Name: Un Ex Vivo Méthode pour imagerie time-lapse de Cultured Rat mésentériques microvasculaires Networks (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Découvrez une méthode ex vivo d'imagerie time-lapse des réseaux microvasculaires mésentériques de rat. Cette technique permet d'étudier les interactions des cellules endothéliales et les effets des médicaments anti-angiogéniques.

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Ce travail a été soutenu par la subvention 5-P20GM103629 des National Institutes of Health à WLM et au Tulane Center for Aging. Nous tenons à remercier Matthew Nice pour son aide dans l’édition du texte du protocole.

Toutes les expériences et les procédures animales ont été approuvées par Institutional Care Committee et l&#39;utilisation des animaux de l&#39;Université de Tulane (IACUC). 1. Configuration de la procédure chirurgicale <ol><li> instruments autoclaves, des fournitures chirurgicales et les fournitures de culture avant la chirurgie. fournitures chirurgicales pour chaque rat comprennent: 1 drap, 1 drap avec trou prédécoupé (0,5 po x 1,5 po) dans le centre, des tampons de gaze, et 1 underpad absorbant. Les instruments chirurgicaux comprennent: 1 scalpel avec une lame numéro 10, 2 paires de pinces, et une paire de ciseaux fins. fournitures de culture comprennent: 1 drap, 1 paire de pinces, et préparés à 6 puits inserts de plaque avec des filtres en polycarbonate. </li><li> Stériliser une plate-forme en plexiglas, une étape chirurgicale et un espace de paillasse chirurgical avec 70% d&#39;éthanol. Gardez l&#39;étape chirurgicale dans un bol stérile jusqu&#39;à utilisation. <ol><li> Créer une étape chirurgicale par le forage d&#39;un environ 2 par 1 dans le trou dans le centre d&#39;une boîte de culture de 100 mm. Ensuite, utilisez du papier de verre pour lisserles arêtes coupantes et ajouter une couche de colle silicone sur les bords du trou pour créer une surface surélevée pour les tissus. </li><li> Vous pouvez également concevoir la scène chirurgicale en utilisant un logiciel de CAO et de faire en 3-D impression (Figure 1). </li></ol></li><li> Placer un underpad absorbant stérile et posez une plate-forme de plexiglass sur le dessus de celui-ci. Placez le drap, sans un trou pré-coupé, sur un coussin chauffant à côté de la thibaude absorbant. </li><li> Préchauffer une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS), les médias et une solution saline à 37 ° C. La place des médias et du PBS dans des boîtes de culture séparées au sommet du coussin chauffant et lieu de solution saline dans un tube de 50 ml conique à côté de la configuration chirurgicale. </li><li> Assurez-vous que tous les paquets sont ouverts avant le début de la chirurgie pour assurer une manipulation stérile de tous les matériaux. Une liste complète des outils communs utilisés dans cette procédure sont répertoriés dans la Table des matières et outils chirurgicaux spécifiques. </li></ol> 2. MesenterLa récolte de tissus y <ol><li> Utiliser des rats adultes mâles Wistar (350 ± 25 g; 6 - 8 semaines d&#39;âge). D&#39;autres souches et l&#39;âge des rats peuvent être substitués. </li><li> Anesthésier le rat par une injection intramusculaire de kétamine (80 mg / kg de poids corporel) et de xylazine (8 mg / kg de poids corporel). Vérifiez que le rat est sous anesthésie par pincement entre les orteils pour vérifier une réponse réflexe; il devrait y avoir aucun. analgésie préemptive pour cette procédure terminal est pas nécessaire. </li><li> Rasez la région abdominale et enlever restante cheveux à l&#39;aide de la crème d&#39;épilation. Essuyer la peau abdominale deux fois avec 70% d&#39;alcool isopropylique suivie povidone-iode. Pour les lingettes, le chirurgien doit commencer au centre du site chirurgical et de se déplacer vers l&#39;extérieur de la zone préparée de manière circulaire pour ne pas recouvrir les zones qui ont été préalablement lavés avec le même morceau de gaze stérile ou un tampon de coton stérile. Puis transfert animal à l&#39;installation chirurgicale stérile et placer au sommet de la plate plexiglassforme. </li><li> En utilisant une lame de scalpel, faire un 0,75 - 1,25 en incision dans l&#39;intestin à partir du 1 au-dessous du sternum. Veillez à ne pas percer l&#39;intestin ou mésentère (1 couche de la peau, 1 couche de tissu conjonctif, et 1 couche de muscle). </li><li> Placez un drap avec un trou pré-découpé sur l&#39;incision et placez un stade chirurgical stérile au-dessus du drap. Assurer l&#39;ouverture aligne avec l&#39;incision. Utiliser des applicateurs de coton-tige stérile pour localiser et