantes sont étendues à la densité cellulaire requise sur la base du surcroissance volume de culture par lots pour être configuré. Dans le cas contraire, les cellules qui ont été décongelées à partir cryoconservation commencent à ce stade, une fois expansé à une densité cellulaire appropriée et le volume. Divers compléments de culture peuvent être utilisées pour optimiser la production d&#39;anticorps; l&#39;utilisation de tryptone pour augmenter le rendement anticorps est démontré dans ce protocole. <ol><li> Cellules de semences à 2 x 10 5 cellules / ml dans des milieux sans sérum de 100 ml dans deux flacons Erlenmeyer (pour comparer les rendements d&#39; anticorps à partir de cultures ONU-complétées et en éléments nutritifs complété). Culture à 37 ° C, 5% de CO 2 </sub&gt; et 120 tours par minute. </li><li> Après 24 heures, ajouter de tryptone jusqu&#39;à une concentration finale de 0,5% pour la culture nutritif supplémenté. Egaliser volume de culture non supplémenté avec un milieu sans sérum. </li><li> Dès le premier jour 8, effectuer des comptages de cellules des cultures quotidiennes en utilisant un hémocytomètre pour surveiller la viabilité des cellules. Récolter les surnageants de culture une fois que la viabilité des cellules est inférieure à 80%. <ol><li> Récolte le surnageant par centrifugation des cultures à 3000 g pendant 15 min, puis on filtre stériliser le surnageant (contenant les anticorps) à travers un filtre de 0,22 um. Stocker les surnageants à 4 ° C (à court terme) ou congeler à -20 ° C (à long terme). </li></ol></li></ol> Système 4. Anticorps Purification par chromatographie d&#39;affinité utilisant une protéine rapide automatisé chromatographie liquide (FPLC) REMARQUE: La procédure suivante peut généralement être appliqué à la plupart des systèmes automatisés. La purification peut être effectuée à température ambiante ou à 4 ° C (si le système FPLC est conservé dans une chambre froide).Une série de tests de dépistage peut être réalisée afin d&#39;identifier les conditions de purification optimales, y compris la matrice de la colonne appropriée, un tampon, un tampon d&#39;élution et le pH de liaison pour assurer une récupération maximale d&#39;anticorps purifiés à partir de milieux conditionnés (voir la section des résultats). Les conditions optimales dépendent de l&#39;anticorps ou protéine étant purifiée. Les purifications ont été effectuées sur un système FPLC automatisé. Les purifications ont été effectuées à température ambiante en utilisant 5 ml de protéine A colonne. <ol><li> Préparer les tampons suivants en utilisant l&#39;eau ultrapure et ajuster le pH recommandé puis filtrer à travers un filtre de 0,22 um. <ol><li> Préparer 1 litre de tampon phosphate salin (PBS) pH 7,4 (tampon de liaison) en mélangeant ce qui suit: 0,14 M de NaCl, 0,0027 M de KCl, 0,01 M de Na 2 HPO 4 et 0,001 M de KH 2 PO 4. Ajuster le pH si nécessaire avant de filtrer le tampon. </li><li> Préparer 500 ml de 0,1 M de glycine-HCl, pH 2,7 (tampon d&#39;élution). Ajuster le pH avant de filtrer le buffer. </li><li> Préparer 50 ml de 1 M Tris pH (tampon de neutralisation) 9.0. </li></ol></li><li> Veiller à ce que toutes les connexions électriques et de communication du système avec l&#39;ordinateur sont faites. Les appareils doivent être visibles dans le logiciel du module «System Control». Assurer la cellule UV est fixé à 280 nm de longueur d&#39;onde. Facultatif: Calibrer pH-mètre en cas de connexion et à utiliser. </li><li> Immergez tubes d&#39;entrée de A, B et de la pompe de l&#39;échantillon dans de l&#39;eau ultrapure pour laver le système. Purger les pompes avec une seringue s&#39;il y a l&#39;air dans le tube ou un soupçon d&#39;air dans le système. Laver le système avec de l&#39;eau par une opération manuelle via le contrôleur de système ou au moyen d&#39;un procédé automatisé. Observez que la pression, la conductivité, UV280 traçage et le pH restent cohérents et que la limite de pression pour la colonne ne soit pas dépassée selon les spécifications du fabricant. NOTE: Anomalies peuvent indiquer l&#39;air ou de blocage dans le système qui doit être adressée avant de poursuivre. </li><li> Dans le module de commande du système, démarrez le débit à 1ml / min manuellement via la pompe A soit dans la charge (sans passer par la boucle d&#39;échantillon) ou injecter (à travers l&#39;échantillon en boucle) mesure de commencer à connecter la colonne. tubulure du système de déconnexion à l&#39;entrée de position de la colonne et retirer le bouchon reliée à l&#39;entrée de la colonne. <ol><li> Permettre à l&#39;eau de couler goutte à goutte de la tubulure du système au-dessus de la colonne, puis fixer le tube du système à la colonne. Avoir l&#39;entrée de la colonne et de raccord d&#39;entrée débordant de gouttes d&#39;eau assure une connexion sans bulles d&#39;air. </li></ol></li><li> Fixez la sortie de la colonne à la sortie