Name: Mesure simultanée de mitochondrial Calcium et mitochondrial potentiel membranaire dans des cellules vivantes par microscopie à fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Découvrez une méthode de microscopie confocale pour mesurer simultanément le calcium mitochondrial et le potentiel membranaire dans des cellules vivantes sans manipulation génétique.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nous remercions Dr Kirstin Elgass et le Dr Sarah Creed de Monash Micro Imaging pour l&#39;assistance technique, et le Wellcome Trust et Medical Research Council du Royaume-Uni pour un soutien financier. MMcK soutient le Conseil de recherches Future Fellowship Scheme australien (FT120100459), la Fondation William Buckland, La Fondation des maladies mitochondriales australien (AMDF), l&#39;Institut Hudson de la recherche médicale et de l&#39;Université Monash. Ce travail a été soutenu par le régime de soutien de l&#39;infrastructure opérationnelle du gouvernement de Victoria.

1. Préparation des cellules <ol><li> Cultiver les cellules sur 10 cm des boîtes de culture cellulaire ou flacons de 75 cm2 dans les milieux de culture [10 ml Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco supplémenté avec 5% (v / v) de sérum de veau fœtal (FBS) et 1x pénicilline / streptomycine (p / s )] à 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> Pour récolter les cellules, retirer le support par aspiration, puis laver avec 5 ml 1x tampon phosphate salin (PBS 1x). Retirer PBS 1x par aspiration, puis ajouter 1,5 ml de 0,25% (p / v) de trypsine / 0,25% (p / v) d&#39; acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et on incube à 37 ° C / 5% de CO 2 pendant 2 min. Appuyez sur plat ou flacon doucement pour éliminer les cellules, puis remettre en suspension dans 5 ml de milieux de culture. </li><li> Compter les cellules en ajoutant 12 pi de cellules remises en suspension sur un hémocytomètre. </li><li> cellules en plaques dans des boîtes ou des lamelles chambré pour l&#39;imagerie confocale. NOTE: Ceux-ci auront un fond en plastique ou en verre approprié qui a été conçu pour être utilisé avec des microscopes inversés. </li><li> cellules de la plaque de sorte thà ~ 80% de confluence est atteinte le jour de l&#39;image. Par exemple, environ 2 x 10 4 cellules d&#39;ostéosarcome 143B peuvent être étalées dans un puits d&#39;une lame de chambre 8 puits un jour avant l&#39; imagerie. </li><li> Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C / 5% de CO2 pour permettre aux cellules de se fixer et de se rétablir. </li></ol> 2. Tampons pour TMRM et Fluo-4 Imaging <ol><li> Préparer la solution d&#39;enregistrement (RS) contenant du NaCl 156 mM, KCl 3 mM, 2 mM de MgSO4, 1,25 mM de KH 2 PO 4 10 mM , D-glucose, 2 mM de CaCl2 et 10 mM de HEPES à pH 7,35. Magasin RS à -20 ºC. </li><li> Préparer Intracellulaire moyenne (IM) contenant 6 mM de NaCl, KCl 130, 7,8 mM de MgCl2, 1 mM de KH 2 PO 4, 0,4 mM de CaCl2, 2 mM d&#39; EGTA mM HEDTA 10 mM malate de 2 mM de glutamate 2, 2 mM ADP et de l&#39;HEPES 20 mM pH 7,1. 200 solutions mM d&#39;actions de malate, le glutamate et l&#39;ADP peuvent être préparés séparément, aliquotés et conservés à -20 ° C. Ces sttroupeaux peuvent être ajoutés à l&#39;IM juste avant utilisation. </li><li> Ca solution saline tamponnée 2+ libre de Hank (HBSS) peut être obtenu de pré-préparé à partir de fournisseurs commerciaux. Ajouter de l&#39;éthylène glycol-bis (éther β-aminoéthyl) -N, N, N &#39;, N&#39;-tétraacétique (EGTA) à une concentration finale de 500 uM. </li><li> Préparer une solution mère de tétraméthylrhodamine 10 mM, ester méthylique, perchlorate (TMRM) dans 100% de méthanol. De ce stock, faire un stock de travail de 2 uM dans l&#39; eau distillée 2 O. </li><li> Préparer une solution mère de vérapamil mM 10 dans 100% d&#39;éthanol. </li><li> Préparer