Name: Synthèse de 1,2-Azaborines et la préparation de leurs complexes protéiques avec T4 lysozyme Mutants (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Découvrez la synthèse des 1,2-azaborines et la préparation de leurs complexes protéiques avec des mutants de lysozyme T4. Cette méthode fiable permet d'explorer leurs applications biomédicales futures.

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Cette recherche a été soutenue par le National Institutes of Health NIGMS (R01-GM094541) et le Boston College.

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</ol>

Tous les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent dans ce manuscrit.

Dans la première partie de ce protocole, nous avons décrit une synthèse modifiée de 1,2-azaborines basés sur des méthodes précédemment rapportées 12, 13. Triallylborane 22 a été utilisé comme un substitut pour les routes à l&#39; aide de allyltriphenyl étain ou potassium allyltrifluoroborate pour préparer N -allyl- N -TBS- B chlorure de produit d&#39; addition (1). Cette méthode permet une appro...

Le bore-azote contenant des hétérocycles (ie 1,2-azaborines) ont récemment attiré l&#39; attention significative en tant isostères de arenes. Cette isosterism peut conduire à la diversification des motifs structurels existants pour élargir l&#39;espace chimique 2, 3, 4. Azaborines ont une utilité potentielle pour les applications en recherche biomédicale , 5, 6, 7, 8, en particulier dans le domaine de la chimie médicinale dans laquelle les chimistes effectuent la synthèse de banques de molécules structuralement et fonctionnellement pertinents. De manière significative, cependant, alors qu&#39;il existe de nombreuses voies de synthèse bien développés à des molécules disponibles contenant arene, seul un nombre limité de méthodes pour la synthèse de azaborines ont été rapportés 9, 10, </sup&gt; 11, 12, 13. Ceci est principalement dû à un nombre limité d&#39;options pour la source de bore et de l&#39;air et de la nature sensible à l&#39;humidité de la molécule dans le stade précoce de la séquence synthétique. Dans la première partie de cet article, nous allons décrire une synthèse à l&#39;échelle multi-gramme de N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3) en utilisant des techniques de libre-air standard. Ce composé sert comme intermédiaire polyvalent qui peut encore être fonctionnalisé pour structurellement plus complexes molécules 14, 15. A partir de 3, dont la synthèse et la purification du N -H- B -éthyl-1,2-azaborine (5) destiné à être utilisé dans des études de liaison de protéine seront décrits. En raison de la volatilité de 5, son isolement efficace nécessite un contrôle précis de la température de réaction, le temps, et distillation conditions. Dans la deuxième partie, les protocoles pour l&#39; expression de la protéine et l&#39; isolement des mutants T4 lysozyme (L99A et L99A / M102Q) 17, 18, 19, 20 seront présentés, suivie d&#39; une cristallisation de la protéine et la préparation de complexes cristallins protéine-ligand. Les mutants T4 lysozyme L99A et L99A / M102Q ont été choisis en tant que systèmes modèles biologiques pour examiner la capacité de liaison hydrogène de NH contenant des molécules azaborine 17. En utilisant un protocole de biologie moléculaire standard, la protéine est exprimée dans la souche Escherichia coli RR1 et induite par l&#39; isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside 1 (IPTG). La purification des protéines est réalisée en utilisant une Chromatographie sur colonne échangeuse d&#39;ions. La cristallisation des protéines est effectuée avec une solution fortement concentrée et purifiée de protéine (&gt; 95% de pureté par électrophorèse sur gel) en utilisant la tenturedéposer méthode de diffusion de la vapeur. En raison de la sensibilité des ligands de la présente étude à l&#39;oxygène, les complexes protéine-ligand sont préparés dans des conditions exemptes d&#39;air.