aval et vérifier tous les raccords sont bien fixés. Avec la colonne fixée maintenant au système, ne pas dépasser les limites de la limite de pression maximale et le débit comme indiqué dans les spécifications de la colonne. </li><li> Laver la colonne avec 5 volumes de colonne (VC) d&#39;eau. Si nécessaire, continuer lavage de la colonne jusqu&#39;à ce UV280 traçage est stabilisée. </li><li> Immergez tubes d&#39;entrée de A dans un tampon de liaison, B dans Elution tampon et pompe de prélèvement dans Binding buffer to équilibrer le système dans des tampons appropriés. Remplir les tubes avec un tampon d&#39;entrée à l&#39;aide PumpWash par une opération manuelle. </li><li> Dans le module &#39;Method Editor&#39; du logiciel, utilisez l&#39;assistant de méthode pour configurer une méthode de chromatographie d&#39;affinité pour la colonne qui est destiné à être utilisé. REMARQUE: Les systèmes automatisés FPLC viennent avec des méthodes pré-remplis avec les paramètres recommandés (c. -à -débit et de limite de pression) et exécuter les étapes en fonction de la colonne (fabricant, matrice et la taille) sélectionnée pour la purification. <ol><li> Utiliser les étapes d&#39;exécution suivantes pour la protéine A de chromatographie d&#39;affinité: <ol><li> Equilibrer système avec 5 CV de tampon de liaison et de recueillir accréditive dans le conteneur de déchets. </li><li> Extrait de la charge sur la colonne (volume à charger est spécifiée manuellement dans le procédé) et recueillir flux continu dans un récipient séparé. </li><li> Système de lavage avec 5 CV de tampon de liaison et de recueillir accréditive dans un récipient séparé. </li><li> Colonne éluer avec 5 CV isocratfractionnement IC en utilisant un tampon d&#39;élution et de recueillir des échantillons d&#39;anticorps purifiés comme fractions par un collecteur de fractions. </li><li> Equilibrer système avec 5 CV de tampon de liaison et de recueillir accréditive dans le conteneur de déchets. </li></ol></li></ol></li><li> Une fois que le procédé a été mis en place, indiquer le volume de milieu conditionné à appliquer à la colonne et enregistrer la méthode. NOTE: Le volume spécifié dans la méthode devrait être 5-10 ml de moins que le volume réel pour éviter l&#39;introduction d&#39;air pendant l&#39;essai d&#39;échantillon. Le volume spécifié utilisé dans ce protocole est de 90-120 ml. </li><li> Immerger le tuyau de la pompe de l&#39;échantillon dans le récipient contenant le milieu conditionné. </li><li> Préparer un récipient séparé pour recueillir accréditive échantillon par l&#39;intermédiaire de la tubulure de sortie spécifiée. NOTE: Il est important de recueillir les accréditive dans le cas où une erreur se produit pendant la course ou la capacité de liaison de la colonne est dépassée nécessitant l&#39;accréditive être réappliqué à la colonne ou la purification repeated. </li><li> Préparer des tubes de prélèvement dans le collecteur de fraction. Ajouter 100 pi de tampon de neutralisation par 1 ml de volume de fraction. Le système FPLC sera automatiquement éluer les fractions dans les tubes de collecte. </li><li> Dans le module &#39;System Control&#39; du logiciel, ouvrez la méthode à exécuter. REMARQUE: La méthode run est lancé dans une série de pages qui incluent la vérification des variables de la méthode, la configuration du collecteur de fraction et définissant le nom du fichier de résultat et de l&#39;emplacement de stockage. </li><li> Cliquez sur START pour lancer la course. La course peut être suivie dans le module &#39;System Control&#39;. </li><li> À la fin du cycle de purification, vérifiez le chromatogramme résultant dans le module «évaluation» dans le logiciel du système. </li><li> Combinez toutes les fractions contenant des protéines dans un tube, l&#39;échange de tampon séparé et concentré dans du PBS en utilisant un dispositif de filtre centrifuge à 30 kDa poids moléculaire coupé. Effectuer les étapes de centrifugation selon fabricantinstructions. </li><li> Mesurer la concentration d&#39;anticorps en utilisant un dosage de l&#39;acide bicinchoninique (BCA) selon les instructions du fabricant. </li><li> Si une autre purification exécution doit être effectuée, le premier tuyau de pompe d&#39;échantillon dans un tampon de liaison et répétez les étapes 04.09 à 04.14. </li><li> À la fin de purification courses, immergez tubes d&#39;entrée de A, B et de la pompe de l&#39;échantillon dans de l&#39;eau ultrapure et laver le système et de la colonne telle que pratiquée à l&#39;étape 3. </li><li> Immerger A, B et de l&#39;échantillon tuyau de la pompe dans 20% d&#39;éthanol et répétez la procédure de lavage pour le stockage du système et de la colonne. </li><li> Débranchez la colonne de la sortie en aval et remplacer la colonne d&#39;arrêt, puis débranchez la colonne à l&#39;entrée et remplacer bouchon, rebranchez tube au système. Rangez la colonne à 4 ° C. </li></ol>