un 1 mg / ml (p / v) solution mère de Fluo-4 ester acétoxyméthyle (Fluo-4, AM) dans le diméthylsulfoxyde (DMSO). NOTE: Fluo-4 AM est un indicateur de calcium qui présente a augmenté la fluorescence lors de la liaison Ca 2+. Fluo-4 est un analogue de Fluo-3, les deux substituants chloro remplacés par des atomes de fluor. Il en résulte une augmentation de l&#39;excitation de fluorescence à 488 nm et des niveaux de signal de fluorescence plus élevé. leun groupe ester AM se traduit par une Fluo-4 molécules non chargées qui peuvent pénétrer dans les membranes cellulaires. Une fois dans la cellule, l&#39;ester AM est clivée par des esterases non spécifiques, résultant en une forme chargée de Fluo-4 qui est emprisonné à l&#39;intérieur de la cellule. </li><li> Préparer une solution mère de 1 mM carbonyl cyanure p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) dans 100% d&#39;éthanol. </li><li> Préparer une solution mère de 25 mg / ml (p / v) digitonine en H distillée 2 O. </li><li> Préparer une solution stock de 100 pM thapsigargine dans le DMSO. </li><li> Préparer une solution mère de 40 mM de chlorure de calcium (CaCl 2) dans l&#39; eau distillée 2 O. </li></ol> 3. Coloration des cellules avec TMRM et Fluo-4, AM <ol><li> Préparer une solution RS coloration avec 20nM TMRM, 5 ug / ml (p / v) de Fluo-4 AM et 0,005% de tensioactif tel que le Pluronic F-127 RS. NOTE: L&#39;agent tensio-actif non ionique est un polyol qui facilite la solubilisation de Fluo-4 AM. Note: 10 uM vérapamil peut également être ajouté à INHIBIt TMRM exportation par le transporteur multidrogues de la membrane plasmique, si elle est exprimée dans le type de cellules en cours d&#39;analyse. </li><li> Retirer les milieux de culture de cellules à la pipette et laver avec 100 pi 1x PBS. </li><li> Retirer PBS 1x à la pipette et laisser incuber les cellules dans une solution de coloration RS 250 pi pendant 45 min à température ambiante. Remarque: Une fois que le Fluo-4 AM pénètre dans la cellule, l&#39;ester AM est clivée par des esterases cellulaires. Incubant à la température ambiante, inhibe l&#39;activité d&#39;estérase, ce qui permet Fluo-4 AM à pénétrer dans les mitochondries. </li><li> Retirer la solution RS de coloration par pipette et laver les cellules dans 100 ul de Ca 2+ libre HBSS pour éliminer l&#39; excès Fluo-4, AM et TMRM. </li><li> Préparer une solution d&#39;imagerie IM avec 25 pg / ml (p / v) digitonine, 200 nM TMRM et 1 uM thapsigargine dans IM. Remarque: la concentration de la digitonine peut devoir être ajusté pour faire en sorte que la perméabilisation de la membrane mitochondriale interne ne se produit pas. Ceci peut être déterminé de façon empirique par l&#39;évaluation de l&#39;intensitéTMRM du signal à différentes concentrations de digitonine. </li><li> Retirer le Ca2 + libre HBSS par pipette et ajouter 300 ul d&#39; une solution IM d&#39;imagerie vers les cellules. Laisser les cellules à l&#39;équilibre à la température ambiante pendant 10 min. Les cellules sont maintenant prêts pour l&#39; imagerie avec CaCl 2 ajouts. </li></ol> 4. imagerie cellulaire <ol><li> Placer un plat ou lamelle couvre-chambré avec des cellules dans une solution IM d&#39;imagerie sur un microscope confocal à balayage laser inversée. </li><li> Utiliser le réglage sur les lasers à microscope pour l&#39;excitation et l&#39;émission de spectres TMRM et Fluo-4. Par exemple, utiliser 543 nm He-Ne et 473 nm lignes laser d&#39;argon pour exciter TMRM et Fluo-4 respectivement. Utiliser une faible puissance laser d&#39;environ 5% afin de minimiser toute photo-endommagement des cellules. </li><li> Set microscope pour numériser des images toutes les 25 sec. cellules d&#39;analyse pour 10 min pour établir des lectures de référence pour la TMRM et Fluo-4 signaux. NOTE: Le signal Fluo-4 peut être