Name: Laboratoriumschaal Productie en zuivering van een therapeutisch antilichaam (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Leer hoe u een serumvrij expressiesysteem opzet voor de productie van therapeutische antilichamen met HEK-293-cellen. Deze methode omvat stabiele transfectie, adaptatie en zuivering via affiniteitschromatografie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Het onderzoek werd ondersteund door de Universiteit van Sydney. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was een geschenk van Andrew Beavil (Addgene plasmide # 61883). We danken Tihomir S. Dodev voor nuttige discussies met betrekking tot pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ.

OPMERKING: Een geschikte zoogdierlijke expressievector worden gebruikt voor dit protocol. Hier is een enkel construct dat twee expressiecassettes gebruikt (bijvoorbeeld zware en lichte keten expressie wordt aangedreven door afzonderlijke promoters). Trastuzumab zware en lichte ketens zijn eerder gekloond in de vector. Deze vector was een geschenk van Andrew Beavil, verkregen door middel van een not-for-profit plasmide repository 13. 1. Herstel en opschaling van Vector DNA LET OP: Vector DNA werd ontvangen als een zachte agar steek cultuur in Escherichia coli XL-1 Blue-stam; vector draagt ​​hygromycine resistentie. <ol><li> Plaats een steriele enting stab of lus in de zachte agar van de stab cultuur dan streak een Luria Bertani (LB) agarplaat bereid met 75 ug / ml hygromycine voor geïsoleerde kolonies. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 18-24 uur. </li><li> Inoculeer een enkele kolonie in 5 ml Terrific bouillon (TB) met 75 ug / ml hygromycine. Incubate van de cultuur bij 37 ° C gedurende 18-24 uur met 225 rpm schudden. </li><li> Gebruik de overnachtkweek een glycerol stock van vector-DNA te bereiden door voorzichtig mengen 800 pl kweek met 200 pi 80% glycerol in een cryovial en bevriezen bij -80 ° C. <ol><li> Voeg 100 ul van de kweek van een nacht tot 100 ml TB met 75 ug / ml hygromycine in een verbijsterd schudkolf (dus 1/1000 verdunning). Incubeer de cultuur bij 37 ° C gedurende 18-24 uur met 225 rpm schudden. </li></ol></li><li> Na een nacht cultuur, extraheren en zuiveren van het DNA volgens de instructies van de midi / maxi voorbereiding kit met de volgende uitzondering fabrikant; tijdens de laatste stap, elueren of resuspendeer DNA met water (pH 7,0-8,5). </li><li> Bekijk concentratie en zuiverheid van DNA door absorptiemetingen bij 260 en 280 nm bewaar DNA bij -20 ° C. LET OP: Optioneel (sterk aanbevolen): Sequence DNA met behulp van vector-specifieke primers om de identiteit te bevestigen. </li></ol> 2. Stabiele transfectie van HEK-293 cellen <ol><li> Groeien en onderhouden HEK-293-cellen (suspensiecellen) volgens standaardprotocollen in serumvrij medium aangevuld met 0,1% niet-ionogene oppervlakteactieve stof in erlenmeyers. Handhaven op 2 x 10 5 cellen / ml en subcultuur elke vierde dag. Kweekcellen bij 37 ° C met 5% CO2 en 120 rpm rotatie. OPMERKING: De cellen moeten in kweek zijn niet minder dan 4 dagen en niet meer dan 4 weken voor transfectie. HEK-293-cellen gekweekt als monolagen in serum-bevattend medium kan ook worden gebruikt voor deze procedure. </li><li> Op de dag voor transfectie, zaad HEK-293-cellen in 3 x 10 5 cellen / ml in putjes van een 12-well plaat in 2 ml Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media (DMEM) aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum ( FBS). Op de dag van de transfectie, controleer dan of de cellen 80-90% confluentie hebben bereikt </li><li> Verdun DNA en polyethyleenimine (PEI) afzonderlijk transfectie media vervolgens met elkaar mengen.<ol><li> Verdun 1,25 pg vector DNA per putje (15 ug voor 12 putjes) in 300 ul transfectie media. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. </li><li> Verdun 2,5 pl 1 mg / ml PEI-oplossing (30 gl van 12 putjes, dat wil zeggen 1: 2-verhouding van DNA tot PEI) in 300 ul transfectie media. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. </li><li> Voeg verdunde DNA verdund PEI, meng en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min. </li></ol></li><li> Voeg 50 ul van DNA / PEI mengsel druppelsgewijs toegevoegd aan elk putje van de plaat. Schommel de plaat voorzichtig te verdelen de transfectie mengsel Plaats de plaat bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 24 uur. </li><li> Voeg 50 ug / ml hygromycine B per well en de plaat terug naar 37 ° C, 5% CO2 gedurende 10 dagen. OPMERKING: Op dag 10, wordt niet-getransfecteerde cellen stierven hebben en losgemaakt van het oppervlak van de plaat, terwijl stabiel getransfecteerde cellen levensvatbaar en aan de plaat is. </li><li> Vervang de media in putjes met1/4 volume serumvrije media en 3/4 volume DMEM aangevuld met 10% FBS (dwz 0,5 ml serumvrij medium + 1,5 ml DMEM = 7,5% uiteindelijke serumconcentratie) en incubeer gedurende 4 dagen. </li><li> Vervang de media in putjes met 1/2 volume serumvrij medium en 1/2 volume DMEM aangevuld met 10% FBS (dwz 1 ml serumvrij medium + 1 ml DMEM = 5% uiteindelijke serumconcentratie) en incubeer gedurende 4 dagen. </li><li> Vervang de media in putjes met 3/4 volume serumvrij medium en 1/4 volume DMEM aangevuld met 10% FBS (dwz 1,5 ml serumvrij medium + 0,5 