Targeted Plasma Membrane Livraison d'un Hydrophobe Cargo encapsulé dans un cristal liquide Nanoparticules Transporteur

L'objectif général de cette procédure expérimentale est d'utiliser une nanoparticule à base de cristaux liquides comme plateforme de délivrance pour l'administration contrôlée d'un di-charge hydrophobe à la partie lipophile de la membrane plasmique de cellules de mammifères vivantes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la délivrance de médicaments, telles que la manière d'assurer efficacement le transport et l'absorption cellulaire de charges hydrophobes peu solubles dans l'eau. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet une délivrance plus spécifique de charges hydrophobes ciblant la membrane, directement à la membrane plasmique, tout en réduisant leur cytotoxicité.

Le Dr. Okhil Nag, postdoctorant de mon laboratoire, démontrera la procédure. Commencez cette procédure par la préparation des nanoparticules de cristal liquide DiO, comme décrit dans le protocole écrit. Ensuite, ajoutez 20 microlitres de la solution de travail fraîchement préparée de NHSS/EDC à 1,0 millilitre des nanoparticules de cristal liquide DiO dans un tampon HEPES.

Et agiter pendant cinq minutes. Ensuite, ajouter 20 µL d'une solution mère de cholestérol PEG-amine à ce mélange et agiter pendant deux heures. Après deux heures, centrifuger brièvement le mélange réactionnel à vitesse maximale pendant 30 secondes à l'aide d'une mini-centrifugeuse de table.

Ensuite, faire passer le surnageant à travers une colonne de chromatographie par exclusion stérique PD 10 équilibrée avec du tampon salin phosphate de Dulbecco. Pour confirmer la conjugaison covalente réussie du cholestérol PEG à la surface des nanoparticules en cristaux liquides DiO par électrophorèse sur gel, préparer un gel d'agarose comme décrit dans le protocole textuel. Une fois que le gel est solidifié, ajouter suffisamment de tampon de migration TBE pour immerger complètement le gel dans la chambre.

Ensuite, ajoutez 35 microlitres d'échantillon de nanoparticules cristallines liquides DiO dans les puits du gel et faites migrer pendant 20 minutes à une tension de 110 volts. Imagez le gel à l'aide d'un système d'imagerie de gel équipé d'un filtre d'excitation à 488 nanomètres et de filtres d'émission de 500 à 550 nanomètres. Préparez des boîtes de culture tissulaire de 35 millimètres de diamètre équipées d'inserts en verre de couverture n°1 de 14 millimètres en les recouvrant de fibronectine bovine dans du DPBS pendant deux heures à 37 degrés Celsius.

Après deux heures, retirez la solution d'endoctement de fibronectine de la boîte de culture. Récoltez les cellules HEK 293 T17 à partir du flacon T25 en lavant d'abord la monocouche cellulaire avec trois millilitres de DPBS, puis en ajoutant deux millilitres de trypsine-EDTA. Incubez le flacon à 37 degrés Celsius pendant environ trois minutes.

Une fois les cellules détachées du flacon, neutralisez la trypsine en ajoutant quatre millilitres de milieu complet au flacon. Déterminez la concentration cellulaire dans la suspension en effectuant un décompte à l’aide d’un compteur de cellules. Ajustez ensuite la concentration cellulaire à environ 80 000 cellules par millilitre à l’aide du milieu de croissance.

Ajoutez trois millilitres de la suspension cellulaire dans la boîte et cultivez-la toute la nuit dans l'incubateur. Le jour suivant, les cellules devraient atteindre une confluence d'environ 70 pour cent et être prêtes à l'emploi. Une densité cellulaire adéquate est essentielle pour un marquage robuste et efficace d'un pourcentage élevé de cellules.

Préparez des solutions d'un millilitre de DiO, de nanoparticules de cristal liquide DiO et de nanoparticules de cristal liquide DiO PEG-cholestérol dans le milieu de livraison en diluant les solutions mères correspondantes. Retirez le milieu de croissance des boîtes de culture à l’aide d’une pipette serologique, puis lavez les monocouches cellulaires deux fois avec le DMEM HEPES. Effectuez les lavages en ajoutant délicatement le DMEM HEPES sur le bord des boîtes à l’aide d’une pipette, puis en l’aspirant.

Ajoutez 0,2 millilitre des solutions préparées de DiO libre ou de nanoparticules lipidiques cristallines de DiO au centre des boîtes de culture. Remettez ensuite les boîtes dans l'incubateur pendant une période appropriée. Des temps d'incubation plus longs entraînent un marquage cellulaire non spécifique des zones non membranaires.