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<li>Jiang, Z., Sharfstein, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+butyrate+stimulates+monoclonal+antibody+over-expression+in+CHO+cells+by+improving+gene+accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility.</a> Biotechnol Bioeng. 100 (1), 189-194 (2008).</li>
<li>Jordan, M., Wurm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+adherent+and+suspended+cells+by+calcium+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate.</a> Methods. 33 (2), 136-143 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Ce protocole détaille la transfection, l&#39;expression stable et la purification d&#39;un anticorps thérapeutique dans les cellules HEK-293. L&#39;expression stable des gènes d&#39;anticorps est la première étape dans la génération d&#39;une lignée cellulaire produisant des anticorps pour le développement et la fabrication d&#39;un anticorps thérapeutique. Alors ovaire de hamster chinois (CHO) restent la plate-forme d&#39;expression de choix pour les protéines thérapeutiques, la lignée cellulaire HEK-293 gagne en impor...

Le succès des anticorps thérapeutiques continue à conduire des investissements importants dans le développement d&#39;anticorps comme une vague de produits thérapeutiques de prochaine génération commence. Le marché des anticorps à refaçonné par des fragments d&#39;anticorps 1, conjugués anticorps-médicament 2, des anticorps bispécifiques 3 et des anticorps modifiés avec des propriétés favorables 4. Une autre classe gagne intérêt pharmaceutique sont biosimilaires. anticorps biosimilaires sont «très similaires» répliquer les produits d&#39;un anticorps thérapeutique qui a déjà reçu l&#39;approbation réglementaire. Un biosimilaire proposé doit être comparable avec l&#39;anticorps donneur par rapport à sa structure, la fonction, la toxicité animale, la sécurité clinique et de l&#39; efficacité, la pharmacocinétique humaine (PK), pharmacodynamique (PD) et l&#39; immunogénicité 5, 6. L&#39;approbation rates d&#39;anticorps biosimilaires ont été lents en raison des contraintes strictes sur la qualité finale du produit. Les procédés de fabrication spécifiques exactes, telles que des lignées cellulaires et conditions de culture à travers les dernières étapes de traitement peuvent rester propriétaire. Qui plus est, la fabrication d&#39;anticorps implique intrinsèquement un degré de variabilité qui peut ajouter au défi de produire un produit très similaire. Une caractérisation et la comparaison physicochimique et biophysique global est assez difficile, mais un certain nombre d&#39;études démontrant les caractéristiques des anticorps biosimilaires apparaissent dans la littérature 7, 8, 9. La génération d&#39;un anticorps thérapeutique commence par la transfection de cellules hôtes de mammifère avec un vecteur portant des gènes de l&#39;anticorps respectif. Vector design, les conditions de ligne et de la culture cellulaire sont des éléments essentiels pour la mise en place de l&#39;exSystème de compression. Les séquences d&#39;ADN d&#39;anticorps peuvent provenir de la Banque du médicament (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) ou de publications de recherche, y compris les brevets. Par exemple, la séquence de trastuzumab est disponible par le biais de la Banque Drug (DB ID: DB00072). La séquence d&#39;acides aminés des régions variables peut subir une conception et une optimisation génétique