<table><tbody><tr><td>Tétrahydrofurane (THF), sans inhibiteur, pour HPLC, &ge ; 99,9 %</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34865</td><td></td></tr><tr><td>Éther diéthylique (Et2O), pour HPLC, &ge ; 99,9 %, sans inhibiteur</td>, <td>Sigma Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>chlorure de méthylène&nbsp ; (CH2Cl2), (stabilisé/certifié ACS)</td><td>Fisher</td><td>D37-20</td><td></td></tr>, <tr><td>toluène</td><td>Fisher</td><td>T290-4</td><td></td></tr><tr><td>pentane, HPLC</td><td>Fisher</td><td>P399-4</td><td></td>,</tr><tr><td>acétonitrile</td><td>Fisher</td><td>A21-4</td><td></td></tr>, <tr><td>hydrure de calcium (CaH2), qualité réactif, 95 %</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208027</td><td></td></tr><tr><td>Palladium pyrophorique sur charbon actif (/C), 10 % en poids</td><td>Strem</td><td>46-1900</td><td></td></tr><tr><td>1,0 M Solution de trichlorure de bore dans</td><td>de l’hexane Sigma Aldrich</td><td>211249</td> Triéthylamine <td>hautement toxique/pyrophorique</td></tr><tr><td>, &ge ; 99,5 %</td><td>Sigma Aldrich</td><td>471283</td><td></td></tr><tr><td>Grubbs 1st génération</td> catalyseur<td>materia</td><td>C823</td><td></td></tr><tr><td>Acétamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0500</td><td></td></tr><tr><td>n-Butanol, anhydre, 99,8</td> % <td>Sigma Aldrich</td><td>281549</td><td></td></tr><tr><td>solution d’éthyllithium , 0,5&nbsp ; M dans benzène/cyclohexane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>561452</td> Solution de HCl <td>hautement toxique / pyrophorique</td></tr><tr><td>, 2,0 M dans Et2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>455180</td><td></td></tr><tr><td>2-Méthylbutane, anhydre, &ge ; 99 %</td><td>Sigma Aldrich</td><td>277258</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli, (Migula) Castellani et Chalmers (ATCC&reg ; 31343&trade ;)</td><td>ATCC</td><td>31343</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme T4 WT* (L99A)</td><td>Addgene</td><td>18476</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme mutant T4 (S38D L99A M102Q N144D)</td><td>Addgene</td><td>18477</td><td></td></tr><tr><td>Sel sodique d’ampicilline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>isopropyl-&beta ;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>AM9464</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique anhydre</td><td>Fisher</td><td>BP329</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique anhydre</td><td>Fisher</td><td>BP332</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher</td><td>S642212&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique</td><td>Fisher</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4880</td><td>Corrosif</td></tr><tr><td>Thermo scientific perce, DNaseI</td><td>Fisher</td><td>PI-90083</td><td></td></tr><tr><td>GE Healthcare&nbsp ; Média d’échange cationique à débit rapide Sepharose</td><td>Fisher</td><td>45-002-931</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher</td><td>BP152-500&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>TCI</td><td>S0489</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol</td> hautement toxique <td>Fisher</td><td>ICN806443&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Sartorius&nbsp ; Concentrateurs centrifuges Vivaspin 20</td><td>Fisher</td><td>14-558-501</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>2-Hydroxyethyl disulfure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>380474</td><td></td></tr><tr><td>N-paratone&nbsp ;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-643</td><td></td></tr><tr><td>4 Tube à membrane de dialyse RC 12 000 à 14 000 Dalton MWCO&nbsp ;</td><td>Fisher</td><td>08-667F</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Des</td> tubes cryogéniques CryoLoop <td>Hampton Research</td><td></td><td>façonnés en boucle</td></tr><tr><td>CryoTong</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>cryogénique</td></tr> pince <tr><td>Coot Des</td><td></td><td></td><td>images de densité électronique sont générées à partir du logiciel</td></tr></tbody></table>

synthèse de 1,2-azaborines et la préparation de leurs complexes protéiques avec t4 lysozyme mutants

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

Nous décrivons une synthèse générale de 1,2-azaborines à l’aide de techniques standard sans air et d’une préparation de complexes protéiques avec des mutants de lysozyme T4 par diffusion de vapeur. Les composés sensibles à l’oxygène et à l’humidité sont préparés et isolés sous atmosphère inerte (N2) à l’aide d’un collecteur de gaz sous vide ou d’une boîte à gants. À titre d’exemple de synthèse de l’azaborine, nous démontrons la synthèse et la purification de la N-H-B-éthyl-1,2-azaborine volatile par une séquence en cinq étapes impliquant la distillation et la chromatographie sur colonne pour l’isolement des produits. Les mutants T4 du lysozyme L99A et L99A/M102Q sont exprimés avec la souche RR1 d’Escherichia coli. Les protocoles standard de lyse chimique cellulaire suivie d’une purification à l’aide d’une colonne d’échange d’ions carboxyméthyle permettent d’obtenir des protéines d’une pureté suffisamment élevée pour la cristallisation. La cristallisation des protéines est réalisée à différentes concentrations de précipitant à différentes plages de pH en utilisant la méthode de diffusion de vapeur de goutte suspendue. La préparation complexe avec les petites molécules est réalisée par la méthode de diffusion de vapeur sous atmosphère inerte. L’analyse par diffraction des rayons X du complexe cristallin fournit des preuves structurelles sans ambiguïté des interactions de liaison entre le site de liaison des protéines et les 1,2-azaborines.