ml DMEM = 2,5% uiteindelijke serumconcentratie) en incubeer gedurende 4 dagen. </li><li> Vervang de media in putjes met 2 ml serum-vrij medium aangevuld met 0,1% niet-ionogene oppervlakteactieve stof (dat wil zeggen 0% uiteindelijke serumconcentratie) en incubeer gedurende 4 dagen. OPMERKING: Onderhoud 50 ug / ml hygromycine B selectieve druk op cellen in serumvrij adaptatie. Cellen aangepast aan serumvrije media los van het oppervlak van putjes en kunnen i clustern suspensie. Zie stap 2,1 kweekomstandigheden voor de aanvullende toeslag van 50 ug / ml hygromycine B. </li><li> Met behulp van een pipet, meng de schorsing culturen in de 12-well plaat en het zwembad cellen in een aparte buis. <ol><li> Met behulp van een hemocytometer sommen samengevoegd cellen en zaad in 30 ml serumvrij medium in een Erlenmeyer kolf van 2 x 10 5 cellen / ml. Kweekcellen bij 37 ° C met 5% CO2 en 120 rpm rotatie. Subculture en uit te breiden elke vierde dag. </li></ol></li><li> Blijf cultuur maat breiden de vereiste celdichtheid 10 injectieflacons verkrijgen bij 1 x 10 7 cellen / flesje voor cryopreservatie in vloeibare stikstof. Bevries de cellen in serumvrij medium dat 10% dimethylsulfoxide (DMSO). OPMERKING: Geconditioneerd medium dat antilichaam kan worden geoogst op elk subcultuur eiwitproductie bevestigen of worden gebruikt om zuivering te optimaliseren. Om geconditioneerde media oogsten en cellen voor subcultuur te handhaven, centrifuge de cultuur bij300 g gedurende 5 minuten vervolgens filteren steriliseren supernatant door een 0,22 pm filter. Gefiltreerd supernatant bij 4 ° C gedurende 1-2 weken tot -20 ° C voor langere termijn opslag bewaard. </li></ol> 3. Grootschalige productie van antistoffen uit Batch overwoekeren Cultuur LET OP: Antibody productie kan worden gevolgd op vanaf stap 2.11 waar de bestaande cellen worden uitgebreid naar de gewenste cel dichtheid op basis van de partij overwoekeren cultuur volume in te stellen zijn. Anders cellen die zijn ontdooid uit cryopreservatie beginnen in dit stadium keer uitgebreid tot een geschikte celdichtheid en volume. Verschillende cultuur supplementen kunnen worden gebruikt om antilichaamproductie te optimaliseren; het gebruik trypton stijgen antilichaam opbrengst gedemonstreerd in dit protocol. <ol><li> Zaadcellen bij 2 x 10 5 cellen / ml in 100 ml serumvrij medium in twee erlenmeyers (antilichaam opbrengst van niet-gesupplementeerd nutriënt en aangevuld kweken vergelijken). Cultuur aan 37 ° C, 5% CO 2 </sub&gt; en 120 rpm. </li><li> Na 24 uur, voeg trypton tot een uiteindelijke concentratie van 0,5% tot nutriënt kweek aangevuld. Egaliseren volume-un aangevuld cultuur met serum-vrije media. </li><li> Vanaf dag 8, het uitvoeren van cel-tellingen van de culturen dagelijks met behulp van een hemocytometer levensvatbaarheid van de cellen te controleren. Oogst de kweeksupernatanten eenmaal levensvatbaarheid van de cellen minder dan 80% is. <ol><li> Harvest supernatant door centrifugeren van de culturen bij 3.000 g gedurende 15 min vervolgens filteren-steriliseren de bovenstaande vloeistof (met antilichaam) door een 0,22 pm filter. Bewaar de supernatanten bij 4 ° C (korte termijn) of invriezen bij -20 ° C (op lange termijn). </li></ol></li></ol> 4. Antilichaam Zuivering door affiniteitschromatografie met behulp van een geautomatiseerde Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System OPMERKING: De volgende procedure kan algemeen worden toegepast op de meeste geautomatiseerde systemen. Zuivering kan worden uitgevoerd bij kamertemperatuur of bij 4 ° C (of FPLC systeem in een koele ruimte wordt gehouden).Een reeks scouting tests kunnen worden uitgevoerd om de optimale zuivering voorwaarden aangeeft waaronder juiste kolom matrix, bindingsbuffer en elutiebuffer pH om maximale terugwinning van gezuiverd antilichaam uit geconditioneerde media te verzekeren (zie resultaten sectie). De optimale omstandigheden afhankelijk van het antilichaam of eiwit te zuiveren. Zuiveringen werden uitgevoerd op een FPLC systeem geautomatiseerd. Zuiveringen werden uitgevoerd bij kamertemperatuur met een 5 ml proteïne A-kolom. <ol><li> Bereid de volgende buffers met behulp van ultrapuur water en aan te passen aan de aanbevolen pH vervolgens filteren door een 0,22 pm filter. <ol><li> Bereid 1 L fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4 (bindingsbuffer) door mengen van de volgende: 0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M Na 2 HPO 4 en 0,001 M KH 2 PO 4. Stel de pH indien nodig voor het filteren van de buffer. </li><li> Bereid 500 ml 0,1 M glycine-HCl pH 2,7 (elutiebuffer). Stel de pH voor het filteren van het buffER. </li><li> Bereid 50 ml van 1 M Tris pH 9,0 (neutralisatie buffer). </li></ol></li><li> Zorg ervoor dat alle systeemvermogen en communicatieverbindingen met de computer zijn gemaakt. Apparaten moeten zichtbaar zijn in de software &#39;System Control&#39; module. Zorg ervoor dat UV-cel is vastgesteld op 280 nm golflengte. Optioneel: Kalibreer pH meter indien aangesloten en te gebruiken. </li><li> Dompel inlaatbuizen van A, B en monster pomp ultrazuiver water om het systeem te wassen. Spoel de pompen met een injectiespuit als er lucht in de slang of een vermoeden van lucht in het systeem. Was het systeem met water door handmatige