extraire l&#39;iléon à travers l&#39;ouverture de scène chirurgicale. </li><li> Tirez 6 - 8 fenêtres mésentériques à travers la scène en utilisant des applicateurs de coton-tige, et faire attention à ne pas toucher les fenêtres (Figure 1). Les tissus sont généralement récoltées à partir de la zone de l&#39;iléon de l&#39;intestin grêle, en commençant près du caecum. Gardez les tissus exposés humide avec une solution saline stérile chauffée au besoin à l&#39;aide d&#39;une seringue stérile au goutte à goutte la solution. </li><li> Euthanasier le rat par injection intracardiaque de pentobarbital sodique (0,2 ml par rat). Avant de me retirerfenêtres senteric, assurent le rat est euthanasié en palpant le cœur; il devrait y avoir aucune impulsion. </li><li> Retirer les tissus mésentère souhaités à l&#39;aide des pinces pour saisir le coussinet adipeux et des ciseaux fins pour couper la fenêtre. Laissez une bordure de graisse (2 mm) autour de la fenêtre. Laver les tissus une fois dans réchauffé PBS stérile et une fois dans les médias. </li><li> Retour iléon extériorisé à la cavité abdominale et de disposer des animaux selon les directives institutionnelles. </li></ol> 3. Mesentery Tissue Culture d&#39;études de time-lapse <ol><li> Transfert des fournitures autoclavés de culture (voir section 1.1) et les tissus à une hotte à flux laminaire stérile. </li><li> Utilisez des pinces pour transférer chaque tissu au sommet d&#39;une membrane filtrante de polycarbonate. tissus d&#39;appui par le coussinet adipeux pour éviter d&#39;endommager le système vasculaire. </li><li> répandre rapidement le tissu en utilisant le coussinet adipeux, en faisant attention à ne pas toucher la fenêtre. Inversez l&#39;insert avec le tissu dans le fond d&#39;une plaque à 6 puits et couvrir avec 3 ml de médias (Figure 1 </strong&gt;). média typique utilisé pour cette procédure comprend Essential Media minimum (MEM) avec 1% de pénicilline streptomycine (Penstrep) et 10% de sérum bovin fœtal (FBS). Les médias peuvent être complétés par d&#39;autres sérums et / ou des facteurs de croissance pour stimuler l&#39;angiogenèse. </li><li> Répétez les étapes 3.2 à 3.3 pour chaque tissu et de la culture dans des conditions d&#39;incubation standards (5% de CO 2, 37 ° C) pendant 5 jours. </li></ol> 4. Time-Lapse Imaging de Mesentery Tissue <ol><li> Le jour de l&#39;imagerie, de compléter les supports dans chaque puits avec des conjugués BSI lectine et incuber dans des conditions standard de culture pendant 30 min. Laver les tissus à deux reprises avec des médias libres lectine. BSI-lectine tache restera visible sur le tissu mésentère pour 3 jours de culture. </li><li> Transférer la plaque à un étage de microscope. Identifier les vaisseaux sanguins et lymphatiques en fonction de leur morphologie et la structure de réseau. </li><li> Localiser une région de réseau souhaité sur chaque tissu et prendre des images. Prendre note de l&#39;imagerieemplacement pour assurer la même région sera capturé pour les images suivantes. Si vous utilisez une platine motorisée, documenter les coordonnées. </li><li> tissus Retour à l&#39;incubateur et continuer à la culture jusqu&#39;au point final souhaité. Répétez les étapes 4/1 à 4/3, au besoin en fonction des points souhaités de temps expérimentaux. </li></ol> 5. Tissue immunomarquage <ol><li> BSI-lectine Étiquetage <ol><li> Incuber les tissus pendant 30 min à 37 ° C avec 1:40 lectine conjuguée au FITC dans les médias (solution d&#39;anticorps mL 2,5 par puits dans une plaque de 6 puits) suivie de deux rinçages avec les médias. Pour rinçages, ajouter des médias, puis remplacer immédiatement. </li></ol></li><li> Étiquetage en direct / Dead <ol><li> Incuber les tissus pendant 10 min à 37 ° C avec 1: 500 mM éthidium 2 homodimère-1 et 1: 500 1 mM calcéine AM dans les médias (solution d&#39;anticorps mL 2,5 par puits dans une plaque de 6 puits) suivie de deux rinçages avec les médias. </li></ol></li><li> BSI-lectine / NG2 Étiquetage <ol><li> tissus Spread sur un microscope glissaiente (1 - 2 tissus / slide) et laisser sécher. Retirer l&#39;excès de graisse avec un scalpel en appuyant fermement pour exciser la graisse. </li><li> Fixer les tissus dans le méthanol froid pendant 30 min à -20 ° C. Laver les tissus avec du PBS (3 x 10 mn). </li><li> Pour l&#39;étiquetage des anticorps primaire incuber les tissus pendant 1 h à température ambiante avec 1: 100 lapin anticorps polyclonaux de NG2 et 5% de sérum de chèvre normal (NGS). Laver les tissus avec du PBS (3 x 10 mn). </li><li> Pour l&#39;étiquetage des anticorps secondaire incuber les tissus pendant 1 