En direct d'imagerie cellulaire et l'analyse 3D des antagonistes des récepteurs de type 1a traite des transfectées embryonnaires humaines cellules rénales Utilisation Microscopie confocale

L'objectif général de cette expérience est d'obtenir des preuves quantitatives spatiales et temporelles de la colocalisation du récepteur de l'angiotensine de type 1 avec les lysosomes après un traitement par l'angiotensine 2. Cette méthode a été conçue pour détecter des différences dans le traitement subcellulaire des récepteurs de type Y par rapport aux récepteurs mutants, comme cela se produit lors du processus d'internalisation en réponse à une stimulation par un ligand. Les avantages de cette technique sont que l'imagerie en cellules vivantes élimine les artéfacts provenant des cellules fixées et perméabilisées par des détergents, et que les changements dynamiques de la localisation des récepteurs peuvent être évalués en temps réel.

Commencez par sélectionner un objectif approprié avec une ouverture numérique de 1,4 et centrez l'objectif au-dessus de la platine du microscope. Ajoutez une goutte d'huile à immersion de haute viscosité et à faible autofluorescence sur l'objectif, puis placez la chambre contenant les cellules transfectées sur la platine du microscope. Remontez délicatement l'objectif jusqu'à ce que l'huile touche juste le bas de la première lame, puis localisez les cellules peu lumineuses.

Avec une cellule saine d'intérêt, située au centre du champ de vision, passez en mode confocal et vérifiez que la cellule est bien étalée, avec sa face ventrale étroitement juxtaposée à la lame. Ouvrez la boîte de dialogue Z Stack, cliquez sur Live, focalisez-vous sur le sommet de la cellule, puis cliquez sur Begin. Ensuite, focalisez-vous sur la base de la cellule, saisissez une taille de pas Z de 1,00 micromètre, puis cliquez sur End.

Ensuite, sélectionnez le mode XYZT dans les paramètres d'acquisition situés en haut. Enfin, réglez l'intervalle de temps pour l'analyse et la durée de l'analyse afin d'observer le ciblage du récepteur de l'angiotensine de type 1A marqué par la GFP vers les lysosomes. Puis, pour commencer la stimulation par le ligand, ajoutez trois microlitres d'une solution mère à 100 X du ligand dans la cavité en cours d'imagerie et cliquez sur Démarrer pour imager la réponse en 3D pendant la période et la fréquence souhaitées.

Pour analyser les images de cellules vivantes, ouvrez le logiciel approprié de quantification d'images 3D. Dans ce protocole, Velocity. Cliquez avec le bouton droit dans le champ de l'image et sélectionnez Propriétés.

Saisissez les propriétés appropriées des pixels d’image XY et Z pour créer une séquence de mesure afin d’analyser les vésicules du récepteur marquées par GFP et les intensités des cellules entières en réponse au traitement par le ligand. Dans le menu 2D, sélectionnez le mode de mise au point étendue pour observer la cellule. Ensuite, utilisez l’outil de région libre pour dessiner une région d’intérêt autour de la cellule, puis cliquez avec le bouton droit sur l’image pour sélectionner Rogner selon la sélection.

Un nouvel élément image sera généré. Cliquez sur le nom de l'image pour sélectionner l'image de la cellule recadrée et ouvrez l'onglet de mesure. Pour mesurer l'expression de la GFP dans les vésicules internalisées, faites glisser Trouver des objets depuis la section Recherche vers la zone de séquence ci-dessus.

Définissez le canal de détection des objets sur GFP et ouvrez l'icône des paramètres pour régler le seuil selon l'écart type et la limite inférieure à six, afin de sélectionner les objets présentant les intensités GFP les plus fortes. Réglez la taille minimale des objets à zéro micromètre cube. Ensuite, cliquez sur mesurer, puis sélectionnez les canaux et les types de mesures.

Pour définir le seuillage et les filtres permettant d'identifier la cellule entière et de mesurer l'intensité totale de la GFP, faites glisser une deuxième boîte « Find Objects ». Ensuite, réglez le canal Find Objects sur GFP et fixez l'écart type à zéro afin de sélectionner les objets présentant une intensité de GFP quelconque, et définissez la taille minimale de l'objet à deux micromètres cubes. Faites glisser « Filter Population » vers la boîte Population deux Find Objects et sélectionnez un volume en micromètres cubes supérieur à 100 pour sélectionner la cellule entière et éliminer tous les objets plus petits.