bediening via het systeem controller of via een geautomatiseerde methode. Zien dat druk, geleidbaarheid, pH UV280 opsporing en coherent blijven en dat de drukgrens van de kolom niet wordt overschreden volgens specificatie van de fabrikant. LET OP: Afwijkingen kunnen lucht of blokkade te geven in het systeem dat alvorens verder te gaan moet worden aangepakt. </li><li> In het systeem controller module, start de stroomsnelheid 1ml / min handmatig via pomp A in ofwel belasting (omzeilen monsterlus) of injecteren (via de monsterlus) te kunnen beginnen verbinden van de kolom. Koppel systeem slangen op de positie kolom inlaat en verwijder de stop verbonden aan de kolom inlaat. <ol><li> Er water uit het systeem druppelsgewijs buis stroomt bovenop de kolom bevestig het systeem slang aan de kolom. Het hebben van de kolom inlaat en inlaatfitting vol met druppels water zorgt voor een verbinding vrij is van luchtbellen. </li></ol></li><li> Bevestig de uitlaat kolom bij het stroomafwaartse uitlaat en controleer alle aansluitingen zijn stevig vastgemaakt. Met de kolom nu aangesloten op het systeem, niet overschrijden zoals uiteengezet in kolom specificaties limieten voor maximum debiet en druk. </li><li> Was de kolom met 5 kolomvolumes (CV) van het water. Indien nodig blijven kolom wassen totdat UV280 tracing is gestabiliseerd. </li><li> Dompel inlaatbuizen van A in bindende buffer, B in elutiebuffer en bemonsteringspomp in bindingsbuffer to equilibreren het systeem juiste buffers. Vul de inlaat buizen met behulp van buffer PumpWash door handmatige bediening. </li><li> In module van de software van de &#39;Method Editor&#39;, gebruikt u de methode wizard om setup een affiniteit chromatografie methode voor de kolom die is bestemd om te worden gebruikt. LET OP: Geautomatiseerde FPLC systemen worden geleverd met methoden pre-gevuld met de aanbevolen instellingen (bv debiet en de druk limiet) en voer stappen op basis van de kolom (fabrikant, matrix en grootte) geselecteerd voor zuivering. <ol><li> Gebruik de volgende run stappen voor eiwit A affiniteitschromatografie: <ol><li> Evenwicht systeem met 5 CV van bindingsbuffer en het verzamelen van doorstroom in de afvalcontainer. </li><li> Laad het monster op de kolom (volume te laden handmatig bij de methode) en laat doorloop in een afzonderlijke houder. </li><li> Wash-systeem met 5 CV van bindingsbuffer en het verzamelen van doorstroom in een aparte container. </li><li> Elueer kolom met 5 CV isocratic fractionering met behulp van elutiebuffer en het verzamelen van gezuiverd antilichaam monster zoals breuken door breuk verzamelaar. </li><li> Evenwicht systeem met 5 CV van bindingsbuffer en het verzamelen van doorstroom in de afvalcontainer. </li></ol></li></ol></li><li> Zodra de werkwijze setup is, geeft de hoeveelheid geconditioneerde medium wordt op de kolom gebracht en de werkwijze slaan. LET OP: Het opgegeven volume in de methode moeten 5-10 ml minder dan het werkelijke volume aan de invoering van de lucht tijdens het monster run te voorkomen. De opgegeven volume gebruikt in dit protocol is 90-120 ml. </li><li> Dompel het monster pomp slang in het vat met de geconditioneerde media. </li><li> Bereid een aparte container sample doorstroom verzamelen via de opgegeven uitlaat slang. NB: Het is belangrijk om de doorstroming in het geval er een fout optreedt tijdens de run of het bindend vermogen van de kolom te verzamelen wordt overschreden waarbij de doorstroom om opnieuw worden toegepast op de kolom of de zuivering repeated. </li><li> Bereid collectie buizen in de fractie collector. Voeg 100 pl neutralisatiebuffer per 1 ml fractievolume. Het FPLC systeem automatisch de fracties elueren in de verzamelbuizen. </li><li> In het &#39;Systeem Control&#39; module van de software, opent u de methode worden uitgevoerd. OPMERKING: De methode run wordt gestart in een reeks van pagina&#39;s die onder controle van de variabelen van de methode, fractie collector setup en het definiëren van resultaat de bestandsnaam en opslaglocatie. </li><li> Klik op START om de run te starten. De run kan worden gevolgd in het &#39;System Control-module. </li><li> Bij de voltooiing van de zuivering run, controleer de resulterende chromatogram in het &#39;Evaluation&#39; module in de systeemsoftware. </li><li> Combineer alle eiwitbevattende fracties in een afzonderlijke buis, bufferuitwisseling en concentreer in PBS met behulp van een centrifugaal filterinrichting met 30 kDa molecuulgewicht af. Voer centrifugatiestappen volgens de fabrikantinstructies. </li><li> Meet antilichaamconcentratie via bicinchoninezuur assay (BCA) volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Als een andere zuivering run moet worden uitgevoerd, prime het monster pomp slang in bindingsbuffer en herhaal stap 4,9-4,14. </li><li> Bij de voltooiing van zuivering runs, dompel inlaatbuizen van A, B en monster pomp ultrazuiver water en was het systeem en kolom zoals uitgevoerd in stap 3. </li><li> Onderdompelen A, B en monster pompslang in 20% ethanol en herhaal wasprocedure voor opslag van het systeem en kolom. </li><li> Kolom los van de stroomafwaartse uitlaat en vervang kolom stop erop en koppelt kolom bij de inlaat en stop vervangen, opnieuw slang aan het systeem. Bewaar de kolom bij 4 ° C. </li></ol>