Après la période d'incubation, retirez les solutions d'administration à l'aide d'une pipette serologique. Lavez les monocouches cellulaires deux fois avec du DPBS en utilisant deux millilitres pour chaque lavage. Fixez les monocouches cellulaires à l'aide de paraformaldéhyde à quatre pour cent pendant 15 minutes à température ambiante.

Retirer la solution de paraformaldéhyde à l’aide d’une pipette et laver délicatement les cellules une fois avec deux millilitres de DPBS. Les cellules fixées sont désormais prêtes à être observées pour détecter la présence d’un signal fluorescent membranaire, en utilisant une microscopie à balayage laser confocale. Sur une platine de microscope équipée d’une chambre d’incubation chauffée, observer l’échantillon de cellules vivantes à l’aide d’un microscope confocal afin d’évaluer le marquage membranaire.

Si l'imagerie n'est pas effectuée immédiatement, remplacez le milieu par du DPBS contenant 0,05 pour cent d'azoture de sodium et conservez les boîtes à quatre degrés Celsius. Dans cette méthode, les cellules sont doublement marquées avec DiO comme donneur de FRET et DiI comme accepteur de FRET. Marquez les cellules séquentiellement avec le nanoparticule cristal liquide DiO-PEG-cholestérol, puis avec DiI libre comme précédemment.

Après la coloration, laver les cellules une fois avec deux millilitres de DPBS à l’aide d’une pipette serologique et remplacer par deux millilitres de la solution d’imagerie de cellules vivantes. Sur la platine d’un microscope équipée d’une chambre d’incubation chauffée, acquérir l’échantillon de cellules vivantes à l’aide d’un microscope confocal en mode imagerie FRET. Configurer l’expérience avec des intervalles de 30 minutes sur une période de quatre heures en excitant le donneur DiO à 488 nanomètres et en collectant les spectres d’émission complets du donneur DiO et de l’accepteur DiI entre 490 et 700 nanomètres, à l’aide d’un détecteur spectral 32 canaux.

Ensuite, déterminez l'intensité d'émission résolue en temps à la fois du donneur DiO et de l'accepteur DiI à partir de cellules marquées avec des nanoparticules de cristal liquide DiO-PEG-cholestérol et DiI. Enfin, calculez le rapport FRET résolu en temps accepteur-donneur pour les images, comme décrit dans le protocole textuel. Le DiO libre s'accumule de manière non spécifique à l'intérieur des cellules, plutôt que dans les membranes plasmiques des cellules qui ont été contre-marquées avec un phospholipide membranaire marqué au DiL.

Cela peut être visualisé à l'aide des images fusionnées. En revanche, la nanoparticule de cristal liquide DiO conjuguée au cholestérol PEG marque spécifiquement uniquement la membrane plasmique de la cellule, comme le montre la colocalisation avec le phospholipide membranaire marqué au Dil. Le FRET confirme le partitionnement du DiO depuis la nanoparticule de cristal liquide vers la bicouche lipidique membranaire, grâce à l'augmentation observée du transfert d'énergie du donneur DiO vers l'accepteur DiI.

Le transfert d'énergie par résonance de Förster (FRET) entre DiO et DiI, ainsi que les changements d'émission de DiO et de DiI, confirment une augmentation du FRET de DiO vers DiI en fonction du temps. Les nanoparticules de cholestérol PEG de cristal liquide DiO présentent une cytotoxicité minimale avec une viabilité de 90 pour cent, comparée à une toxicité importante du DiO libre à environ 50 pour cent de viabilité. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment synthétiser des nanoparticules de cristal liquide chargées en cargaison, les biofonctionnaliser pour cibler les cellules, et imager les cellules chargées afin de confirmer une délivrance cellulaire réussie.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car la délivrance spécifique de DiO en solution aqueuse vers la membrane plasmique constitue un défi important. Nous avons eu l'idée de cette méthode après avoir utilisé la plateforme de nanoparticules en cristaux liquides pour la délivrance cellulaire du médicament anticancéreux doxorubicine, et observé sa capacité à moduler la cinétique d'absorption cellulaire du médicament. Suite à cette procédure, cette approche peut être mise en œuvre pour la délivrance cellulaire d'une grande variété de cargaisons hydrophobes qui posent un défi particulier en ce qui concerne leur administration aux cellules à partir de milieux aqueux.

Cette approche peut être utilisée pour obtenir une délivrance plus efficace de médicaments ciblant la membrane et de molécules bioactives, comme les colorants sensibles au potentiel utilisés pour l'imagerie cérébrale, ou les médicaments photodynamiques destinés à la thérapie médicamenteuse assistée par photonique.