faible ou indétectable au repos concent de calciumrations. </li><li> Ajouter 3 pi de mM CaCl2 solution mère 40 directement aux cellules dans 300 pi de solution d&#39;imagerie IM (1: 100 de dilution) et mélanger doucement avec une pipette. Pause de la numérisation de l&#39; image tout en ajoutant et en mélangeant le CaCl 2 si nécessaire. NOTE: La libre concentration finale d&#39;ions Ca 2+ [Ca 2+] dans la solution d&#39;imagerie IM peut être calculé à l&#39; aide de logiciels tels que Maxchelator WEBMAXC ETENDU ( <a href="http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html">http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html</a> ) ou chélateur 11. Une description détaillée de la façon de calculer la libre concentration finale d&#39;ions Ca 2+ [Ca 2+] est décrite dans la section 6 ci - dessous. </li><li> Poursuivre l&#39; analyse de l&#39; image pendant environ 4 min, puis répétez CaCl 2 ajouts toutes les 4 min jusqu&#39;à ce que la TMRM désirée ou Fluo-4 signaux sont atteints, généralement autour de 8 à 10 additions. </li><li> En utilisant une pipette, ajouter une dilution 1: 100 de 1 mM FCCP (c finaleoncentration de 10 uM) directement aux cellules de se dissiper ΔΨ m. cellules d&#39;image pour un autre 5 min. L&#39;expérience est maintenant terminée. </li></ol> 5. Analyse de l&#39;image <ol><li> Une fois que l&#39;imagerie est terminée, déterminer l&#39;intensité des signaux Fluo-4 et TMRM en utilisant un logiciel d&#39;analyse d&#39;image, par exemple un logiciel ImageJ avec le plugin Bio-formats (download &#39;bioformats_package.jar&#39; de http://downloads.openmicroscopy.org/bio -formats / et enregistrez-le dans: le dossier &#39;C plugins Program Files ImageJ s). </li><li> Ouvrez le fichier d&#39;image (par exemple un fichier .oif) dans ImageJ. Cliquez sur l&#39;outil de sélection et sélectionnez une région d&#39;intérêt (ROI) qui contient des mitochondries. Utilisez le signal de TMRM initial pour sélectionner le retour sur investissement. </li><li> Ouvrir &#39;Analyse&gt; Outils&gt; Gestionnaire de retour sur investissement », cliquez sur« Ajouter »pour inclure le ROI sélectionnée pour la mesure de l&#39;intensité. ROIs multiples peuvent être sélectionnés sur une seule image pour la mesure. Répétez les étapes précédentes jusqu&#39;à ce que tous les ROIs ont été ajoutés au gestionnaire de ROI. </li><li> Cliquez sur &quot;Plus&gt; Multi Mesure &#39;, assurez-vous que« Mesurer toutes les tranches &quot;est sélectionné et que« une ligne par tranche&#39; est désactivée, puis cliquez sur &#39;OK&#39; pour obtenir une table d&#39;intensité de fluorescence moyenne des TMRM et Fluo-4 signaux pour chaque ROI à chaque point de temps. </li><li> Utiliser les données de tous les ROIs pour calculer les intensités moyennes et écart-type pour le TMRM et Fluo-4 signaux. </li></ol> 6. Calcul de la finale Ca 2+ gratuit Ion Concentration [Ca 2+] <ol><li> La libre Ca 2+ concentration d&#39;ions [Ca 2+] dans la solution d&#39;imagerie IM peut être déterminée en utilisant des logiciels tels que Maxchelator WEBMAXC ETENDU ( <a href="http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html">http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html</a> ) ou chélateur 11. Par exemple, définir les variables dans WEBMAXC prorogés comme suit: Température = 24 ° C, pH = 7.1, la force ionique = 0,162, 0,002 M d&#39; EGTA =, HEDTA = 0,01 M, Ca 2+ = 0,0004 M et Mg 2+ = 0,0078 M. Il en résulte une concentration en Ca2 + libre finale d&#39;ions [Ca2 +] de 62 nm . Notez que ces programmes ne peuvent pas prendre en compte toutes les variables, telles que la pureté des réactifs, la précision des mesures et la détermination du pH. La méthode la plus précise pour déterminer la libre concentration Ca 2+ est d&#39;utiliser une électrode sélective d&#39;un Ca étalonné. </li></ol>