<ol><li>Nelson, A. L., Reichert, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+trends+for+therapeutic+antibody+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Development trends for therapeutic antibody fragments.</a> Nat Biotechnol. 27 (4), 331-337 (2009).</li>
<li>Drake, P. M., Rabuka, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+playbook+for+antibody-drug+conjugates%3A+lessons+from+the+laboratory+and+clinic+suggest+a+strategy+for+improving+efficacy+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">An emerging playbook for antibody-drug conjugates: lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for improving efficacy and safety.</a> Curr Opin Chem Biol. 28, 174-180 (2015).</li>
<li>Kontermann, R. E., Brinkmann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Bispecific antibodies.</a> Drug Discov Today. 20 (7), 838-847 (2015).</li>
<li>Beck, A., Wurch, T., Bailly, C., Corvaia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+and+challenges+for+the+next+generation+of+therapeutic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies.</a> Nat Rev Immunol. 10 (5), 345-352 (2010).</li>
<li>Food and Drug Administration. 22, Food and Drug Administration. eds U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), & Center for Biologics Evaluation and Research (CBER) (2015).</li>
<li>European Medicines Agency. 13, European Medicines Agency. eds European Medicines Agency (EMA) & Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) (2014).</li>
<li>Lopez-Morales, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+and+biological+characterization+of+a+biosimilar+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Physicochemical and biological characterization of a biosimilar trastuzumab.</a> Biomed Res Int. 2015, 427235(2015).</li>
<li>Jung, S. K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25517302">Physicochemical characterization of Remsima.</a> MAbs. 6 (5), 1163-1177 (2014).</li>
<li>Visser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+and+functional+comparability+between+the+proposed+biosimilar+rituximab+GP2013+and+originator+rituximab%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab.</a> BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+different+vector+designs+for+the+mammalian+expression+of+recombinant+IgG+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies.</a> J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124 (2007).</li>
<li>Fitzgerald, K. D., Semler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+IRES+elements+in+mRNAs+to+the+eukaryotic+translation+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Bridging IRES elements in mRNAs to the eukaryotic translation apparatus.</a> Biochim Biophys Acta. 1789 (9-10), 518-528 (2009).</li>
<li>Ho, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRES-mediated+Tricistronic+vectors+for+enhancing+generation+of+high+monoclonal+antibody+expressing+CHO+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines.</a> J Biotechnol. 157 (1), 130-139 (2012).</li>
<li>Dodev, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tool+kit+for+rapid+cloning+and+expression+of+recombinant+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies.</a> Sci Rep. 4, 5885(2014).</li>
<li>Walsh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+protein+biopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of protein biopharmaceuticals.</a> Drug Discov Today. 15 (17-18), 773-780 (2010).</li>
<li>Backliwal, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+vector+design+and+multi-pathway+modulation+of+HEK+293E+cells+yield+recombinant+antibody+titers+exceeding+1+g%2Fl+by+transient+transfection+under+serum-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions.</a> Nucleic Acids Res. 36 (15), 96(2008).</li>
<li>Bebbington, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+expression+of+a+recombinant+antibody+from+myeloma+cells+using+a+glutamine+synthetase+gene+as+an+amplifiable+selectable+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker.</a> Biotechnology (N Y). 10 (2), 169-175 (1992).</li>
<li>Kaufman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coamplification+and+coexpression+of+human+tissue-type+plasminogen+activator+and+murine+dihydrofolate+reductase+sequences+in+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coamplification and coexpression of human tissue-type plasminogen activator and murine dihydrofolate reductase sequences in Chinese hamster ovary cells.</a> Mol Cell Biol. 5 (7), 1750-1759 (1985).</li>
<li>Dalton, A. C., Barton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-expression+of+secreted+proteins+from+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines.</a> Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).</li>
<li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+gene+expression+in+HEK293+cells%3A+peptone+addition+posttransfection+improves+recombinant+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol Bioeng. 90 (3), 332-344 (2005).</li>
<li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+transient+transfection+of+serum-free+suspension-growing+HEK293+EBNA1+cells%3A+peptone+additives+improve+cell+growth+and+transfection+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Large-scale transient transfection of serum-free suspension-growing HEK293 EBNA1 cells: peptone additives improve cell growth and transfection efficiency.</a> Biotechnol Bioeng. 84 (3), 332-342 (2003).</li>
<li>Yang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+valproic+acid+to+CHO+cell+fed-batch+cultures+improves+monoclonal+antibody+titers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Addition of valproic acid to CHO cell fed-batch cultures improves monoclonal antibody titers.</a> Molecular Biotechnology. 56 (5), 421-428 (2014).</li>
<li>Backliwal, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valproic+acid%3A+a+viable+alternative+to+sodium+butyrate+for+enhancing+protein+expression+in+mammalian+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Valproic acid: a viable alternative to sodium butyrate for enhancing protein expression in mammalian cell cultures.</a> Biotechnol Bioeng. 101 (1), 182-189 (2008).</li>
<li>Jiang, Z., Sharfstein, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+butyrate+stimulates+monoclonal+antibody+over-expression+in+CHO+cells+by+improving+gene+accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility.</a> Biotechnol Bioeng. 100 (1), 189-194 (2008).</li>
<li>Jordan, M., Wurm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+adherent+and+suspended+cells+by+calcium+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate.</a> Methods. 33 (2), 136-143 (2004).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dit protocol geeft de transfectie stabiele expressie en zuivering van een therapeutisch antilichaam in HEK-293-cellen. Stabiele expressie van antilichaam genen is de eerste stap in het genereren van een antilichaam producerende cellijn voor de ontwikkeling en productie van een therapeutisch antilichaam. Terwijl de Chinese hamster ovarium (CHO) cellen blijven de expressie platform voor therapeutische eiwitten, is de HEK-293 cellijn verkrijgen van bekendheid met het besef dat eiwitten die in deze cellen beter overeenkomen...