h à température ambiante avec 1: 100 chèvre anti-lapin CY2 conjugué anticorps (GAR-CY2) et 5% NGS. Laver les tissus avec du PBS (3 x 10 mn). </li><li> Incuber les tissus pendant 30 min à température ambiante avec de la lectine 01:40 conjugué au FITC dans du PBS suivi par deux rinçages avec du PBS. Pour rinçages, ajouter du PBS, puis remplacer immédiatement. </li><li> Pour monter les diapositives, couvrir les tissus avec 50:50 PBS et solution de glycérol et lieu lamelle sur le dessus. Sceller les bords de la lame à l&#39;aide de vernis à ongles. </li></ol></li><li> LYVE-1 / PECAM étiquetage<ol><li> Étaler les tissus sur une lame de microscope (1 - 2 tissus / glissière) et laisser sécher. Retirer l&#39;excès de graisse avec un scalpel en appuyant fermement pour exciser la graisse. </li><li> Fixer les tissus dans le méthanol froid pendant 30 min à -20 ° C. Laver les tissus avec du PBS + 0,1% de saponine (3 x 10 mn). </li><li> Pour le marquage de l&#39;anticorps primaire incuber les tissus pendant 1 h à température ambiante avec 1: anticorps monoclonal biotinylé anticorps CD31 200 de souris et 1: 100 polyclonal de lapin LYVE-1 anticorps dans du PBS + 0,1% de saponine + 2% de sérum albumine bovine (BSA) + 5% de NGS . Laver les tissus avec du PBS + 0,1% de saponine (3 x 10 mn). </li><li> Pour le marquage de l&#39;anticorps secondaire, incuber les tissus pendant 1 h à température ambiante avec 1: 500 d&#39;anticorps streptavidine conjugué à Cy3 et 1: 100 GAR-CY2 dans du PBS + 0,1% de saponine + BSA 2% + 5% de NGS. Laver les tissus avec du PBS + 0,1% de saponine (3 x 10 mn). </li><li> Pour monter des diapositives, des tissus de couverture avec 50:50 PBS et de glycérol solution et placer une lamelle sur le dessus. Sceller les bords de la lame à l&#39;aide de vernis à ongles. </li></ol></li><li> BrdU / BSI-lectine Étiquetage <ol><li> Ajouter 1 mg / mL BrdU aux médias et remplacer le support de tissu avec une solution de BrdU. Incuber pendant 2 h à 37 ° C. </li><li> Étaler les tissus sur une lame de microscope (1 - 2 tissus / glissière) et laisser sécher. Retirer l&#39;excès de graisse avec un scalpel en appuyant fermement pour exciser la graisse. </li><li> Fixer les tissus dans le méthanol froid pendant 30 min à -20 ° C. Laver les tissus avec du PBS (3 x 10 mn). </li><li> Dénaturer l&#39;ADN de tissu dans du HCl 2 M pendant 1 h à 37 ° C. Laver les tissus dans du PBS + 0,1% de saponine (3 x 10 mn). </li><li> Pour le marquage de l&#39;anticorps primaire, l&#39;incubation des tissus pendant 1 h à température ambiante avec 1: 100 monoclonal de souris anti-BrdU dans du PBS + 0,1% de saponine + BSA 2% + 5% de NGS. Laver les tissus avec du PBS + 0,1% de saponine (3 x 10 mn). </li><li> Pour le marquage de l&#39;anticorps secondaire, incuber les tissus pendant 1 h à température ambiante avec 1: 100 d&#39;anticorps de chèvre anti-souris conjugué à Cy3 (GAM-Cy3) dans du PBS + 0,1% de saponine + BSA 2% + 5% de NGS. Laver les tissus avec du PBS + 0,1% de saponine (3 x 10 mn). </li><li&gt; Incuber les tissus pendant 30 min à température ambiante avec 1:40 lectine conjuguée au FITC dans du PBS suivi par deux rinçages avec du PBS. </li><li> Pour monter des diapositives, des tissus de couverture avec 50:50 PBS et solution de glycérol et lieu lamelle sur le dessus. Sceller les bords de la lame à l&#39;aide de vernis à ongles. </li></ol></li><li> BSI-lectine / étiquetage CD11b <ol><li> Étaler les tissus sur une lame de microscope (1 - 2 tissus / glissière) et laisser sécher. Retirer l&#39;excès de graisse avec un scalpel en appuyant fermement pour exciser la graisse. </li><li> Fixer les tissus dans le méthanol froid pendant 30 min à -20 ° C. Laver les tissus avec du PBS + 0,1% de saponine (3 x 10 mn). </li><li> Pour le marquage de l&#39;anticorps primaire incuber les tissus pendant 1 h à température ambiante avec 1: 100 souris anti-CD11b rat dans du PBS + 0,1% de saponine + BSA 2% + 5% de NGS. Laver les tissus avec du PBS + 0,1% de saponine (3 x 10 mn). </li><li> Pour le marquage d&#39;un anticorps secondaire incuber les tissus pendant 1 h à température ambiante avec 1: 100 GAM-Cy3 dans du PBS + 0,1% de saponine + BSA 2% + 5% de NGS. Laver les tissus avec du PBS+ 0,1% saponine (3 x 10 mn). </li><li> Incuber les tissus pendant 30 min à température ambiante avec de la lectine 01:40 conjugué au FITC dans du PBS suivi par deux rinçages avec du PBS. </li><li> Pour monter des diapositives, des tissus de couverture avec 50:50 PBS et solution de glycérol et lieu lamelle sur le dessus. Sceller les bords de la lame à l&#39;aide de vernis à ongles. </li></ol></li></ol>