<ol><li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+the+hub+of+cellular+Ca2%2B+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling.</a> Physiology. 23, 84-94 (2008).</li>
<li>Jacobson, J., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+mitochondria+and+cellular+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Interplay between mitochondria and cellular calcium signalling.</a> Mol. Cell. Biochem. 256-257, 209-218 (2004).</li>
<li>Bhosale, G., Sharpe, J. A., Sundier, S. Y., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+as+a+mediator+of+cell+energy+demand+and+a+trigger+to+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling as a mediator of cell energy demand and a trigger to cell.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1350, 107-116 (2015).</li>
<li>Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+calcium-dependent+neuronal+death+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Mitochondria calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease.</a> Pflugers Arch. 464, 111-121 (2012).</li>
<li>Drummond, R. M., Mix, T. C., Tuft, R. A., Walsh, J. V., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Ca2%2B+homeostasis+during+Ca2%2B+influx+and+Ca2%2B+release+in+gastric+myocytes+from+Bufo+marinus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Ca2+ homeostasis during Ca2+ influx and Ca2+ release in gastric myocytes from Bufo marinus.</a> J. Physiol. 522, 375-390 (2000).</li>
<li>Hajnoczky, G., Robb-Gaspers, L. D., Seitz, M. B., Thomas, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+of+cytosolic+calcium+oscillations+in+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Decoding of cytosolic calcium oscillations in the mitochondria.</a> Cell. 82, 415-424 (1995).</li>
<li>Davidson, S. M., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22057570">Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy.</a> Methods Mol. Biol. 810, 219-234 (2012).</li>
<li>Pozzan, T., Rudolf, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19100709">Measurements of mitochondrial calcium in vivo.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1787, 1317-1323 (2009).</li>
<li>Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+changes+of+mitochondrial+Ca2%2B+revealed+by+specifically+targeted+recombinant+aequorin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin.</a> Nature. 358, 325-327 (1992).</li>
<li>Pitter, J. G., Maechler, P., Wollheim, C. B., Spat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+respond+to+Ca2%2B+already+in+the+submicromolar+range%3A+correlation+with+redox+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondria respond to Ca2+ already in the submicromolar range: correlation with redox state.</a> Cell Calcium. 31, 97-104 (2002).</li>
<li>Schoenmakers, T. J., Visser, G. J., Flik, G., Theuvenet, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHELATOR%3A+an+improved+method+for+computing+metal+ion+concentrations+in+physiological+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">CHELATOR: an improved method for computing metal ion concentrations in physiological solutions.</a> BioTechniques. 12, 870-879 (1992).</li>
<li>McKenzie, M., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+Cellular+Bioenergetics+Causes+Mitochondrial+Calcium+Handling+Defects+in+MT-ND5+Mutant+Cybrids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impaired Cellular Bioenergetics Causes Mitochondrial Calcium Handling Defects in MT-ND5 Mutant Cybrids.</a> PLoS One. 11, e0154371(2016).</li>
<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li>
<li>Homolya, L., Hollo, Z., Germann, U. A., Pastan, I., Gottesman, M. M., Sarkadi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cellular+indicators+are+extruded+by+the+multidrug+resistance+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cellular indicators are extruded by the multidrug resistance protein.</a> J. Biol. Chem. 268, 21493-21496 (1993).</li>
<li>Fujimoto, K., Chen, Y., Polonsky, K. S., Dorn, G. W. 2nd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cyclophilin+D+and+the+mitochondrial+permeability+transition+enhances+beta-cell+survival+and+prevents+diabetes+in+Pdx1+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeting cyclophilin D and the mitochondrial permeability transition enhances beta-cell survival and prevents diabetes in Pdx1 deficiency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 10214-10219 (2010).</li>
<li>Rao, V. K., Carlson, E. A., Yan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+permeability+transition+pore+is+a+potential+drug+target+for+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial permeability transition pore is a potential drug target for neurodegeneration.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1842, 1267-1272 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Le calcium joue un rôle important dans de nombreux processus cellulaires, y compris la contraction musculaire, la signalisation neuronale et la prolifération cellulaire 13. L&#39; augmentation des concentrations de calcium cellulaire sont souvent associés à la demande d&#39;énergie, avec le calcium capable de stimuler directement la phosphorylation oxydative mitochondriale pour augmenter la génération d&#39; ATP 3. Il est donc essentiel que nous avons la capacité de survei...