Het succes van therapeutische antilichamen nog aanzienlijke investeringen rijden in de ontwikkeling van antilichamen als een golf van de volgende generatie therapeutica begint. Het antilichaam markt zal worden hervormd door 1 antilichaamfragmenten, antilichaam-geneesmiddelconjugaten 2 bispecifieke antilichamen 3 en gemanipuleerde antilichamen met gunstige eigenschappen 4. Een andere klasse wint farmaceutische belang biosimilars. Biosimilar antilichamen zijn &#39;zeer vergelijkbaar&#39; repliceren producten van een therapeutisch antilichaam dat al wettelijke goedkeuring heeft ontvangen. Een voorgestelde biosimilar moet vergelijkbaar zijn met de originator antilichaam met betrekking tot de structuur, functie, dierlijke toxiciteit klinische veiligheid en effectiviteit humane farmacokinetiek (PK), farmacodynamische (PD) en immunogeniciteit 5, 6 zijn. De goedkeuring rAtes van biosimilar antilichamen zijn traag als gevolg van de strenge beperkingen op de uiteindelijke kwaliteit van het product. De precieze fabricageprocessen zoals specifieke cellijnen en kweekcondities tot de eindverwerking stappen bedrijfseigen zijn. Bovendien, de productie van antilichamen omvat inherent een zekere variabiliteit die aan de uitdaging van het produceren van een zeer soortgelijk product. Een uitgebreide fysiochemische en biofysische analyse en vergelijking is heel moeilijk, maar een aantal onderzoeken die de kenmerken van biosimilar antilichamen ontstaan in de literatuur 7, 8, 9. Genereren van een therapeutisch antilichaam begint bij transfectie van zoogdierlijke gastheercellen met een vector die de genen voor de respectievelijke antilichaam. Vector ontwerp, cellijn en de kweekomstandigheden zijn belangrijke overwegingen voor het opzetten van de expression systeem. De DNA-sequenties van antilichamen kunnen afkomstig zijn van Drug Bank (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) of onderzoekspublicaties met inbegrip van octrooien. Bijvoorbeeld, de volgorde van trastuzumab is beschikbaar via Drug Bank (DB ID: DB00072). De aminozuursequentie van de variabele gebieden genen kunnen ontwerpen en optimaliseren ondergaan synthese in de gewenste gastheer species. Het is belangrijk voor een biosimilaire antilichaam dat geen wijziging is aangebracht in de aminozuursequentie. Eenmaal gesynthetiseerd kunnen antilichaam genen worden gekloneerd in de geschikte vector van keuze. Humane IgG antilichamen bestaan ​​uit twee identieke zware ketens en twee identieke lichte ketens. Strak gereguleerde expressie van beide ketens essentieel voor de optimale productie van heteroloog IgG eiwit in zoogdiercellen 10. Intra- en inter-keten disulfidebindingen te worden gevormd en een aantal post-translationele modificaties moeten introduced tijdens eiwit biosynthese. Een aantal vectoren zijn beschikbaar die speciaal ontworpen zijn om uit te drukken antilichaam genen (zie tabel of Materials). Deze antilichaam-specifieke expressie vectoren gewoonlijk de constante gebieden van zowel zware als lichte ketens zodat alleen de variabele gebieden van elke keten klonen vereisen. Transfectie van cellen met twee onafhankelijke constructen (co-transfectie) is de meest gebruikte aanpak voor het leveren zware en lichte keten coderende genen. Dat wil zeggen dat elk gen aangedreven door zijn eigen promotor en getranscribeerd als afzonderlijke antilichaamketens alvorens te worden geassembleerd in het endoplasmatisch reticulum. Anderzijds, multi-cistronische vectoren interne ribosoom binnenkomstplaats (IRES) elementen opgenomen die expressie van meerdere genen als een enkel mRNA transcript met translatie toegelaten van inwendige gebieden van het mRNA 11 mogelijk. In dit geval worden de zware en lichte keten coderende genen gekoppeld per arrangement co-expressie van beide antilichaamketens 10, 12 bereiken. Terwijl tijdelijk getransfecteerde cellen leveren voldoende eiwit om een ​​beperkt aantal experimenten, kan stabiel getransfecteerde cellijnen die selectie hebben ondergaan genoom integratie hogere opbrengsten leveren. Hogere eiwit hoeveelheden zorgen voor testontwikkeling met betrekking tot in vitro karakterisering en kan een indicatie van de kwaliteit antilichaam in aanmerking voor downstream-toepassingen zoals klonale cellijn en lead kandidaat selectie. Het doel van dit artikel is om de stabiele expressie en zuivering van een therapeutisch antilichaam geproduceerd in een zoogdier expressiesysteem beschreven. Inderdaad, kan deze methode worden toegepast om de expressie van een biosimilar antilichaam. De werkwijze kan worden gebruikt voor de initiële karakterisering van antilichamen alvorens naar de kritische, zij tijdrovend steps voor het identificeren van een gewenste kloon voor grootschaliger productie. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om andere eiwitten en niet alleen antilichamen tot expressie. De volgende gedetailleerde protocol beschrijft de expressie van therapeutische antilichaam trastuzumab. Deze bestaat uit de bereiding van vector DNA gevolgd door stabiele transfectie in HEK-293 cellijn en zuivering van antilichaam eiwit door een geautomatiseerde chromatografische methode.