pour la synthèse de l&#39;espèce hôte souhaité. Il est important pour un anticorps biosimilar qu&#39;aucune modification ne soit apportée à la séquence d&#39;acides aminés. Une fois synthétisés, les gènes d&#39;anticorps peuvent être sous-clonés dans le vecteur approprié de choix. Les anticorps IgG humains se composent de deux chaînes lourdes identiques et deux chaînes légères identiques. Expression régulée Étroitement des deux chaînes est essentiel pour une production optimale de la protéine IgG hétérologue dans des cellules de mammifères 10. Intra- ainsi que des liaisons disulfure inter-chaînes doivent être formées et un certain nombre de modifications post-traductionnelles doivent être entroduced pendant la biosynthèse des protéines. Un certain nombre de vecteurs sont disponibles qui ont été conçus spécifiquement pour exprimer des gènes d&#39;anticorps (voir le tableau des matériaux). Ces vecteurs expriment des anticorps spécifiques à des régions constantes généralement à la fois des chaînes lourdes et légères de sorte que seules les régions variables de chaque chaîne nécessitent le clonage. La transfection de cellules avec deux constructions indépendantes (co-transfection) est l&#39;approche la plus courante pour la délivrance de gènes de la chaîne codant lourdes et légères. Autrement dit, chaque gène est entraînée par son propre promoteur et transcrit sous forme de chaînes d&#39;anticorps séparées avant d&#39;être assemblés dans le réticulum endoplasmique. D&#39;autre part, des vecteurs multi-cistroniques comportent des éléments internes du ribosome entry site (IRES) incorporées qui permettent l&#39; expression de gènes multiples comme un seul transcrit d&#39;ARNm avec une traduction permise à partir de régions internes de l&#39;ARNm 11. Dans ce cas, les gènes codant pour des chaînes lourdes et légères sont couplées à une arrangEMENT pour réaliser la co-expression des deux chaînes d&#39; anticorps 10, 12. Alors que les cellules produisent une protéine transfectées de manière transitoire suffisante pour effectuer un nombre limité d&#39;expériences, des lignées de cellules transfectées de manière stable qui ont subi une sélection pour l&#39;intégration du génome peuvent fournir des rendements plus élevés. Des quantités plus élevées de protéines permettent le développement de tests relatifs à la caractérisation in vitro peuvent fournir une indication de la qualité de l&#39; anticorps en contrepartie des applications en aval telles que la lignée cellulaire clonale et la sélection des candidats au plomb. Le but de cet article est de décrire l&#39;expression stable et la purification d&#39;un anticorps thérapeutique produite dans un système d&#39;expression mammalien. En effet, cette méthode peut être appliquée à l&#39;expression d&#39;un anticorps biosimilar. La méthode peut être utilisée pour la caractérisation initiale des anticorps avant de procéder à la critique, mais ste de tempsps d&#39;identifier un clone souhaitable pour agrandir la fabrication à grande échelle. En outre, ce procédé peut être utilisé pour exprimer d&#39;autres protéines et non seulement des anticorps. Le protocole détaillé ci-dessous décrit l&#39;expression de thérapeutique trastuzumab d&#39;anticorps. Il est composé de la préparation d&#39;ADN vecteur, suivie par une transfection stable dans la lignée cellulaire HEK-293 et ​​la purification de la protéine d&#39;anticorps par une méthode de chromatographie automatisée.