Les mitochondries jouent un rôle important dans la régulation de la concentration intracellulaire de Ca2 + en agissant comme locaux Ca 2+ tampons 1. Ca 2+ entre les mitochondries via le uniport Ca 2+, un processus piloté par le gradient électrochimique qui existe à travers la membrane mitochondriale interne (ΔΨ m) 2. Une fois dans la matrice mitochondriale, Ca 2+ peut activer la phosphorylation oxydative en stimulant trois déshydrogénases limitant la vitesse du cycle de l&#39; acide citrique 3. Cette stimulation maintient ΔΨ m, qui est temporairement dissipée sous les ions calcium positifs traversent la membrane mitochondriale interne dans la matrice mitochondriale. Si la concentration de Ca2 + dans les mitochondries devient très élevée, la transition de perméabilité mitochondriale peut être déclenchée, entraînant la dissipation de ΔΨ m, la cessation de la phosphorylation oxydative et l&#39;induction de la mort cellulaire des voies de signalisation 4. Le rôle important que jouent les mitochondries dans la mémoire tampon spatiale du calcium cellulaire rend le contrôle précis du calcium mitochondrial critique. Diverses méthodes ont été mis en place pour surveiller le calcium mitochondrial, y compris l&#39;utilisation de colorants à base de rhodamine. Un tel colorant, Rhod-2, AM, est très efficace au partitionnement des mitochondries pour mesurer mitochondriales niveaux de Ca2 + 5, 6. Cependant, les soins doit être utilisé comme certains colorants accumulera dans d&#39;autres organites, tels que les liposomes, ou de rester dans le cytosol des cellules. Cependant, des analyses en aval peuvent être utilisés pour distinguer ces signaux de ceux de la mitochondrie 7. Une autre technique pour surveiller le calcium mitochondrial utilise rapporteur fluorescent construit 8 </s<html> up&gt;. L&#39;avantage de ces sondes codées génétiquement est qu&#39;ils peuvent être spécifiquement ciblé vers les mitochondries en utilisant des peptides endogènes N-terminal, par exemple le signal de ciblage N-terminal de la sous-unité VIII de la COX humaine. Ce système a été utilisé pour générer une sonde aequorine mitochondriale ciblée qui a révélé extrêmement utile pour étudier le calcium mitochondrial de signalisation 9. Le principal inconvénient de ces sondes codées génétiquement est qu&#39;ils doivent être introduits dans les cellules par l&#39;expression transitoire (ce qui est impossible pour certains types de cellules et peuvent produire des résultats variables) ou en créant des systèmes d&#39;expression stables (qui prend du temps). Pour contourner les problèmes décrits ci - dessus, nous avons développé un nouveau protocole pour mesurer mitochondrial Ca 2+ et ΔΨ m simultanément. Ce protocole est basé sur une méthode décrite précédemment qui ajoute du calcium exogène à des cellules perméabiliséess = &quot;xref&quot;&gt; 10. Notre protocole a trois principaux avantages par rapport aux autres méthodes: tout d&#39; abord, nous utilisons Fluo-4, AM et TMRM pour surveiller Ca 2+ et mitochondrial ΔΨ m, deux colorants qui ont des propriétés spectrales très distinctes; d&#39; autre part, les cellules sont perméabilisées afin que le signal Fluo-4 est seulement détecter mitochondrial Ca2 + et Ca2 + non localisé à d&#39; autres organelles ou dans le cytosol des cellules; et troisièmement, l&#39;utilisation de Fluo-4 pour détecter Ca 2+ mitochondrial permet de coloration cellulaire simple et rapide, éliminant tous les problèmes de transfection ou de transformation cellulaire qui existent si l&#39;on utilise des sondes codées génétiquement.

