Name: Mapping QTL et édition CRISPR / Cas9 pour identifier un gène de résistance aux médicaments Toxoplasma gondii (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Découvrez le mapping QTL et l'édition CRISPR/Cas9 pour identifier le gène SNR1 de résistance à la sinéfungine chez Toxoplasma gondii. Cette méthode combine séquençage génomique et manipulation génétique.

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Nous tenons à remercier L. David Sibley et Asis Khan pour leur contribution à la publication originale sur laquelle ces protocoles sont basés. Ce travail a été financé par la subvention AL108721 des instituts nationaux de la santé.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Ces protocoles présentent plusieurs méthodes qui, lorsqu&#39;elles sont combinées, permettent d&#39;identifier un gène de résistance aux médicaments chez T. gondii . Deux en particulier étaient une partie intégrante du projet, la méthode relativement saisonnée de la cartographie QTL et la méthode récemment développée de l&#39;édition de gènes CRISPR / Cas9. Lander et Botstein ont publié leur document influent en 1989 démontrant la cartographie QTL qui corrèle les loci génétiques avec les phénotypes 36 . Plus récemment en 2012, Dounda et Charpentier ont décrit le système d&#39;édition CRISPR / Cas9 dans Streptococcus pyogenes 22 qui a été rapidement adapté comme outil génétique dans de nombreux modèles différents, y compris T. gondii 13 , 17 . Les deux méthodes étaient utiles ici, où la cartographie QTL définissait le locus contenant la mutation de la résistance aux médicaments qui a finalement été identifiée à l&#39;aide de la détection SNP basée sur WGS, et l&#39;édition CRISPR / Cas9 m&#39;a fourni<html> Et confirmer que SNR1 est le gène de résistance aux médicaments de sinefungine. Le ME49-FUDR r X VAND-SNF r cross 8 a d&#39;abord été développé pour interroger un phénotype de virulence 19 , mais les souches parentales ont également une différence phénotypique supplémentaire pour laquelle le gène causal n&#39;était pas connu, la résistance au sinefungine chez le parent VAND. Cela met en évidence un avantage des croisements dans la mesure où ils peuvent être réorientés lorsque des différences phénotypiques supplémentaires chez les parents sont observées. C&#39;est le cas pour une autre Toxoplasma cross, type 2 x type 3, où plusieurs gènes impliqués dans la virulence ont été trouvés en cartographiant de multiples phénotypes 37 , 38 , 39 , 40 . À ce jour, quatre croisements différents de T. gondii ont été décrits et utilisés pour cartographier les gènes responsables des phénotypesSs = &quot;xref&quot;&gt; 8 , 37 , 41 , 42 , tous pouvant être réutilisés pour cartographier de nouveaux phénotypes pour lesquels la base génétique est inconnue. Dans ce sens, les génomes pour 62 souches de T. gondii représentant la diversité génétique mondiale connue ont été séquencés 43 . On pourrait créer de nouveaux croisements à partir de ce bassin pour les souches qui diffèrent selon les phénotypes intéressants. Après avoir exhorté les avantages de la cartographie QTL, il faut dire que générer une croix n&#39;est pas une entreprise mineure. D&#39;autres méthodes peuvent être utilisées pour identifier les gènes causaux. Une technique puissante utilise la mutagenèse chimique pour créer des mutants qui peuvent être criblés pour les phénotypes. Pour trouver le gène causal, les mutants peuvent soit être complétés avec des bibliothèques cosmiques 44, soit des méthodes de reséquencement du génome peuvent être utilisées pour trouver la mutation causale 45 . Pour le moisRe sur ceci, voir deux articles JoVE de Coleman et al. Et Walwyn et al. Qui décrivent ces approches 46 , 47 . Beaucoup des étapes menant à l&#39;identification de la mutation SNF causale (Protocoles 2 et 3) reposent sur des méthodes de calcul réalisées avec des logiciels disponibles gratuitement pour un usage académique. Des commandes détaillées pour chaque étape sont fournies et, lorsqu&#39;elles sont exécutées avec les fichiers appropriés, permettront à l&#39;utilisateur de recréer les jeux de données nécessaires pour trouver SNF causal SNP. Gardez à l&#39;esprit qu&#39;une partie de la syntaxe des commandes fait référence aux noms de fichiers ou