<table><tbody><tr><td>Série de vecteurs pFUSE</td><td>InvivoGen</td><td>N/A</td><td>Gènes d’anticorps lourds et légers exprimés dans des vecteurs distincts qui nécessitent une co-transfection.</td></tr><tr><td>Série vectorielle mAbXpress</td><td>ACYTE Biotech Pty Ltd.</td><td></td><td>Gènes d’anticorps lourds et légers exprimés dans des vecteurs distincts qui nécessitent une co-transfection. Renvoi : Jones, M. L. et al. Procédé de reformatage rapide, indépendant de la ligature, d’anticorps monoclonaux recombinants. J Méthodes immunitaires. 354 (1-2), 85-90, doi :10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).</td></tr><tr><td>Vecteur pVITRO1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Les gènes des anticorps lourds et légers sont chacun pilotés par un promoteur distinct dans un seul vecteur. Voir : Dodev, T. S. et al. Une trousse d’outils pour le clonage rapide et l’expression d’anticorps recombinants. Sci Rep. 4 5885, doi :10.1038/srep05885, (2014).</td></tr><tr><td>Vecteur</td> multi-cistronique <td>Lonza</td><td></td><td>avec des gènes d’anticorps lourds et légers co-exprimés et traduits en transcrit unique.</td></tr><tr><td>Vecteur multi-cistronic série 1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Vecteur multi-cistronique avec des gènes d’anticorps lourds et légers co-exprimés et traduits sous forme de transcrit unique. Se référer à : Li, J. et al. Une étude comparative de différents modèles de vecteurs pour l’expression chez les mammifères d’anticorps IgG recombinants. J Méthodes immunitaires. 318 (1-2), 113-124, doi :10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).</td></tr><tr><td>Vecteur multi-cistronic série 2</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Vecteur multi-cistronique avec des gènes d’anticorps lourds et légers co-exprimés et traduits en transcrit unique. Voir : Ho, S. C. et al. Vecteurs tricistroniques médiés par IRES pour améliorer la génération de lignées cellulaires CHO exprimant des anticorps monoclonaux élevés. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi :10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).</td></tr><tr><td>pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&kappa ;</td><td>Addgene</td><td>61883</td><td>Vecteur d’expression de mammifère contenant des gènes d’anticorps de trastuzumab avec gène de résistance à l’hygromycine ; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&kappa ; était un cadeau d’Andrew Beavil.</td></tr><tr><td>Fast-Media Hygro Agar</td><td>Jomar Life Research</td><td>fas-hg-s</td><td>Utilisé pour préparer la gélose LB à faible teneur en sel contenant 75 & micro ; g/ml d’hygromycine.</td></tr><tr><td>Fast-Media Hygro TB</td><td>Jomar Life Research</td><td>fas-hg-l</td><td>Utilisé pour préparer un bouillon de TB à faible teneur en sel contenant 75 & micro ; g/ml d’hygromycine.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Glycérol, BioXtra, &ge ; 99 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td>Préparer à 80 % avec de l’eau et de l’autoclave. Conserver à température ambiante.</td></tr><tr><td>Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit</td><td>Astral Scientific</td><td>G221020</td><td>Plasmid Maxi Prep Kit ; éluer ou remettre en suspension l’ADN dans l’eau (pH 7,0-8,5).</td></tr><tr><td>FreeStyle 293-F Cells</td><td>Life Technologies</td><td>R790-07</td><td>HEK-293 : Lignée cellulaire adaptée à la culture en suspension en milieu sans sérum.</td></tr><tr><td>FreeStyle 293 Expression Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td>Milieu sans sérum spécialement formulé pour le maintien de la lignée cellulaire 293-F et de l’expression à haute teneur en protéines.</td></tr><tr><td>Kolliphor P188</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4894</td><td>Tensioactif non ionique ; pluronique F-68 ; préparer à 10 % dans l’eau et filtrer-stériliser à l’aide de 0,22 &mu ; Filtre M. Conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td>DMEM, glycémie élevée&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylénimine, linéaire, MW 25,000&nbsp ;</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966</td><td>Préparer à 1 mg/ml dans l’eau. Ajuster à pH 7,0 avec 1 M HCl (la solution devient claire) et filtrer-stériliser avec 0,22 &mu ; Filtre M. Conserver à -80 &deg ; C jusqu’à l’utilisation.</td></tr><tr><td>OptiPro SFM</td><td>Life Technologies</td><td>12309-050</td><td>Milieu sans sérum formulé par transfection</td></tr><tr><td>Hygromycine B Solution</td><td>Jomar Life Research</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AJA2225</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone (caséine peptone)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0042B</td><td>Préparer à 20 % dans du PBS et filtrer la stérilisation à l’aide de 0,22 &mu ; Filtre M. Conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td>Comprimés de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4, 100 ml</td><td>Astral Scientific</td><td>09-2051-100</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Protein A High Performance, 1 colonne de 5 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0403-01</td><td></td></tr><tr><td>AKTApurifier 100</td><td>GE Healthcare</td><td>28406266</td><td>Système FPLC automatisé, qui peut inclure une pompe d’échantillonnage P-960 et un collecteur de fractions Frac-920.</td></tr><tr><td>Glycine-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2879</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique, monohydraté</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOC2123</td><td></td></tr><tr><td>Citrate de sodium, sel trisodique dihydraté.</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOCB0035</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl solution pH 9,0</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOSD8146</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centrifuge Filters (30 MWCO)</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC803008/UFC903008</td><td>Utilisé pour tamponner, échanger et concentrer les protéines purifiées.</td></tr><tr><td>Kit de dosage de l’acide bicinchoninique Pierce (BCA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>BLItz System</td><td>fort&eacute ; BIO</td><td>45-5000</td><td>Instrument utilisé pour les mesures d’interférométrie de biocouche (BLI).</td></tr><tr><td>Biocapteurs de protéine A</td><td>fort&eacute ; BIO</td><td>18-5010</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide/Bisacrylamide (37,5:1), solution à 40 %</td><td>Astral Scientific</td><td>786-502</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium (APS)</td><td>Astral Scientific</td><td>AM0486</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Astral Scientific</td><td>AM0761</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Astral Scientific</td><td>786-498</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protéine bicolore 1610374</td><td></td><td></td> <td>Bio-Rad</td> standard</tr></tbody></table>