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Ce protocole documente une méthode pour utiliser le modèle de culture de mésentère de rat comme un ex vivo outil pour imagerie time-lapse de la croissance du réseau microvasculaire. Des travaux antérieurs dans notre laboratoire a établi l&#39;utilisation de notre modèle pour 1) l&#39; angiogenèse 8, 2) lymphangiogenèse 8, 3) les interactions cellulaires péricytes-endothélial 8, et 4) le dépistage des drogues anti-angiogénique <sup class="xr...

La croissance du réseau microvasculaire et le remodelage des dénominateurs communs pour la fonction des tissus, la cicatrisation des plaies, et de multiples pathologies et un processus clé est l&#39; angiogenèse, définie comme la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de ceux qui existent déjà 1, 2. Pour les tissus d&#39;ingénierie de nouveaux navires ou la conception de thérapies angiogéniques, la compréhension de l&#39;importance de la dynamique cellulaires impliqués dans l&#39;angiogenèse est critique. Cependant, ce procédé est complexe. Elle peut varier à des emplacements spécifiques à l&#39; intérieur d&#39; un réseau microvasculaire et implique plusieurs types de cellules ( par exemple les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses, des pericytes, des macrophages, des cellules souches) et plusieurs systèmes (réseaux lymphatiques et des réseaux de neurones). Bien que les modèles in vitro ont contribué énormément à l&#39; examen de la relation entre les différentes cellules impliquées dans l&#39; angiogenèse 3, leur pertinence physiologique peut être compromise en raison de Thei<html> r complexité limitée et le fait qu&#39;ils ne reflètent pas étroitement un scénario in vivo. Pour surmonter ces limitations, les systèmes de culture en trois dimensions 3 modèles de tissus, ex vivo 4, les systèmes microfluidiques 5, 6 et 7 modèles de calcul ont été élaborés et mis en place au cours des dernières années. Cependant, il existe encore un besoin d&#39;un modèle avec une capacité time-lapse pour étudier l&#39; angiogenèse dans les réseaux microvasculaires intacts ex vivo. La mise en place de nouveaux modèles time-lapse pour les études de l&#39;angiogenèse avec ce niveau de complexité fournira un outil précieux pour comprendre les mécanismes sous-jacents qui régissent l&#39;angiogenèse et d&#39;améliorer les thérapies. Un modèle de potentiel qui permet à l&#39;étude ex vivo de l&#39; angiogenèse à travers un réseau microvasculaire intacte est le mésentère modèle de culture de rat&gt; 8. Dans des travaux récents, nous avons démontré que le sang et les réseaux microvasculaires lymphatiques restent viables après culture. Plus important encore, le mésentère modèle de culture de rat peut être utilisé pour étudier les interactions fonctionnelles de péricytes-endothélial cellulaires, le sang et les connexions des cellules endothéliales lymphatiques et imagerie time-lapse. L&#39;objectif de ce document est de fournir notre protocole pour la méthode d&#39;imagerie time-lapse. Nos résultats représentatifs de documenter les multiples types de cellules qui demeurent viables après la stimulation de l&#39;angiogenèse avec du sérum et offrent des exemples d&#39;utilisation de cette méthode pour quantifier les réponses angiogéniques spécifiques de tissus ainsi que des études de suivi des cellules endothéliales.

