Mesure simultanée de mitochondrial Calcium et mitochondrial potentiel membranaire dans des cellules vivantes par microscopie à fluorescence

L’objectif global de cette procédure est de fournir une méthode simple pour mesurer simultanément l’absorption de calcium mitochondrial et le potentiel de membrane mitochondriale dans les cellules vivantes à l’aide de la microscopie confocale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine mitochondrial, telles que la façon dont les mitochondries agissent comme des réserves locales de calcium pour réguler étroitement la concentration intracellulaire de calcium. Le principal avantage de cette technique est que le calcium mitochondrial et le potentiel de la membrane mitochondriale peuvent être mesurés simultanément dans les cellules vivantes sans avoir besoin de manipulation génétique.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la régulation du calcium dans la pathologie des maladies mitochondriales, elle peut également être utilisée pour étudier d’autres conditions dégénératives plus récentes, lorsque la régulation du calcium d’urinoir est cruciale. Dans cette procédure, cultivez les cellules sur des boîtes de culture cellulaire de dix centimètres, ou des flacons de 75 centimètres carrés, dans des milieux de culture à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Pour récolter les cellules, prélevez le milieu par aspiration et lavez les cellules avec cinq millilitres de PBS.

Ensuite, retirez le PBS par aspiration. Ajoutez ensuite 1,5 millilitre de trypsine EDTA et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant 2 minutes. Ensuite, tapotez doucement le plat pour retirer les cellules.

Mettez-les en suspension dans cinq millilitres de milieu de culture. Ensuite, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. La veille de l’imagerie confocale, plaquez les cellules à 60 à 70 % de confluence dans des boîtes ou des lamelles de couverture chambrées.

Ensuite, incubez les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius pour permettre aux cellules de se fixer et de récupérer. Dans cette procédure, préparez la solution de coloration du disque avec du TMRM, du Fluo 4 AM et du tensioactif. Retirez le milieu de culture et lavez les cellules avec 100 microlitres de PBS.

Ensuite, retirez le PBS et incubez les cellules dans 100 microlitres de solution de coloration record pendant 45 minutes à température ambiante. Ensuite, retirez la solution de coloration record et lavez les cellules dans 100 microlitres de HBSS sans calcium pour éliminer l’excès de Fluo 4 AM et TMRM. Préparez ensuite la solution d’imagerie intracellulaire avec de la digitonine, du TMRM et de la thapsigargin.

Ensuite, retirez le HPSS sans calcium et ajoutez 300 microlitres de solution d’imagerie IM aux cellules. Laissez les cellules s’équilibrer à température ambiante pendant dix minutes avant d’obtenir une imagerie avec les ajouts de chlorure de calcium. Utilisez une faible puissance laser d’environ 5 % pour minimiser les dommages photographiques aux cellules.

Utilisez le réglage sur les lasers microscope pour les spectres d’excitation et d’émission de TMRM et Fluo 4 AM. Utilisez une faible puissance laser d’environ cinq pour cent avec un gain élevé pour minimiser les dommages photographiques des cellules. Ensuite, réglez le microscope pour qu’il scanne les images toutes les vingt-cinq secondes. Balayez les cellules pendant dix minutes pour établir les lectures de base pour les signaux TMRM et Fluo 4.

Ensuite, interrompez le balayage de l’image et ajoutez 3 microlitres de solution mère de chlorure de calcium de 40 millimolaires directement dans les cellules dans 300 microlitres de solution d’imagerie IM. Mélangez délicatement à l’aide d’une pipette. Lorsque vous ajoutez une solution de calcium aux cellules, veillez à ne pas déplacer la parabole sur la platine du microscope.

Poursuivez la numérisation de l’image pendant environ quatre minutes. Répétez ensuite les ajouts de chlorure de calcium toutes les quatre minutes jusqu’à ce que les signaux TMRM ou Fluo 4 souhaités soient atteints, généralement environ huit à dix ajouts. Par la suite, ajoutez une dilution de 1 à 100 d’un FCCP millimolaire directement dans les cellules pour dissiper le potentiel de la membrane interne.

Ensuite, imagez les cellules pendant cinq minutes supplémentaires avant la fin de l’expérience. Une fois l’imagerie terminée, déterminez l’intensité des signaux Fluo 4 et TMRM à l’aide du logiciel d’analyse d’images. Pour ce faire, ouvrez l’image, cliquez sur l’outil de sélection et sélectionnez une région d’intérêt qui contient des mitochondries.

Plusieurs régions d’intérêt peuvent être sélectionnées pour la mesure en ouvrant Analyser, Outils, Gestionnaire de retour sur investissement. Cliquez sur Ajouter pour inclure le retour sur investissement sélectionné pour la mesure de l’intensité. Répétez les étapes précédentes jusqu’à ce que tous les retours sur investissement aient été ajoutés au gestionnaire de retour sur investissement.

Mesurez l’intensité fluorescente moyenne des signaux TMRM et Fluo 4 pour chaque région d’intérêt en sélectionnant la fonction de mesure la plus multiple. Assurez-vous que l’option Mesurer toutes les tranches est sélectionnée et que l’option Une ligne par tranche est désélectionnée. Cliquez ensuite sur OK pour obtenir un tableau de l’intensité fluorescente moyenne des signaux TMRM et Fluo 4 pour chaque retour sur investissement à chaque point de temps.

Combinez ensuite les données pour calculer l’intensité moyenne et l’écart-type des signaux TMRM et Fluo 4. Dans cette expérience, les cellules 143B ont été préchargées avec Fluo 4 AM et TMRM avant d’être perméabilisées avec de la digitonine. Après chaque ajout de chlorure de calcium, le signal TMRM diminue à mesure que l’afflux d’ions calcium dans les mitochondries dissipe le potentiel de la membrane mitochondriale.

Un faible potentiel membranaire est évident après la transition de perméabilité, car l’ajout de 10 FCCP micromolaires induit toujours un effondrement du potentiel membranaire. Ici, la concentration de calcium mitochondrial, indiquée par le signal Fluo 4, commence à augmenter après le deuxième ajout de chlorure de calcium lorsque le calcium libre dans le milieu atteint 0,32 micromolaire. Chaque ajout ultérieur de chlorure de calcium a provoqué une augmentation progressive du calcium mitochondrial.

Voici les images de mesures simultanées du potentiel membranaire dans le calcium mitochondrial. Le signal rouge indique TMRM et le signal vert indique Fluo 4. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ deux heures si elle est exécutée correctement.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer simultanément les niveaux de calcium mitochondrial et le potentiel de la membrane mitochondriale en microscopie confocale en utilisant l’ajout de calcium exogène aux cellules perméabilisées. N’oubliez pas que travailler avec le FCCP et la digitonine peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port d’un EPI doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.