<table><tbody><tr><td>Milieu Eagle modifié Dulbecco’s (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>100x pénicilline/streptomycine (p/s)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % de trypsine/0,25 % d’EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td>25200056</tr><tr><td>lamelle à 8 puits à chambre</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746452</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>HEDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8126&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>malate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>glutamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+ gratuit Hank' s solution saline tamponnée (HBSS)&nbsp ;</td><td>ThermoFisher</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>tétraméthylrhodamine, ester méthylique, perchlorate (TMRM)</td><td>ThermoFisher</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 acétoxyméthyle ester (Fluo-4, AM)</td><td>ThermoFisher</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>ThermoFisher</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>cyanure de carbonyle p-trifluorométhoxyphénylhydrazone (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>digitonine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>thapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&nbsp ;</td><td>ThermoFisher</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>hémacytomètre</td><td>VWR</td><td>631-0925</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Boîtes de culture cellulaire</td><td>Corning</td><td>COR430167</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Fioles de culture cellulaire</td><td>Corning</td><td>COR430641</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure simultanée de mitochondrial calcium et mitochondrial potentiel membranaire dans des cellules vivantes par microscopie à fluorescence

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

En dehors de leur rôle essentiel dans la création de l&#39; ATP, les mitochondries jouent également le rôle du calcium local (Ca2 +) tampons à bien réguler la concentration intracellulaire de Ca2 +. Pour ce faire, les mitochondries utilisent le potentiel électrochimique à travers leur membrane interne (ΔΨ m) pour séquestrer le Ca 2+. L&#39;afflux de Ca2 + dans les mitochondries stimule trois déshydrogénases limitant la vitesse du cycle de l&#39; acide citrique, ce qui augmente le transfert d&#39;électrons à travers la phosphorylation oxydative (OXPHOS) complexes. Cette stimulation maintient ΔΨ m, qui est temporairement dissipée sous les ions calcium positifs traversent la membrane mitochondriale interne dans la matrice mitochondriale. Nous décrivons ici une méthode pour les mitochondries de mesure simultanément Ca 2+ d&#39;absorption et ΔΨ m dans les cellules vivantes en utilisant la microscopie confocale. En perméabilisant les cellules, Ca 2+ mitochondrial peutmesurer à l&#39; aide de Ca 2+ indicateur fluorescent Fluo-4 AM, avec mesure de ΔΨ m à l&#39; aide du colorant fluorescent tétraméthylrhodamine, l&#39; ester méthylique, le perchlorate (TMRM). L&#39;avantage de ce système est qu&#39;il existe très peu de chevauchement spectral entre les colorants fluorescents, ce qui permet simultanément une mesure précise de la mitochondrie Ca 2+ et ΔΨ m. En utilisant l&#39;addition séquentielle d&#39;aliquotes de Ca 2+, Ca 2+ absorption mitochondriale peut être contrôlée, et la concentration à laquelle Ca2 + mitochondrial induit une transition de perméabilité de la membrane et la perte de m ΔΨ déterminée.