<table><tbody><tr><td>Drapé</td><td>Cardinal Health</td><td>4012</td><td>12 » x 12 » Bio-Shield Regular Sterilization Wraps Manche de</td></tr><tr><td>scalpel Instrument</td><td>chirurgical Roboz</td><td>RS-9843</td><td>Manche de scalpel, #3 ; Solide; </td></tr><tr><td>Lame chirurgicale stérile</td> de 4 po de longueur <td>Cincinnati Surgical</td><td>0110</td><td>Acier inoxydable ; Taille 10</td></tr><tr><td>Plat de culture (60 mm)</td><td>Thermo Scientific</td><td>130181</td><td>10/Sleeve</td></tr><tr><td>Graefe Forcep (pince à épiler incurvée)</td><td>Instrument chirurgical</td><td>Roboz RS-5135</td><td>Micro Pince de dissection ; Dentelé; légère courbe ; Largeur de pointe de 0,8 mm ; </td></tr><tr><td>Pince Graefe de 4" de longueur (pince à épiler droite)</td><td>Instrument chirurgical Roboz</td><td>RS-5130</td><td>Micro pince de dissection ; Dentelés, droits ; Largeur de pointe de 0,8 mm ; 4" de longueur</td></tr><tr><td>Noyes Micro ciseaux</td><td>Roboz Instrument chirurgical</td><td>RS-5677</td><td>Noyes Micro Dissection Ciseaux à ressort ; pointes droites, acérées et émoussées ; Tranchant de 13 mm ; Largeur de pointe de 0,25 mm, longueur totale de 4 1/2 po</td></tr><tr><td>Coussinets de gaze</td><td>FisherBrand</td><td>13-761-52</td><td>Éponges de gaze de coton non stériles ; 4 po x 4 po Applicateurs à 12 plis</td></tr> à <tr><td>pointe de coton</td><td>FisherBrand</td><td>23-400-124</td><td>6 po de longueur ; Manche en bois ; Plaque à usage unique à</td></tr><tr><td>6 puits</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-49</td><td>Fond plat avec couvercle à faible évaporation ; Polystyrène; </td></tr><tr><td>Seringue stérile apyrogène 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td> Bol stérile à <td>embout Luer-Lok</td></tr><tr><td></td><td>Medical Action Industries Inc.</td><td>01232</td><td>Sachet pelable de 32 oz ; Bleu; </td></tr> inserts de <tr><td>plaque stériles à usage unique à 6 puits (inserts CellCrown)</td>Inserts de plaque à 6 puits <td>SIGMA</td><td>Z681792-3EA</td><td> ; </td></tr><tr><td>membrane filtrante en polycarbonate</td> non stérile <td>SIGMA</td><td>TMTP04700</td><td>filtre à membrane isopore ; Polycarbonate; Hydrophile; 5.0&nbsp ; et micro ; m, 47&nbsp ; mm, White Plain</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</strong</td><td>>Numéro de catalogue</strong</td><td>>Comments/Description</td></tr><tr><td>Beuthanasia</td><td>Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Commandé auprès de MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI # : 011168</td><td>Matière active : Par 100 ml, 390 mg de pentobarbital sodique, 50 mg de phénytoïne sodique&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>Fort Dodge Animal Health (Commandé auprès de MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI # : 000680</td><td>Kateset 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>LLOYD. Inc. (Commandé auprès de MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI # : 000680</td><td>Anased 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Baxter</td><td>2F7122</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11095080</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Saponin&nbsp ;</td><td>SIGMA</td><td>S7900-100G</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropylique</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25372</td><td></td></tr><tr><td>Opéra de povidone et d’iode</td><td></td><td>82-226</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>SIGMA</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>FITC conjugué Lectine</td><td>SIGMA</td><td>L9381-2MG</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NG2 Chondroïtine sulfate Anticorps protéoglycane</td><td>SIGMA</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps PECAM (CD31)</td><td>BD Biosciences</td><td>555026</td><td></td></tr><tr><td>LYVE-1 Anticorps</td><td>AngioBio Co.</td><td>11-034</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps conjugué à Cy2 de chèvre</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-585-144</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps de chèvre anti-souris conjugué à Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-227-003</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps conjugué à la streptavidine</td><td>Cy3 Jackson ImmunoResearch</td><td>016-160-084</td><td></td></tr><tr><td>Kit de viabilité/cytotoxicité vivant/mort</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal&nbsp ;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-2'-Deoxyuridine</td><td>SIGMA</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>Souris monoclonale Anti-Bromodeoxyuridine&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Clone Bu20A</td><td>Dako</td><td>M074401-8</td><td></td></tr><tr><td>souris anti-rat CD11b&nbsp ;</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA275R</td><td></td></tr></tbody></table>