<table><tbody><tr><td>pFUSE vector series</td><td>InvivoGen</td><td>N/A</td><td>Zware en lichte antilichaam genen die in afzonderlijke vectoren worden uitgedrukt en dus co-transfectie vereisen.</td></tr><tr><td>mAbXpress vector series</td><td>ACYTE Biotech Pty Ltd.</td><td></td><td>Zware en lichte antilichaam genen die in afzonderlijke vectoren worden uitgedrukt en dus co-transfectie vereisen. Zie: Jones, M. L. et al. Een methode voor snel, ligatie-onafhankelijk herformatting van recombinante monoklonale antilichamen. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).</td></tr><tr><td>pVITRO1 vector</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Zware en lichte antilichaam genen worden elk aangedreven door een afzonderlijk promotor in een enkele vector.  Zie: Dodev, T. S. et al. Een toolkit voor snelle klonen en expressie van recombinante antilichamen. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).</td></tr><tr><td>GS vector series</td><td>Lonza</td><td></td><td>Multi-cistronische vector met zwaar en licht antilichaam genen die gezamenlijk worden uitgedrukt en vertaald als een enkele transcript.</td></tr><tr><td>Multi-cistronic vector series 1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Multi-cistronische vector met zwaar en licht antilichaam genen die gezamenlijk worden uitgedrukt en vertaald als een enkele transcript. Zie: Li, J. et al. Een vergelijkende studie van verschillende vector ontwerpen voor de zoogdier expressie van recombinant IgG antilichamen. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).</td></tr><tr><td>Multi-cistronic vector series 2</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Multi-cistronische vector met zwaar en licht antilichaam genen die gezamenlijk worden uitgedrukt en vertaald als een enkele transcript. Zie: Ho, S. C. et al. IRES-gemedieerde Tricistronic vectoren voor het verbeteren van de generatie van hoge monoklonale antilichamen expressie CHO cel lijnen. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).</td></tr><tr><td>pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&%kappa;</td><td>Addgene</td><td>61883</td><td>Zoogdier expressie vector bevattend trastuzumab antilichaam genen met hygromycin weerstandsgen; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&%kappa; was een geschenk van Andrew Beavil.</td></tr><tr><td>Fast-Media Hygro Agar</td><td>Jomar Life Research</td><td>fas-hg-s</td><td>Wordt gebruikt om lage zout LB agar te bereiden met 75 µg/ml hygromycin.</td></tr><tr><td>Fast-Media Hygro TB</td><td>Jomar Life Research</td><td>fas-hg-l</td><td>Wordt gebruikt om lage zout TB bouillon te bereiden met 75 µg/ml hygromycin. </td></tr><tr><td>Glycerol, BioXtra, &ge;99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td>Bereid tot 80% met water en autoclaveer. Bewaar bij kamertemperatuur.</td></tr><tr><td>Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit</td><td>Astral Scientific</td><td>G221020</td><td>Plasmid Maxi Prep Kit; elueer of hervat DNA in water (pH 7,0-8,5).</td></tr><tr><td>FreeStyle 293-F Cells</td><td>Life Technologies</td><td>R790-07</td><td>HEK-293 cel lijn aangepast voor suspensie cultuur in serum-vrij media.</td></tr><tr><td>FreeStyle 293 Expression Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td>Serum-vrij media speciaal geformuleerd voor het onderhouden van de 293-F cel lijn en hoge eiwitexpressie.</td></tr><tr><td>Kolliphor P188</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4894</td><td>Niet-ionogene oppervlakteactieve stof; pluronic F-68; bereid tot 10% in water en filter-steriliseer met behulp van 0,22 μm filter. Bewaar bij 4 °C.</td></tr><tr><td>DMEM, hoge glucose </td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine, Lineair, MW 25,000 </td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966</td><td>Bereid tot 1 mg/ml in water. Pas aan naar pH 7,0 met 1 M HCl (oplossing wordt helder) en filter-steriliseer met behulp van 0,22 μm filter. Bewaar bij -80 °C tot gebruik.</td></tr><tr><td>OptiPro SFM</td><td>Life Technologies</td><td>12309-050</td><td>Transfectie geformuleerd serum-vrij media</td></tr><tr><td>Hygromycin B Solution</td><td>Jomar Life Research</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulphoxide (DMSO)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AJA2225</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone (caseïne pepton)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0042B</td><td>Bereid tot 20% in PBS en filter-steriliseer met behulp van 0,22 μm filter. Bewaar bij 4 °C. </td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7,4, 100 ml</td><td>Astral Scientific</td><td>09-2051-100</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml kolom</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0403-01</td><td></td></tr><tr><td>AKTApurifier 100</td><td>GE Healthcare</td><td>28406266</td><td>Geautomatiseerd FPLC systeem, dat kan bestaan uit een P-960 sample pomp en Frac-920 fractie verzamelaar.</td></tr><tr><td>Glycine-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2879</td><td></td></tr><tr><td>Citric Acid, monohydraat</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOC2123</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Citrate, trinatrium zout dihydraat </td><td>Astral Scientific</td><td>BIOCB0035</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl oplossing pH 9,0</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOSD8146</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO)</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC803008/UFC903008</td><td>Wordt gebruikt voor buffer uitwisseling en concentratie van gezuiverd eiwit.</td></tr><tr><td>Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>BLItz System</td><td>fortéBIO</td><td>45-5000</td><td>Instrument gebruikt voor bio-layer interferentie (BLI) metingen.</td></tr>