Nous avons utilisé ce protocole pour examiner les effets d&#39;une mutation MT-ND5 sur la capacité des mitochondries des cellules 143B au tampon augmente en calcium 12. Dans l&#39;exemple représenté ici, les cellules 143B de commande ont été chargées avec Fluo-TMRM et 4, AM avant de perméabilisation à la digitonine. Après 5 min d&#39;imagerie, huit additions séquentielles d&#39;une dilution 1: 100 de 40 mM de CaCl 2 exogènes ont été faites, la ...

Les mitochondries peuvent utiliser le potentiel électrochimique à travers leur membrane interne (Δ Ψm) pour séquestrer le calcium (Ca2 +), ce qui leur permet de façonner Ca cytosolique 2+ de signalisation dans la cellule. Nous décrivons un procédé pour mesurer simultanément les mitochondries Ca2 + d&#39;absorption et ΔΨ m dans les cellules vivantes en utilisant des colorants fluorescents et de la microscopie confocale.

Mesure simultanée de mitochondrial Calcium et mitochondrial potentiel membranaire dans des cellules vivantes par microscopie à fluorescence

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

L'objectif général de cette procédure est de fournir une méthode simple pour mesurer simultanément la prise de calcium mitochondrial et le potentiel de membrane mitochondrial dans des cellules vivantes à l'aide de la microscopie confocale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine mitochondrial, telles que la manière dont les mitochondries agissent comme des réserves locales de calcium afin de réguler étroitement la concentration intracellulaire de calcium. Le principal avantage de cette technique est que le calcium mitochondrial et le potentiel de membrane mitochondrial peuvent être mesurés spécifiquement et simultanément dans des cellules vivantes, sans nécessiter de manipulation génétique.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la régulation du calcium dans la pathologie des maladies mitochondriales, elle peut également être utilisée pour étudier d'autres affections dégénératives plus récentes, lorsque la régulation urinaire du calcium est cruciale. Dans cette procédure, cultiver les cellules sur des boîtes de culture de dix centimètres de diamètre ou dans des fioles de 75 centimètres carrés, en milieu de culture à 37 degrés Cels

simultaneous-measurement-mitochondrial-calcium-mitochondrial-membrane

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ce protocole décrit une méthode pour mesurer en temps réel des flux de calcium mitochondrial par imagerie de fluorescence. La méthode tire parti d'une circulaire permuté YFP à base de capteurs de calcium à double excitation ratiométrique (ratiométrique pericam-mt) sélectivement exprimé dans les mitochondries.

Surveillance des changements dynamiques dans les niveaux de calcium mitochondrial cours de l&#39;apoptose en utilisant un capteur de calcium codées génétiquement

Nous présentons une méthode pour isoler rapidement des événements de calcium (microseconde) à partir des flux plus lent dans les cellules vivantes en utilisant microscopie confocale à balayage laser. La méthode de mesures des fluctuations d'intensité de fluorescence des indicateurs de calcium par les analyses en ligne l'enregistrement de plusieurs centaines de pixels dans une cellule. Analyse de l'histogramme nous permet d'isoler les échelles de temps des différents flux de calcium.

Mesurer les flux de calcium dans les cardiomyocytes rapide

De fusion mitochondriale a été mesurée par le suivi de l'équilibrage de photoconverted matrice ciblée GFP à travers le réseau mitochondrial au cours du temps. Jusqu'à présent, une seule cellule pourrait être soumis à une analyse cinétique à long heure à une heure. Nous présentons une méthode qui permet de mesurer simultanément plusieurs cellules, ce qui accélère le processus de collecte de données.