un<em&gt; ex vivo</em&gt; méthode pour imagerie time-lapse de cultured rat mésentériques microvasculaires networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenèse, définie comme la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants, implique des cellules endothéliales, péricytes, les cellules musculaires lisses, les cellules immunitaires, et la coordination avec les vaisseaux lymphatiques et les nerfs. Le multi-cellulaire, les interactions multi-système nécessite l&#39;enquête de l&#39;angiogenèse dans un environnement physiologiquement pertinents. Ainsi, alors que l&#39;utilisation de modèles in vitro de cultures cellulaires ont fourni des indications mécanistes, une critique commune est qu&#39;ils ne récapitulent la complexité associée à un réseau microvasculaire. L&#39;objectif de ce protocole est de démontrer la capacité de faire des comparaisons time-lapse de réseaux microvasculaires intacts avant et après stimulation de l&#39;angiogenèse dans les tissus mésentère de rat en culture. tissus de culture contiennent des réseaux microvasculaires qui maintiennent leur hiérarchie. marquage immunohistochimique confirme la présence de cellules endothéliales, cellules musculaires lisses et les pericytes, les vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques. Dans unddition, marquage de tissus avec une lectine BSI permet de comparer le temps écoulé des régions du réseau local avant et après la stimulation du facteur de croissance ou du sérum, caractérisé par une augmentation de la germination et de la densité capillaire du récipient. En comparaison avec les modèles de culture cellulaire communs, cette méthode fournit un outil pour les études endothéliales de la lignée cellulaire et évaluation du médicament angiogénique spécifique de tissu dans les réseaux microvasculaires physiologiquement pertinents.

Après 3 jours de culture, les tissus ont été marqués avec un kit mort en direct / viabilité / cytotoxicité pour démontrer la viabilité de la microvascularisation dans le modèle de culture mésentère de rat (figure 2A). La majorité des cellules présentes dans le mésentère est restée viable dans la culture où les cellules endothéliales ont été identifiées en fonction de leur emplacement dans les segments microvasculaires. La prolifération des cellules endothéliales a égalem...

L’angiogenèse implique des interactions multicellulaires et multisystémiques qui doivent être étudiées dans un environnement physiologiquement pertinent. L’objectif de cette étude est de démontrer la capacité du modèle de culture de mésentère de rat à faire des comparaisons en time-lapse de réseaux microvasculaires intacts au cours de l’angiogenèse.

Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Méthode pour imagerie time-lapse de Cultured Rat mésentériques microvasculaires Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