l&#39;échelle du laboratoire: production et purification d&#39;un anticorps thérapeutique

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Assurer la production réussie d’un anticorps thérapeutique commence dès le début du processus de développement. La première étape est l’expression vectorielle des gènes de l’anticorps, suivie d’une transfection stable dans une lignée cellulaire appropriée. Les clones stables sont soumis à un criblage afin de sélectionner les clones présentant les caractéristiques de production et de croissance souhaitées. Il s’agit d’une étape cruciale, bien que chronophage, dans le processus. Ce protocole prend en compte la sélection des vecteurs et l’approvisionnement des séquences d’anticorps pour l’expression d’un anticorps thérapeutique. Les méthodes décrivent la préparation de l’ADN vecteur pour la transfection stable d’une variante en suspension de la lignée cellulaire du rein embryonnaire humain 293 (HEK-293), à l’aide de polyéthylénimine (PEI). Les cellules sont transfectées en tant que cellules adhérentes dans des milieux contenant du sérum pour maximiser l’efficacité de la transfection, puis adaptées à des conditions sans sérum. La production à grande échelle, configurée sous forme de cultures par lots, est utilisée pour produire des protéines d’anticorps qui sont purifiées par chromatographie d’affinité à l’aide d’un instrument automatisé de chromatographie liquide à protéines rapides (FPLC). Les rendements en anticorps produits par cette méthode peuvent fournir suffisamment de protéines pour commencer la caractérisation initiale de l’anticorps. Il peut s’agir de la mise au point d’essais in vitro ou d’une caractérisation physicochimique pour faciliter la tâche fastidieuse du criblage clonal des principaux candidats. Cette méthode peut être transférable au développement d’un système d’expression pour la production d’anticorps biosimilaires.