à la structure du répertoire ($ PATH) qui peuvent être modifiés selon la préférence de l&#39;utilisateur. Bien que les commandes données ici n&#39;exécutent certainement pas les moyens d&#39;analyser une croix avec l&#39;analyse QTL et l&#39;identification SNP basée sur WGS, elles sont suffisamment complètes pour répéter l&#39;expérience décrite dans cet article et devraient permettre à l&#39;utilisateur de devenir m<html> Il est familier avec la façon dont ces approches sont utilisées de façon étape par étape. Bien que la cartographie QTL et la détection SNP basée sur la séquence WGS soient suffisantes pour identifier un gène candidat SNF r , des expériences supplémentaires sont nécessaires pour confirmer son rôle dans la résistance aux médicaments. Cela peut être démontré de manière convaincante par des techniques de perturbation des gènes ou de knock-out, qui peuvent être réalisées à l&#39;aide de l&#39;édition de gènes CRISPR / Cas9. Des méthodes détaillées pour utiliser CRISPR / Cas9 pour générer des mutations indel ou insérer des constructions transgéniques dans un gène cible dans T. gondii sont données. La spécificité de ciblage que CRISPR / Cas9 fournit augmente l&#39;efficacité de l&#39;édition de gènes par rapport aux méthodes traditionnelles. En outre, cela a augmenté efficacement, a permis d&#39;utiliser des souches non adaptées au laboratoire pour des études génétiques qui étaient auparavant difficiles à modifier 13 . Bien que dans son enfance, CRISPR / Cas9 ait déjà été utilisé pour provoquer des perturbations génétiquesLass = &quot;xref&quot;&gt; 2 , 13 , 17 , 18 , 48 , 49 , marquez les gènes 17 , et créez les gènes nœuds 16 , 19 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 dans T. gondii , promettant d&#39;être un outil utile Pour de nombreuses autres études à l&#39;avenir. La découverte que l&#39;inactivation de SNR1 entraîne une résistance au sinefungine rend le locus SNR1 un site prometteur pour l&#39;insertion de transgène ou la complémentation génétique. Pour maximiser le succès de l&#39;utilisation du ciblage génétique médié par CRISPR / Cas9 pour diriger l&#39;intégration du transgène dans le locus SNR1 , les aspects suivants devraient être considérésRouge lors de la conception expérimentale. Tout d&#39;abord, un marqueur de sélection est recommandé d&#39;être inclus dans la construction transgénique pour augmenter l&#39;efficacité de la construction des contraintes. Si un marqueur de sélection est inclus, on peut utiliser une sélection positive et négative, ce qui donne à 100% des parasites doublement sélectionnés transgéniques avec le GOI intégré au locus SNR1 . En revanche, si la construction transgénique ne contient pas d&#39;autres traits sélectionnables et repose sur une sélection négative au niveau du locus SNR1 , l&#39;efficacité de la transgénèse réussie dépend en grande partie de l&#39;efficacité de la co - transfection du plasmide CRISPR et de la construction transgénique. Deuxièmement, bien que l&#39;intégration spécifique au site médiée par CRISPR / Cas9 d&#39;un fragment d&#39;ADN non homologue soit fréquemment utilisée pour la complémentation et la transgenèse, il convient de noter que l&#39;orientation de l&#39;insertion ne peut être garantie dans les cas où l&#39;une ou l&#39;autre direction est possible. Cela peut poser problèmeMs à certaines applications. Par exemple, pour compléter un mutant avec des allèles de gènes différents, il est difficile de s&#39;assurer que tous les allèles sont insérés dans la même orientation et que les divergences d&#39;orientation peuvent entraîner des différences d&#39;expression. Pour ce type d&#39;application, des constructions d&#39;ADN avec des séquences homologues au locus SNR1 sont recommandées, ce qui entraînera une orientation d&#39;intégration appropriée ( Figure 6 ). Troisièmement, pendant la transfection, le rapport entre le plasmide CRISPR et la molécule d&#39;ADN transgénique est essentiel pour la construction de contraintes transgéniques réussies. Ce ratio doit être ajusté en fonction des stratégies de sélection. Les recommandations suivantes sont recommandées: 1) Si la construction transgénique contient un marqueur résistant aux médicaments et que le médicament correspondant est la