L'objectif général de cette expérience est de démontrer l'utilisation du modèle de culture de mésentère de rat pour l'analyse en temps réel du remodelage ex vivo du réseau microvasculaire, afin d'évaluer les interactions entre parasites et cellules endothéliales, les connexions entre cellules endothéliales sanguines et lymphatiques, ou encore les effets de médicaments anti-angiogéniques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du remodelage microvasculaire, notamment : comment les microvaisseaux savent-ils où pousser, et quelle est la destinée des segments cellulaires endothéliaux ? Le principal avantage de cette technique est qu'il est possible d'observer des réseaux microvasculaires réels et intacts avant et après leur croissance ex vivo.La procédure sera démontrée par Sadegh Azimi, étudiant diplômé de notre laboratoire, qui a mis au point la méthode. Commencez par placer une plateforme en plexiglas stérilisée à l'éthanol sur un tapis absorbant stérile, puis posez un rat mâle adulte anesthésié sur la plateforme. Désinfectez la région abdominale rasée du rat à l’aide de deux lingettes contenant de l’alcool isopropylique à 70 %, suivies de la povidone-iodée.À partir d'un pouce sous le sternum, utilisez un scalpel pour pratiquer une incision d'environ trois quarts à un pouce et un quart dans l'abdomen, à travers la peau, les tissus conjonctifs et les muscles. Ensuite, placez un champ opératoire percé d'un trou prédécoupé au-dessus de l'animal, puis positionnez un support chirurgical par-dessus le champ, en veillant à aligner les ouvertures des deux éléments avec l'incision. À l'aide de brochettes stériles en coton, faites passer l'iléon à travers l'ouverture du support chirurgical, accompagné de six à huit fenêtres mésentériques.Utilisez une seringue stérile pour déposer, au besoin, de la solution saline stérile à 37 degrés Celsius sur les tissus exposés. Lorsque toutes les fenêtres ont été externalisées, utilisez une pince pour saisir une couche adipeuse et des ciseaux pour prélever les fenêtres, en laissant une marge adipeuse de deux millimètres autour de chaque tissu mésentérique. Veillez à ce que la pince n'entre pas en contact avec les fenêtres mésentériques en ne touchant que les marges adipeuses environnantes.Lavez chaque fenêtre une fois dans du PBS à 37 degrés Celsius et une fois dans du milieu à 37 degrés Celsius au fur et à mesure de leur collecte. Remettez l'iléon dans la cavité abdominale une fois que toutes les fenêtres ont été isolées. Dans une hotte à flux laminaire stérile, utilisez une pince pour transférer chaque tissu mésentérique par la bordure grasse sur la membrane en polycarbonate d'un insert pour plaque de culture cellulaire.Utilisez le tampon gras pour étaler rapidement les échantillons de tissu, en prenant soin de ne pas toucher les fenêtres. Ensuite, retournez l'insert et placez-le dans un puits d'une plaque à six puits afin que le tissu repose à plat sur le fond du puits. Recouvrez le tissu de trois millimètres de milieu, puis transférez les fenêtres restantes dans la plaque de la même manière.Ensuite, cultiver les fenêtres du mésentère dans des conditions standard d’incubateur de culture tissulaire pendant un maximum de cinq jours. Le jour de l’imagerie, compléter les cultures avec la lectine BSI conjuguée et replacer la plaque dans l’incubateur. Après 30 minutes, laver les échantillons deux fois avec un milieu exempt de lectine et transférer la plaque sur la platine d’un microscope fluorescent.Identifier les vaisseaux sanguins et lymphatiques en fonction de leur morphologie et de leur structure en réseau. Ensuite, localiser une région d'intérêt du réseau sur chaque tissu afin d'obtenir des images, en notant bien l'emplacement pour s'assurer que la même région est capturée dans les images suivantes. Une fois toutes les images obtenues, remettre les échantillons dans l'incubateur jusqu'à la prochaine séance d'imagerie ou jusqu'au point final expérimental approprié.Après trois jours en culture, la majorité des cellules présentes dans le méso sont viables, la présence des cellules endothéliales étant confirmée par leur localisation dans les segments microvasculaires. La prolifération des cellules endothéliales peut également être confirmée par marquage avec la lectine/BrdU, tandis que la présence des cellules musculaires lisses et des parasites le long des vaisseaux peut être confirmée par marquage NG2. Le marquage du réseau microvasculaire lymphatique et sanguin ramifié confirme davantage le maintien du phénotype des cellules lymphatiques dans le tissu cultivé.La supplémentation du milieu de culture tissulaire de la fenêtre mésentérique avec 10 % de sérum pendant trois jours induit une réponse angiogénique marquée, avec des segments vasculaires nouveaux et des bourgeonnements capillaires identifiés après cinq jours de stimulation. L'imagerie en accéléré permet de quantifier le nombre de vaisseaux par zone vasculaire et le nombre de bourgeonnements capillaires par zone vasculaire à partir d'une seule image à 4 x par tissu. Des comparaisons en accéléré de régions du réseau permettent également le suivi des segments de cellules endothéliales et l'identification de mauvais assemblages des vaisseaux sanguins et lymphatiques.En outre, l'étiquetage par la lectine et par Cd11b confirme également la présence de macrophages résidents interstitiels dans les réseaux en cours de remodelage. Une fois maîtrisée, cette technique devrait pouvoir être réalisée en moins de quatre heures. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de prélever, de cultiver et d'acquérir des images en lapse de temps de tissus mésentériques de rat.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Adulte normale vascularisé tissus de mammifères qui manque de l'angiogenèse physiologique et qui n'a pas été exposé à une intervention chirurgicale est utilisée pour étudier: (i) l'initiation et le développement de l'angiogenèse après administration intrapéritonéale d'agents de test, et (ii) la modification de l'angiogenèse après l'administration systémique de certains agents de test.

Assay Rat angiogenèse Mésentère

Cet article décrit un modèle simple pour stimuler l'angiogenèse dans le mésentère de rat. Le modèle produit des augmentations spectaculaires de la germination capillaire, la zone vasculaire et la densité vasculaire au cours d'une évolution dans le temps relativement court dans un tissu qui permet la visualisation en face de l'ensemble des réseaux microvasculaires vers le niveau de la cellule unique.