Production stable de trastuzumab par transfectées cellules HEK-293 a été confirmée à l&#39; aide de bio-couche interférométrie (BLI) tel que présenté dans la figure 1. Une courbe standard d&#39; IgG a été générée en mesurant le taux de liaison entre un niveau d&#39;anticorps IgG et la protéine A biocapteur (figure 1A). L&#39;échantillon de surnageant brut a été mesuré de manière similaire, alors que sa concentration interpolée à partir de la courbe étalo...

Ce protocole décrit la production d&#39;un anticorps thérapeutique dans un système d&#39;expression mammalien. Les procédés décrits comprennent la préparation d&#39;ADN vecteur, la transfection stable et l&#39;adaptation d&#39;une lignée de cellules embryonnaires de rein 293 humaine sans sérum, mis en place des cultures à grande échelle et la purification par chromatographie d&#39;affinité.

L&#39;échelle du laboratoire: Production et purification d&#39;un anticorps thérapeutique

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

L'objectif général de cette méthode est de développer un système d'expression sans sérum à haut rendement pour la production à l'échelle du laboratoire d'un anticorps thérapeutique. Cette méthode peut répondre à des considérations clés dans la conception d'un système d'expression d'anticorps, telles que la production d'une lignée cellulaire stable, l'ajout de suppléments et l'optimisation des stratégies de purification. Le principal avantage de cette technique est que la production d'une lignée cellulaire stable adaptée au milieu sans sérum permettra d'obtenir des quantités robustes et reproductibles d'anticorps thérapeutique.Pour commencer, cultivez des cellules HEK-293 selon les protocoles standard dans un milieu sans sérum supplémenté avec 0,1 % de tensioactif non ionique, dans des flacons Erlenmeyer. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone à 120 rotations par minute. Maintenez la culture à deux fois 10 à la puissance 5 cellules par millilitre et repiquez tous les quatre jours.La veille de la transfection, ensemencer les cellules HEK-293 à raison de trois fois dix puissance cinq cellules par millilitre dans les puits d'une plaque de 12 puits, avec d

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Un haut-débit, plate-forme automatisée de développement des cellules de fabrication pour produire des protéines thérapeutiques est décrite. La mise en œuvre de la BD FACS Aria trieur de cellules, CloneSelect Imager et TECAN Freedom EVO système de manipulation de liquides a démontré la capacité de traitement significativement augmenté dans le développement de la lignée cellulaire avec une qualité améliorée de lignée cellulaire et la reproductibilité élevée.

Une plate-forme à haut débit automatisé pour le développement de lignées cellulaires de fabrication des protéines thérapeutiques

Cette vidéo présente une technique permettant d’étudier la localisation in vivo d’anticorps spécifiques à une tumeur dans un modèle de xénogreffe de tumeur chez la souris. Lors de l’injection sous-cutanée de cellules cancéreuses dans des souris pour la formation de tumeurs, des anticorps marqués par fluorescence sont injectés qui se lient à des récepteurs spécifiques de la tumeur, permettant une évaluation in vivo de la localisation des anticorps par imagerie.