laboratoriumschaal productie en zuivering van een therapeutisch antilichaam

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Het waarborgen van de succesvolle productie van een therapeutisch antilichaam begint al vroeg in het ontwikkelingsproces. De eerste fase is vectorexpressie van de antilichaamgenen gevolgd door stabiele transfectie in een geschikte cellijn. De stabiele klonen worden onderworpen aan screening om de klonen met gewenste productie- en groeikerken te selecteren. Dit is een kritische, zij het tijdrovende, stap in het proces. Dit protocol beschouwt vectorselectie en het verkrijgen van antilichaambreuken voor de expressie van een therapeutisch antilichaam. De methoden beschrijven de voorbereiding van vector-DNA voor stabiele transfectie van een suspensievariant van menselijke embryonale nier 293 (HEK-293) cellijn, met behulp van polyethyleenimieen (PEI). De cellen worden getransfecteerd als aderente cellen in serum-bevattende media om de transfectie-efficiëntie te maximaliseren, en worden daarna aangepast aan serumvrije omstandigheden. Grootschalige productie, ingesteld als batch-overgroei-culturen, wordt gebruikt om antilichaam-eiwit te produceren dat wordt gezuiverd door middel van affiniteitschromatografie met behulp van een geautomatiseerd fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. De antilichaammogelijkheden geproduceerd door deze methode kunnen voldoende eiwit leveren om de initiële karakterisering van het antilichaam te beginnen. Dit kan in vitro assayontwikkeling of fysisch-chemische karakterisering omvatten ter ondersteuning van de tijdrovende taak van klonaal screenen voor lead-kandidaten. Deze methode kan worden overgedragen naar de ontwikkeling van een expressiesysteem voor de productie van biosimilar-antilichamen.

Stabiele productie van trastuzumab in getransfecteerde HEK-293-cellen werd bevestigd met behulp biolaag interferometrie (BLI) zoals aangegeven in figuur 1. Een IgG standaardkromme werd gegenereerd door het meten van de binding snelheid tussen een IgG-antilichaam en Proteïne A standaard biosensor (Figuur 1A). Het ruwe supernatant monster werd op soortgelijke wijze gemeten, dan is de concentratie geïnterpoleerd uit de standaard curve (Figuur 1B).</...

Dit protocol beschrijft de productie van een therapeutisch antilichaam in een zoogdier expressiesysteem. De beschreven werkwijzen omvatten bereiding van vector-DNA, transfectie en stabiele serumvrije adaptatie van humane embryonische nier 293 cellijn opgezet van grootschalige kweken en zuiveren met behulp van affiniteitschromatografie.