Extériorisation Mésentère Rat: Un modèle pour étudier la dynamique cellulaires impliqués dans l&#39;angiogenèse

Voici une nouvelle région d'intérêt protocole d'analyse basée sur le tri des ellipses meilleur ajustement attribués aux régions de signal positif dans le temps à deux dimensions image laps séquences est démontrée. Cet algorithme peut permettre aux enquêteurs d'analyser de manière approfondie les signaux physiologiques + Ca 2 avec entrée minimale de l'utilisateur et de partialité.

Analyse automatisée de dynamique Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signaux de séquences d&#39;images

La fonction des cellules vasculaires dépend de l’activité des messagers intracellulaires.  Il s’agit d’une méthode d’imagerie ex vivo à deux photons qui permet de mesurer les niveaux intracellulaires de calcium et d’oxyde nitrique en réponse à des stimuli physiologiques et pharmacologiques dans les cellules endothéliales et musculaires lisses individuelles d’une aorte isolée.

Deux photons imagerie intracellulaire de Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Manipulation et production d&#39;oxyde nitrique endothélial et en cellules de muscle lisse d&#39;un Rat aorte isolée

La technique Landis modifiée permet de mesurer par appariement la conductivité hydraulique de microvaisseaux individuels dans le mésentère de rats normaux et génétiquement modifiés dans des conditions de contrôle et d’essai à l’aide de techniques de microperfusion. Il s’agit d’une méthode pratique pour évaluer les mécanismes qui régulent la perméabilité des microvaisseaux et les échanges transvasculaires dans des conditions physiologiques.

Microperfusion Technique chargé d&#39;enquêter sur le règlement des microvaisseaux perméabilité au Rat Mesentery

Nous détaillons un protocole pour surveiller le comportement des neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentériques à l’état d’équilibre et dans des conditions inflammatoires en utilisant la microscopie confocale intravitale sur des souris anesthésiées.

Imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par Microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel

Cellules endothéliales primaires de la veine ombilicale humaine (HUVECs) ont été cultivées jusqu’à la confluence au sein d’un dispositif de réseau microfluidique. La jonction cellulaire endothéliale et les distributions de l’actine F ont été illustrées et les changements dans la concentration intracellulaire de calcium et la production d’oxyde nitrique en réponse à l’adénosine triphosphate (ATP) ont été quantifiés en temps réel au niveau cellulaire individuel.

Développement et caractérisation de<em&gt; In vitro</em&gt; Microvaisseaux réseau et des mesures quantitatives de l&#39;endothélium [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Et production d&#39;oxyde nitrique

Ce manuscrit décrit les protocoles de microscopie vidéo in vitro pour l’évaluation de la fonction vasculaire dans les artères de résistance cérébral de rat. Le manuscrit décrit également les techniques pour l’évaluation des microvaisseaux densité avec la perfusion lectine et tissu fluorescent étiquetée à l’aide de débitmétrie Doppler Laser.

Évaluation des mécanismes de contrôle vasculaire utilisant la microscopie vidéo des artères de résistance isolée de Rats

Ce protocole décrit une méthode permettant de mesurer simultanément le calcium cytosolique, libre [Ca2+]i et le diamètre des vaisseaux dans les vaisseaux lymphatiques en contraction en temps réel, puis de calculer les concentrations absolues de Ca2+ ainsi que les paramètres de contractilité/rythmicité. Ce protocole peut être utilisé pour étudier le Ca2+ et la dynamique contractile dans diverses conditions expérimentales.

Évaluation en temps réel du Ca2+ absolu, cytosolique, libre et de la contractilité correspondante dans les vaisseaux lymphatiques isolés et pressurisés

Ce protocole présente une méthode pour induire une lésion d’ischémie-reperfusion mésentérique et visualiser les pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) dans les veinules mésentériques à l’aide de la microscopie intravitale. Le flux sanguin dans l’artère mésentérique supérieure a été limité pendant 1 h, suivi d’une reperfusion, permettant une quantification directe de l’adhésion leucocytaire et de la NETose.

Visualisation de pièges extracellulaires de neutrophiles dans les veinules mésentériques après une lésion d’ischémie-reperfusion mésentérique par microscopie intravitale

Ce protocole introduit une méthode rapide pour l’imagerie vasculaire tridimensionnelle quantitative à montage entier à l’aide de la microscopie à fluorescence à feuillet de lumière. L’efficacité de la méthode est démontrée à l’aide du système d’artère de l’arc pharyngé du modèle d’embryon de poulet, avec des forces hémodynamiques quantifiées par la dynamique des fluides numérique.

Imagerie rapide à haute résolution de l’ensemble du système vasculaire de petits animaux pour des études quantitatives

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