Technique d’évaluation de la localisation in vivo d’anticorps spécifiques à une tumeur

La vidéo explique le processus de production d’anticorps dans les cellules hôtes de mammifères, de l’expression des gènes à la sécrétion. Il implique la transcription, la traduction, la reconnaissance du signal, le repliement correct et la libération éventuelle dans le milieu extracellulaire via des vésicules sécrétoires.

Production et purification d’anticorps recombinants à partir de cellules de mammifères

Cette vidéo présente un test de purification des anticorps monoclonaux à partir de fluides de culture cellulaire prélevés sur des cellules ovariennes de hamster chinois. Il utilise une résine de verre poreuse avec de la protéine A immobilisée, qui se lie à la région Fc des anticorps de l’échantillon, les séparant efficacement des contaminants. L’utilisation d’un tampon d’élution à faible pH affaiblit l’interaction, facilitant la récupération des anticorps purifiés.

Technique de purification des anticorps monoclonaux produits par les cellules ovariennes de hamster chinois

La vidéo présente une méthode de production d’anticorps thérapeutiques à l’aide de cellules de mammifères transfectées de manière stable. La supplémentation en tryptone stimule la division cellulaire, ce qui entraîne une prolifération et favorise un rendement en anticorps plus élevé. Le milieu contenant des anticorps est récolté, filtré et stocké pour une utilisation ultérieure.

Production d’anticorps à partir d’une culture de prolifération discontinue de cellules de mammifères transfectées

Cette vidéo présente une technique de purification des anticorps monoclonaux à partir du surnageant de culture obtenu à partir d’une culture cellulaire productrice d’anticorps. Le processus implique l’utilisation d’une matrice de billes d’agarose réticulée avec de la protéine A conjuguée, qui immobilise les anticorps du surnageant sur les billes, permettant une séparation efficace des contaminants. En appliquant un tampon d’élution à faible pH, l’interaction protéine A-anticorps est relâchée,...

Technique de chromatographie d’affinité pour la purification d’anticorps monoclonaux

Cette vidéo présente une méthode pour détecter les souches cyanobactériennes dans un échantillon environnemental à l’aide d’une puce à microréseaux d’anticorps. Les échantillons porteurs de diverses bactéries interagissent avec les anticorps imprimés, et l’immunomarquage avec des anticorps anti-cyanobactéries marqués au fluorophore révèle la présence de souches cyanobactériennes spécifiques par fluorescence à des endroits distincts.

Technique de détection de souches cyanobactériennes à l’aide d’une puce à microréseau d’anticorps

La présence de toxines cyanobactériennes dans les réservoirs d’eau douce destinée à la consommation humaine est une préoccupation majeure pour les autorités chargées de la gestion de l’eau. Afin d’évaluer le risque de contamination de l’eau, cet article décrit un protocole de détection sur le terrain des souches de cyanobactéries dans des échantillons liquides et solides à l’aide d’une puce à microréseaux d’anticorps.

Protocole expérimental pour la détection cyanobactéries Dans les échantillons liquides et solides avec un anticorps Microarray Chip

Un protocole détaillé pour la purification et l'analyse suivante d'un anticorps monoclonal du fluide de culture cellulaire récolté (HCCF) des microbioréacteurs automatisés a été décrit. L'utilisation de l'analyse pour déterminer les attributs de qualité critiques (CqA) et la maximisation du volume limité de l'échantillon pour extraire des informations vitales sont également présentées.

Purification et analyse d'un anticorps monoclonal à partir de cellules ovaires de hamster chinois à l'aide d'un système automatisé de microbioréacteur

Ici nous présentons un protocole pour étudier la localisation in vivo des anticorps dans les modèles de xénogreffe de tumeur de souris.

Analyse de la distribution des tumeurs et des tissus de l’anticorps thérapeutique spécifique à l’antigène cible

Apprenez la production d'anticorps thérapeutiques à l'échelle laboratoire en utilisant des cellules HEK-293 adaptées à un milieu sans sérum. Cette méthode optimise la transfection stable et la purification par chromatographie d'affinité.

L'échelle du laboratoire: Production et purification d'un anticorps thérapeutique

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