La voie de synthèse schématique pour le 1,2-azaborines est représenté sur la figure 1. Ce protocole applicable à la synthèse de cinq molécules du bore contenant de l&#39;azote différentes. La figure 2 représente les spectres 11 RMN B mesuré au cours de l&#39; étape 1.3 pour suivre la formation du produit désiré (3). La purification des protéines a été réalisée en utilisant un système de Chromatographie à basse pression et un c...

Un protocole pour la synthèse des 1,2-azaborines et la préparation de leurs complexes protéiques avec des mutants de lysozyme T4 est présenté.

Synthèse de 1,2-Azaborines et la préparation de leurs complexes protéiques avec T4 lysozyme Mutants

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

L'objectif général de ce protocole est de décrire une méthode générale de synthèse des 1,2-azaborines, ainsi que ses applications potentielles en recherche biomédicale. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à assurer une synthèse fiable de composés 1,2-azaborines, qui constituent des isostères contenant du bore du motif omniprésent du benzène. Le précurseur décrit peut être ultérieurement fonctionnalisé pour donner des molécules potentiellement plus complexes.La préparation de complexes protéiques avec la 1,2-azaborine fournira des informations sur les futures applications en recherche biomédicale. Pour commencer cette procédure, préparez le produit cyclisé comme indiqué dans le protocole écrit. Ajoutez 14 grammes de palladium sur carbone à ce produit préparé dans le toluène.Ensuite, retirez le ballon de la boîte. Équipez le ballon d'un réfrigérant de reflux 24/40 séché au four et purgé à l'azote, raccordé à de l'eau refroidie. Placez le ballon dans un bain d'huile et chauffez la réaction à un reflux vigoureux à 135 degrés Celsius sous agitation. Faire réagir sous reflux pendant 16 heures. Ensuite, retirer le ballon du bain d'huile pour laisser refroidir la réaction à température ambiante. Une fois refroidi, remplacer le condenseur à reflux par un septum sur le ballon de réaction.À l’aide d’une seringue équipée d’une aiguille Luer Lock séchée au four, prélevez un aliquot de 5 millilitres. Transférez l’aliquot dans un tube RMN à vis. Analysez l’échantillon par RMN du bore-11.Si la réaction est incomplète, transférez le ballon de réaction dans une boîte à gants. Ensuite, ajoutez trois grammes supplémentaires de palladium sur carbone. Puis, retirez le ballon de la boîte à gants.Équiper le ballon d’un réfrigérant de type 24/40 purgé à l’azote et raccordé à de l’eau refroidie. À l’aide d’un bain d’huile, chauffer la réaction à reflux vigoureux à 135 degrés Celsius sous agitation pendant 24 heures. À l’aide de la RMN du bore-11, analyser un autre aliquot afin de s’assurer que la réaction est terminée.Après cela, transférez le ballon réactionnel dans la boîte à gants. Passez le mélange réactionnel à travers une colonne de chromatographie flash remplie de lingettes en papier. Ensuite, recueillez le filtrat dans un ballon rond d’un litre muni d’un barreau aimanté.Lavez la colonne avec 50 millilitres de toluène. Retirez le récipient du filtrat de la boîte à gants et reliez-le à une rampe sous vide équipée d'une ligne d'azote. Placez un bain d'eau sous le ballon et un dewar contenant de l'azote liquide pour piéger le solvant.Ouvrir la vanne à vide élevé pour commencer l'élimination de tous les composés volatils du filtrat. Ensuite, réintroduire le mélange réactionnel dans la boîte à gants. Transférer le mélange dans un ballon rond de 250 millilitres, de col 24/40, préalablement séché à l'étuve et muni d'un barreau aimanté.Rincez le mélange réactionnel résiduel avec du dichlorométhane, puis transférez-le dans l’erlenmeyer. Bouchonnez l’erlenmeyer avec un septum. Transférez l’erlenmeyer de la boîte à gants vers le collecteur sous vide, puis raccordez-le.Ouvrir la vanne à vide élevé pour éliminer le solvant résiduel. Ensuite, retirer rapidement le septum et ajouter de l'hydrure de calcium à l'aide d'une spatule. Relier le ballon à fond rond à l'appareil de distillation décrit dans le protocole du texte et régler la température du bain d'huile à 100 degrés Celsius.Une fois la distillation terminée, retirez la source de chaleur et laissez refroidir l'appareil à température ambiante. Rétablissez la pression dans l'appareil refroidi à l'aide d'azote, puis fermez hermétiquement le robinet à tournant sur le flacon de stockage sans contact avec