Ensuite, sélectionnez les mesures et l'élément « Make Measurement » pour effectuer des mesures à tous les points temporels. Pour analyser l'expression de la GFP dans les vésicules et dans la cellule entière au cours du temps, cliquez sur le nom de fichier de l'élément de mesure situé sous le nom de l'image. Pour extraire les données relatives à la GFP et aux vésicules à partir des données totales, ouvrez l'onglet « raw » et sélectionnez la population un.

Ensuite, ouvrez l'onglet analysé et, en cliquant avec le bouton droit sur les données, sélectionnez Analyse, puis restreignez l'analyse à la population un. Pour mesurer la quantité de GFP dans l'ensemble de la cellule, modifiez les deux paramètres pour la population deux. Sous Analyser ces données et Résumé par, sélectionnez le canal de couleur GFP total et Somme.

Ensuite, sous Organiser les données par, et ligne, sélectionnez point temporel. Pour extraire les données relatives à la quantité de GFP dans les lysosomes, dans la section Trouver les objets pour la population un, réglez le canal de détection des objets sur le canal rouge. Dans l'icône de roue située dans la boîte de dialogue, réglez la méthode de seuil sur écart type, la limite inférieure sur six, afin de sélectionner les objets rouges présentant les intensités les plus fortes, et la taille minimale des objets sur 0,017 micromètre cube.

Sélectionnez les mesures et créez un élément de mesure afin d'effectuer la mesure à tous les points temporels. Pour analyser l'expression de la GFP mesurée dans les lysosomes, cliquez sur le nom du fichier d'élément de mesure situé sous le nom de l'image. Sélectionnez la population un sous l'onglet brut, puis sélectionnez la population un ainsi que le canal de couleur GFP somme et somme sous l'onglet analyser, en effectuant un clic droit comme précédemment pour mesurer la quantité de GFP dans les vésicules rouges.

Avant la stimulation par le ligand, les récepteurs de l'angiotensine de type 1A marqués par la GFP sont localisés principalement dans la membrane plasmique. Cependant, 2,5 minutes après l'ajout de l'angiotensine deux, ces récepteurs s'internalisent, formant des vésicules brillantes puis s'agrégeant en de grosses vésicules paranucléaires. Les ondulations induites par l'angiotensine deux compliquent la quantification de l'intensité totale de la GFP dans les vésicules, comme observé sur ces données représentatives de mesure de l'expression de la GFP.

Le filtrage par taille ne permet pas de distinguer les grandes proliférations membranaires des vésicules groupées, mais révèle toutefois que la GFP dans les objets plus petits augmente plus tôt que la GFP dans les objets plus grands. Dans ce cours temporel représentatif de l'expression de la GFP sans mise au point automatique, la GFP internalisée a été mesurée en pourcentage de la GFP totale cellulaire. L'analyse de la GFP totale à l'intérieur de la cellule a révélé que cette cellule n'a pas subi de photoblanchiment notable au fil du temps.

La quantification de la GFP dans les lysosomes des cellules transfectées indique également que l'intensité du récepteur de l'angiotensine de type 1A présent dans les lysosomes ne varie pas pendant les 24 minutes suivant l'administration de l'angiotensine deux. Lors de cette procédure, il est important de se souvenir de surveiller l'état des cellules avant et pendant l'acquisition d'images, car la procédure est longue ; l'expérience doit être interrompue si les cultures cellulaires présentent une anomalie quelconque. Après cette procédure, une immunomarquage ainsi que la FRET ou la FLIM peuvent être utilisées pour détecter et confirmer la localisation subcellulaire des récepteurs.

Les immunoblots peuvent être réalisés afin d'identifier les molécules de signalisation et leurs modifications impliquées lors du trafic des récepteurs. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer l'imagerie et l'analyse de cellules vivantes pour mesurer le ciblage des récepteurs transmembranaires induit par un ligand vers les lysosomes ainsi que vers d'autres compartiments subcellulaires.