seule sélection utilisée pour générer des parasites transgéniques, c&#39;est-à - dire que la sinefungine n&#39;est pas utilisée, le rapport molaire suggéré entre la construction transgénique et le plasmide CRISPRId est 1: 5. L&#39;utilisation de plus de plasmide CRISPR dans ce cas augmente la probabilité que les parasites recevant la construction transgénique recevront également le plasmide CRISPR, donc les parasites résistant aux médicaments sont plus susceptibles d&#39;avoir le marqueur inséré au site de ciblage CRISPR. Si le rapport est inversé, la plupart des parasites qui reçoivent la construction transgénique n&#39;obtiendront pas le plasmide CRISPR. En conséquence, la grande majorité des parasites résistants aux médicaments obtiennent la construction transgénique par intégration aléatoire non associée à une insertion spécifique au site médiée par CRISPR / CAS9. 2) Si la construction transgénique contient un marqueur résistant aux médicaments et que le médicament correspondant est utilisé avec la sinefungine pour sélectionner des parasites transgéniques, le rapport molaire suggéré entre la construction transgénique et le plasmide CRISPR est de 1: 1. Cette stratégie offre la plus grande efficacité de la construction des contraintes transgéniques. 3) Si la construction transgénique ne contient pas de fabricant sélectionnable, en s&#39;appuyant sur une sélection négativePar la sinefungin seule pour obtenir des parasites transgéniques, le rapport molaire suggéré entre la construction transgénique et le plasmide CRISPR est de 5: 1. La raison d&#39;être de cette conception est la même que dans la première ligne directrice ci-dessus. Puisque la pyriméthamine et la sinefungine ont été utilisées pour la sélection dans le Protocole 5, le rapport entre le mini gène DHFR * et le plasmide CRISPR ciblant SNR1 a été fixé à 1: 1. Ensemble, les méthodes décrites ici ont un niveau de détail qui n&#39;a pas été possible de transmettre dans la publication originale qui a identifié SNR1 2 . Ces protocoles; En particulier, la syntaxe de la ligne de commande, la mise en page séquentielle des programmes utilisés et l&#39;utilisation de CRISPR / Cas9 devraient aider les efforts futurs pour identifier les nouveaux gènes responsables des phénotypes.

La gamme hôte détermine l&#39;étendue de la prévalence d&#39;un parasite. Certains parasites ont des exigences d&#39;hôte très spécifiques qui limitent la zone à partir de laquelle ils se trouvent, d&#39;autres sont des généralistes. Un tel généraliste est Toxoplasma gondii ( T. gondii) . Ce parasite se trouve dans le monde entier car il peut infecter tous les mammifères et beaucoup d&#39;oiseaux. Les humains sont également sensibles et on estime qu&#39;environ 1/3 de la population mondiale a été infectée. Heureusement, une réponse immunitaire robuste contrôle normalement la croissance du parasite, mais dans les situations où le système immunitaire est compromis, le parasite peut se détériorer et causer des maladies souvent encéphaliques. En outre, ce parasite peut causer des maladies congénitales si les femmes précédemment non infectées sont infectées pendant la grossesse car elles manquent de mémoire immunitaire pour limiter rapidement la propagation du parasite. En outre, il existe un fardeau de toxoplasmose oculaire qui peut entraîner une perte de vision 1 . Pour ces reasoNs T. gondii est devenu un centre d&#39;étude, et en raison des nombreuses méthodes moléculaires développées pour son étude, un modèle pour les parasites Apicomplexan. Deux méthodes qui seront discutées ici sont le cartographage quantitatif de Locus de traçabilité (QTL) et l&#39;édition de gènes Palindromic court (CRISPR) / Cas9 régulière à l&#39;intersection clusterisée. La cartographie QTL et l&#39;édition CRISPR / Cas9 sont, respectivement, des approches génétiques avancées et inversées qui ont été utilisées dans des études antérieures pour identifier et / ou caractériser les gènes de virulence de T. gondii . Ici, ces méthodes sont combinées pour identifier et confirmer la fonction d&#39;un gène de résistance à la sinefungine (SNF r ), TgME49_290860 et ses orthologues (annoté comme SNR1 ) 2 . Bien que T. gondii puisse infecter une grande variété d&#39;hôtes intermédiaires, il doit