l'air. Après avoir transféré le produit isolé du flacon dans un vial sous boîte à gants, conservez le vial dans le congélateur de la boîte à gants.Après avoir purifié la protéine, transférez la solution purifiée dans un tube de dialyse. Placez le tube de dialyse dans un récipient contenant quatre litres d'une solution de 100 millimolaire de phosphate de sodium, 550 millimolaire de chlorure de sodium et 0,2 % d'azoture de sodium. Agitez toute la nuit à quatre degrés Celsius.Le lendemain, ajouter du 2-mercaptoéthanol à l'échantillon dialysé de manière à obtenir une concentration finale de cinq millimolaire. Ensuite, utiliser un concentrateur centrifuge pour concentrer la solution à 40 milligrammes par millilitre. Faire tourner l'échantillon à 5 000 tr/min et à six degrés Celsius, puis éliminer tout précipité après la concentration.Ensuite, dans une plaque 24 puits, préparez diverses conditions avec la solution réservoir, comme indiqué dans le protocole écrit. Utilisez de la graisse pour assurer un scellement étanche en l'appliquant sur le bord de chaque puits. Mélangez cinq microlitres de la solution protéique concentrée avec cinq microlitres de la solution réservoir sur une lame de couverture en verre silanisée.Placer la lame couvre-objet à l’envers au-dessus des puits contenant la solution réservoir. Conserver la plaque à 4 degrés Celsius pour la croissance des cristaux. À l’aide d’une boucle en tube cryogénique, prélever les cristaux formés et les placer dans un tube microcentrifuge de 6 millilitres.Ajouter 50 microlitres de liqueur mère. Ensuite, transférer le tube dans une boîte à gants. Transférer cinq microlitres du ligand azaborine préparé à l'intérieur du bouchon du tube.Fermez le tube et stockez-le au réfrigérateur à l'intérieur de la boîte à gants pendant deux à sept jours pour équilibrer par diffusion de vapeur. Ensuite, déposez une goutte de N Paratone sur une lame de verre. À l'aide d'une micropipette, transférez un cristal sur la lame.Ensuite, utilisez une boucle de tube cryogénique pour prélever le cristal et le transférer de la solution aqueuse dans l'huile N Paratone. Plongez le cristal protégé par l'huile N Paratone dans un récipient Dewar contenant de l'azote liquide. À l'aide de pinces cryogéniques, fixez le cristal rapidement congelé sur la boucle.Ensuite, analyser les données cristallines recueillies comme décrit dans le protocole écrit. Dans cette étude, une synthèse modifiée des 1,2-azaborines est présentée, basée sur des méthodes précédemment rapportées. Le tri-allèle borine est utilisé pour préparer l'adduit chlorure N-allèle NTBSB-allèle.Une séquence en deux étapes avec une seule étape de formation de population est utilisée pour la synthèse du NTBS BCl 1,2-azaborine, ce qui conduit à un rendement isolé plus élevé que les méthodes antérieures. La synthèse du 1,2-azaborine N-H-B-éthyle est réalisée en deux étapes, en utilisant l’éthyllithium à la place du complexe au chrome employé dans les méthodes précédemment décrites. La purification de la protéine est effectuée à l’aide d’un système de chromatographie à basse pression.Un chromatogramme réalisé à 280 nanomètres montre un pic correspondant au mutant de la lysozyme T4, L99am102q. La protéine est ensuite cristallisée et mise en complexe avec des ligands. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que la synthèse des azaborines nécessite des conditions sans air, telles qu'une boîte à gants et un système sous vide-pression de gaz, afin d'éviter la décomposition des composés.Après son développement, cette technique a ouvert la voie à l'exploration des propriétés chimiques et physiques uniques des azaborines par rapport aux aromatiques carbonés dans les poches classiques de récupération biologique des zones affectées.

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Particules d'adénovirus sont conçus pour contenir soit le naturel azidohomoalanine analogue d'acide aminé ou le sucre...

Modification des surfaces chimiosélective virales via Click Chemistry Bioorthogonal

Un protocole pour la préparation diastéréosélective d'un pot de cis - N-Ts-iodoaziridines est décrite. La génération de diiodomethyllithium, plus de N-Ts aldimines et cyclisation de la gemme-diiodure intermédiaire de iodoaziridines aminé est démontrée. Il comprend également un protocole pour évaluer rapidement et quantitativement la phase stationnaire la plus appropriée pour une purification par chromatographie.