Laboratoriumschaal Productie en zuivering van een therapeutisch antilichaam

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Het algemene doel van deze methode is het ontwikkelen van een serumvrij expressiesysteem met een hoge opbrengst voor de productie op laboratoriumschaal van een therapeutisch antilichaam. Deze methode kan ingaan op belangrijke overwegingen bij het ontwerp van een antilichaam-expressiesysteem, zoals het produceren van een stabiele cellijn, de toevoeging van supplementen en het optimaliseren van zuiveringsstrategieën. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het produceren van een stabiele cellijn die is aangepast aan serumvrije media zal leiden tot robuuste en reproduceerbare hoeveelheden therapeutisch antilichaam.Begin met het kweken van HEK-293-cellen volgens standaardprotocollen in serumvrij medium aangevuld met 0,1% niet-ionisch surfactant, in Erlenmeyer-kolven. Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2 bij 120 rpm. Houd de kweek op 2 × 10⁵ cellen per ml en subcultiveer elke vierde dag.Zaai de dag vóór de transfectie HEK-293-cellen uit in de putjes van een 12-wells plaat met een dichtheid van drie keer 10⁵ cellen per milliliter in twee milliliter DMEM met 10% hitte-inactieve FBS. Controleer op de dag van de transfectie of de cellen een confluentie van 80 tot 90% hebben be

laboratory-scale-production-and-purification-of-a-therapeutic-antibody

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Een high-throughput, geautomatiseerd platform van de productie cellijn ontwikkeling voor de productie van therapeutische eiwitten is beschreven. Uitvoering van de BD FACS Aria Cell Sorter, heeft CloneSelect Imager en Tecan Freedom EVO liquid handling systeem gedemonstreerd aanzienlijk toegenomen verwerkingscapaciteit in cellijn ontwikkeling met verbeterde cellijn kwaliteit en een hoge reproduceerbaarheid.

Een High-throughput geautomatiseerd platform voor de ontwikkeling van Manufacturing Cell Protein Therapeutics Lines voor

This video demonstrates a technique to study the in vivo localization of tumor-specific antibodies in a mouse tumor xenograft model. Upon subcutaneously injecting cancer cells into mice for tumor formation, fluorescently-labeled antibodies are injected that bind to tumor-specific receptors, enabling in vivo assessment of antibody localization via imaging.

A Technique to Assess the In Vivo Localization of Tumor-Specific Antibodies

The video explains the process of producing antibodies in mammalian host cells, from gene expression to secretion. It involves transcription, translation, signal recognition, correct folding, and eventual release into the extracellular medium via secretory vesicles.

Production and Purification of Recombinant Antibodies from Mammalian Cells

This video demonstrates an assay for purifying monoclonal antibodies from cell culture fluid harvested from Chinese Hamster Ovarian cells. It employs a porous glass resin with immobilized protein A, which binds to the Fc region of the antibodies in the sample, effectively separating them from contaminants. The use of a low-pH elution buffer weakens the interaction, facilitating the retrieval of purified antibodies.

A Technique to Purify Monoclonal Antibodies Produced by Chinese Hamster Ovary Cells

The video demonstrates a method for producing therapeutic antibodies using stably transfected mammalian cells. Tryptone supplementation stimulates cell division, resulting in overgrowth and supporting a higher antibody yield. The antibody-containing medium is harvested, filtered, and stored for further use.

Antibody Production from a Batch Overgrowth Culture of Transfected Mammalian Cells

This video demonstrates a technique for purifying monoclonal antibodies from the culture supernatant obtained from an antibody-producing cell culture. The process involves using a matrix of crosslinked agarose beads with conjugated Protein A, which immobilizes the antibodies in the supernatant on the beads, allowing for effective separation from contaminants. By applying an elution buffer with low pH, the protein A-antibody interaction is loosened, facilitating the collection of...

An Affinity Chromatography Technique for the Purification of Monoclonal Antibodies

This video demonstrates a method to detect the Cyanobacterial strains in an environmental sample using an antibody microarray chip. Samples carrying various bacteria interact with printed antibodies, and immunostaining with fluorophore-labeled anti-cyanobacterial-strain antibodies reveals the presence of specific cyanobacterial strains through fluorescence in distinct spots.

A Technique to Detect Cyanobacterial Strains Using an Antibody Microarray Chip

De aanwezigheid van cyanobacteriëntoxines in zoetwaterreservoirs voor menselijke consumptie is een grote zorg voor waterbeheerautoriteiten. Om het risico van waterverontreiniging te evalueren, beschrijft dit artikel een protocol voor de detectie op locatie van cyanobacteriënstammen in vloeibare en vaste monsters door gebruik te maken van een antilichaam-microarray-chip.

Experimenteel protocol voor het opsporen Cyanobacteriën In vloeibare en vaste monsters met een antilichaam Microarray Chip

Een gedetailleerd protocol voor de zuivering en daaropvolgende analyse van een monoklonaal antilichaam uit geoogste celkweek vloeistof (HCCF) van geautomatiseerde microbioreactoren is beschreven. Het gebruik van analyses om kritische kwaliteitskenmerken (CQAs) te bepalen en beperkt sample volume te maximaliseren om vitale informatie te extraheren wordt ook gepresenteerd.

Zuivering en analyse van een monoklonaal antilichaam van Chinese Hamster Ovariumcellen met behulp van een geautomatiseerd Microbioreactor systeem

Hier presenteren we een protocol om de in vivo lokalisatie van antilichamen in muizen tumor xenograft modellen te bestuderen.

Analyse van tumor- en weefselverdeling van doelantigeen-specifiek therapeutisch antilichaam

Leer hoe u een serumvrij expressiesysteem opzet voor de productie van therapeutische antilichamen met HEK-293-cellen. Deze methode omvat stabiele transfectie, adaptatie en zuivering via affiniteitschromatografie.

Laboratoriumschaal Productie en zuivering van een therapeutisch antilichaam

Meer video's verkennen