Plus rapide, à haute résolution, la MTPA-GFP basée sur Fusion test mitochondrial l&#39;acquisition de données cinétiques de plusieurs cellules en parallèle en utilisant la microscopie confocale

Cette vidéo décrit un test basé sur un lecteur de plaque pour mesurer l’absorption de calcium mitochondrial dans des mitochondries isolées. Le test analyse le signal de fluorescence d’un colorant fluorescent sensible au calcium pour étudier la cinétique de l’absorption mitochondriale du calcium et de la surcharge calcique.

Dosage de l’absorption du calcium mitochondrial : méthode basée sur un lecteur de plaque pour mesurer l’absorption du calcium dans des mitochondries isolées

Cette vidéo décrit un test basé sur l’imagerie par microscopie confocale pour mesurer l’absorption de calcium mitochondrial dans les cellules en culture. Le test utilise le colorant fluorescent sensible au calcium Rhod-2/AM pour mesurer le calcium mitochondrial dans les cellules cultivées perméabilisées.

Dosage de l’influx de calcium pour mesurer l’absorption de calcium mitochondrial dans les cellules cultivées

La vidéo montre la mesure simultanée des niveaux de calcium intracellulaire et des modifications du potentiel membranaire dans les cellules endothéliales des segments de l’artère cérébrale de souris. Le tube endothélial isolé est chargé d’un indicateur de calcium fluorescent et traité avec un médicament qui induit la libération intracellulaire de calcium, entraînant une modification du potentiel membranaire. La fluorescence de l'indicateur permet de mesurer les niveaux de calcium, et une...

Mesure simultanée du calcium intracellulaire et du potentiel membranaire dans l’endothélium cérébral d’une souris

Ce protocole a pour but de décrire une méthode afin d’examiner la capacité de rétention en Ca2 + et Ca2 +- déclenchée mitochondrial gonflement des mitochondries isolées de SH-SY5Y cellules étape par étape.

Mitochondrial Ca2 + rétention capacité dosage et Ca2 +-déclenchée gonflement Mitochondrial test

Nous présentons ici deux protocoles pour mesurer des influx mitochondriale de Ca2 + dans les mitochondries isolées et des cellules. Pour les mitochondries isolées, nous détaillons une plaque base lecteur Ca2 + importation de dosage à l’aide du Ca2 + sensibles teindre calcium vert-5N. Pour les cellules cultivées, on décrit une méthode de microscopie confocale en utilisant le Ca2 + colorant Rhod-2/AM.

Analyses des Influx de Calcium mitochondrique dans les mitochondries isolées et des cellules

Montré ici sont des protocoles d’isolement (1) fraîchement endothélium cérébrales intacts « tubes » et des mesures (2) simultanées de calcium endothéliale et potentiel durant l’Hyperpolarisation dérivé de l’endothélium de membrane. En outre, ces méthodes permettent d’avoir écouté pharmacologique du calcium des cellules endothéliales et signalisation électrique comme variables expérimentales individuels ou interactives.

Mesure simultanée de Calcium intracellulaire et le potentiel de Membrane dans l’endothélium cérébral de souris fraîchement isolées et intacte

Cette technique décrit un flux de travail efficace pour visualiser et mesurer quantitativement le potentiel de la membrane mitochondriale et les niveaux de superoxyde dans les cellules HeLa à l’aide de l’imagerie en direct basée sur la fluorescence.

Quantification basée sur la fluorescence du potentiel de membrane mitochondriale et des niveaux de superoxyde à l’aide de l’imagerie en direct dans les cellules HeLa

Découvrez une méthode de microscopie confocale pour mesurer simultanément le calcium mitochondrial et le potentiel membranaire dans des cellules vivantes sans manipulation génétique.

Mesure simultanée de mitochondrial Calcium et mitochondrial potentiel membranaire dans des cellules vivantes par microscopie à fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal

Mesure simultanée de mitochondrial Calcium et mitochondrial potentiel membranaire dans des cellules vivantes par microscopie à fluorescence

Explorer plus de vidéos