Synthèse et purification de Iodoaziridines implication quantitative de sélection de la phase stationnaire optimale pour chromatographie

Ici, nous présentons un protocole pour introduire des sondes chimiques spécifiques au site dans un fragment d’anticorps en incorporant génétiquement un acide aminé contenant de l’azoture, puis en couplant l’azoture avec une sonde chimique par cycloaddition azide-alcyne promue par souche (SPAAC).

Efficace et Antibody Étiquetage par Strain promu Azide-alcyne cycloaddition spécifique du site

Bicycliques aziridinium ions comme 1-azoniabicyclo [4.1.0] heptane tosylate proviennent de 2-[4-tolenesulfonyloxybutyl] aziridine, qui a été utilisé pour la préparation des Pipéridines substituées et azepanes via régio - et stéréospécifique expansion de cycle avec divers nucléophiles. Ce protocole très efficace nous a permis de préparer divers azaheterocycles incluant les produits naturels tels que fagomine, febrifugine analogique et balanol.

Préparation des Ions Aziridinium bicycliques Stable et leur ouverture pour la synthèse de Azaheterocycles

3-Aroyl-N-hydroxy-5-nitroindoles ont été synthétisés par cycloaddition de 4-nitronitrosobenzene avec un alkynone terminal conjugué dans une procédure thermique d'une étape. La préparation du nitrosoarene et des alkynones a été convenablement rapportée et respectivement par des procédures d'oxydation sur l'aniline correspondante et sur l'alkynol.

Une synthèse directe, regiosélective et atome-économiquede 3-Aroyl- N-hydroxy-5-nitroindoles par Cycloaddition de 4-Nitronitrosobenzene avec Alkynones

Dans cette étude, nous préparons les deux énantiomères de l’aziridine-2-carboxylate, qui sont utilisés dans la synthèse asymétrique d’alcaloïdes, y compris le biémamide B et D, et la (-)-épiallo-isomuscarine.

Préparation d’énoprures aziridines non activées et synthèse de biémamide B, D et d’épiallo-isomuscarine

Ce protocole décrit comment effectuer le marquage de protéines spécifiques au type cellulaire avec l’azidonorleucine (ANL) à l’aide d’une lignée de souris exprimant une synthétase d’ARNt L274G-méthionine mutante (MetRS*) et les étapes nécessaires pour isoler des protéines marquées spécifiques au type cellulaire. Nous décrivons deux voies d’administration possibles d’ANL chez des souris vivantes par (1) l’eau potable et (2) les injections intrapéritonéales.

Purification et identification de protéines spécifiques de type cellulaire à partir de tissus complexes à l’aide d’une lignée de souris mutante d’ARNt synthétase de méthionine

Des bisaziridines contiguës contenant des aziridines non activées et activées ont été synthétisées par aziridinations organocatalytiques asymétriques, puis soumises à des réactions chimiosélectives d’ouverture de cycle dans des conditions acides ou basiques. Le cycle aziridine non activé s’ouvre avec des nucléophiles moins réactifs dans des conditions acides, tandis que le cycle aziridine activé s’ouvre avec des nucléophiles plus réactifs dans des conditions de base.

Préparation de bisaziridines contiguës pour les réactions régiosélectives d’ouverture de cycle

Ce protocole décrit une méthode pour produire et évaluer l’activité antimicrobienne et la cytotoxicité du peptide cationique Mel4 et du mimétique du peptide RK758. En intégrant la synthèse chimique, l’expression recombinante et les tests fonctionnels standardisés, il offre un flux de travail simplifié pour la production et le test de peptides et de mimiques de petites molécules.

Production et test de peptides antimicrobiens et de leurs mimiques

Nous décrivons des procédures pour la préparation et l’administration de microcristaux de protéines membranaires en phase cubique lipidique pour la cristallographie en série à l’aide de lasers à rayons X à électrons libres et de sources synchrotron. Ces protocoles peuvent également être appliqués pour l’incorporation et l’administration de microcristaux de protéines solubles, ce qui permet de réduire considérablement la consommation d’échantillons par rapport à l’injection de liquide.

Préparation et livraison de microcristaux de protéines dans la phase lipidique cubique pour Serial femtoseconde Cristallographie

Découvrez la synthèse des 1,2-azaborines et la préparation de leurs complexes protéiques avec des mutants de lysozyme T4. Cette méthode fiable permet d'explorer leurs applications biomédicales futures.

Synthèse de 1,2-Azaborines et la préparation de leurs complexes protéiques avec T4 lysozyme Mutants

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