traverser et infecter les cellules épithéliales intestinales d&#39;un felid pour compléter le cycle de vie. Les chats sont les hôtes définitifs du parasite où le sDes étapes exotiques sont produites et une recombinaison génétique par méiose se produit. Pour mener une étude QTL, il faut créer une croix génétique, et dans le cas de Toxoplasma, cela signifie passer deux souches de parasites différentes qui diffèrent selon un trait phénotypique, les taches parentales, à travers un chat pour produire une descendance recombinante 3 . Avant d&#39;être administrés aux chats, les souches parentales sont résistantes aux médicaments séparés pour permettre une identification plus efficace des recombinants par double choix de médicaments de la progéniture 4 . Trois médicaments ont été utilisés à T. gondii à cette fin; Fluorodéoxyribose (FUDR) pour lequel l&#39;uracile phosphoribosyl transférase ( UPRT ) est le gène de résistance 5 , l&#39;arabinoside d&#39;adénosine (ARA) pour lequel l&#39;adénosine kinase ( AK ) est le gène de résistance 6 et la sinefungine (SNF) pour laquelle le gène de résistance était inconnu 7 . Plusieurs croisements génétiques ont étéCréé pour T. gondii , mais seulement la descendance 24 de la croix ME49-FUDR r X VAND-SNF r ont été gènes en utilisant le séquençage du génome complet (WGS) 8 . Cela a ouvert la possibilité de cartographier et d&#39;identifier le gène de résistance SNF en utilisant cette croix car le parent VAND a été rendu résistant à la sinefungine par mutagenèse chimique de la souche VAND (VAND-SNF s ) sensible au médicament et le génome de référence VAND a été séquencé en utilisant le VAND- La souche de SNF permettant ainsi l&#39;identification de tous les polymorphismes entre la progéniture WGS et le génome de référence de VAND-SNF, y compris la mutation VAND-SNF r parentale héréditaire qui a rendu une partie de la progéniture résistante à la sinefungine. Afin d&#39;identifier le polynucléaire causal de nucléotide unique (SNP) dans la descendance SNF r , plusieurs ressources open source à base de calcul peuvent être utilisées pour analyser les données. Pour créer la carte génétique pour le ME49-FUDR r X VAND-SNF r travers la suite de logiciel REDHORSE 9 a été développé qui utilise les alignements WGS des parents et des descendants pour détecter avec précision les positions génomiques des croisements génétiques. Cette information de cartographie peut ensuite être combinée avec les données phénotypiques (SNF r dans la progéniture) pour formater un ensemble de données compatible avec le paquet &#39;qtl&#39; 10 dans le logiciel de programmation statistique R où un balayage QTL peut être exécuté pour révéler des loci significatifs corrélés avec Phénotype. Pour identifier le SNP causal situé dans le locus QTL, les lectures WGS de la progéniture peuvent être alignées individuellement avec le génome VAND sensible à la sinefungine en utilisant le programme d&#39;alignement Bowtie 2 11 dont les SNP peuvent être appelés en utilisant le programme d&#39;appelant variant VarScan mpileup2snp 12 . En utilisant ces SNP, le locus QTL peut ensuite être analysé pour les polymorphismes présents dans le SNF r mais pasDans la descendance SNF s . Avec le SNP causal identifié dans la région codante d&#39;un gène, la modification génétique du gène candidat SNF r peut être effectuée dans une souche SNF pour vérifier la fonction de résistance aux médicaments. Le système de modification du génome CRISPR / Cas9 a récemment été créé dans Toxoplasma 13 , qui a ajouté d&#39;importants outils pour l&#39;exploration de la biologie complexe de ce parasite, en particulier pour les études génétiques dans des souches non adaptées au laboratoire. En raison de l&#39;activité hautement active de liaison non homologue (NHEJ) dans les cellules WT Toxoplasma , la modification ciblée du génome est difficile à réaliser car l&#39;ADN introduit de manière exogène est intégré de manière aléatoire au génome à une fréquence extrêmement élevée 14 . Pour augmenter le taux de réussite de la modification spécifique du locus, différentes approches ont été utilisées pour augmenter l&#39;efficacité de la recombinaison homologue et / ou diminuerE activité NHEJ 15 , 16 . L&#39;une de ces approches est le système CRISPR / Cas9. Par rapport à d&#39;autres méthodes, le système CRISPR / Cas9 est efficace pour introduire des modifications spécifiques au site et est facile à concevoir 13 , 17 , 18 . En outre, il peut être utilisé dans n&#39;importe quelle souche Toxoplasma sans modification supplémentaire du parasite 13 , 19 . Le système CRISPR / Cas9 provient du système immunitaire adaptatif de Streptococcus pyogenes qui l&#39;utilise pour défendre l&#39;invasion d&#39;éléments génétiques mobiles tels que les phages 20 , 21 , 22 . Ce système utilise l&#39;enzyme d&#39;endonucléase d&#39;ADN guidée par l&#39;ARN Cas9 pour introduire une rupture d&#39;ADN à double brin (DSB) dans la cible, qui est par la suite réparéeEmmenés soit par le NHEJ propice aux erreurs pour inactiver les gènes cibles à travers de courtes mutations d&#39;indel, soit par recombinaison dirigée par homologie pour modifier le locus cible exactement comme conçu 23 , 24 . La spécificité cible est déterminée par une petite molécule d&#39;ARN appelée RNA à guide unique (gRNA), qui contient une séquence de 20 nt conçue individuellement qui a 100% d&#39;homologie avec l&#39;ADN cible 22 . La molécule de gRNA contient également des signatures reconnues par Cas9 qui guident la nuclease vers le site cible, qui comprend un Motif adjacent Protospacer Adjacent (PAM, séquence &#39;NGG&#39;) 25 , 26 . Par conséquent, la molécule d&#39;ARNp et la séquence PAM fonctionnent ensemble pour déterminer le site de clivage Cas9 dans le génome. On peut facilement changer la séquence de gRNA pour cibler différents sites pour le clivage. Lorsque le système CRISPR / Cas9 a d&#39;abord été développé dans ToxopLasma, un plasmide unique exprimant la nucléase Cas9 et la molécule d&#39;ARNp a été utilisé pour introduire DSB au site de ciblage 13 , 17 . Il a été démontré que le système CRISPR / Cas9 augmente considérablement l&#39;efficacité de la modification du génome spécifique au site, non seulement par recombinaison homologue, mais aussi par intégration non homologue de l&#39;ADN exogène 13 . Il le fait dans des souches de type sauvage qui contiennent de l&#39;activité NHEJ. Par conséquent, ce système peut être utilisé dans essentiellement n&#39;importe quelle souche Toxoplasma pour l&#39;édition efficace du génome. Dans une expérience typique, le plasmide CRISPR cible spécifique et le fragment d&#39;ADN utilisé pour modifier la cible sont co-transfectés en parasites. Si le fragment d&#39;ADN utilisé pour modifier la cible contient des séquences homologues sur le locus cible, une recombinaison homologue peut être utilisée pour réparer le DSB introduit par CRISPR / Cas9 pour permettre une modification précise de la cible. D&#39;autre part, si l&#39;intLe fragment d&#39;ADN irradié ne contient pas de séquence homologue, il peut encore être intégré dans le site de ciblage CRISPR / Cas9. Ce dernier est souvent utilisé pour perturber les gènes par l&#39;insertion de marqueurs sélectionnables ou pour compléter les mutants chez les loci qui permettent une sélection négative 13 . Ici, le locus SNR1 sert d&#39;exemple pour montrer comment CRISPR / Cas9 peut être utilisé pour la perturbation des gènes et la génération de parasites transgéniques.

<table><tbody><tr><td>Fioles T25</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastes du prépuce humain (HFF)</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1041</td><td></td></tr><tr><td>T. gondii ME49 souche</td><td>ATCC</td><td>50840</td><td></td></tr><tr><td>T. gondiiVAND souche</td><td>ATCC</td><td>PRA-344</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (sans bicarbonate de sodium)</td><td>Sciences de la vie</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate</td><td>de sodium Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS) Premium Grade</td><td>VWR International</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&nbsp ; 200 mM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine (10 mg/mL)</td><td>Life Technologies&nbsp ;</td><td></td><td>Racleur à</td></tr><tr><td>cellules 15710064 pour flacons</td><td>VWR International</td><td>10062-904</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 10 mL</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles émoussées 22 G x 1"</td><td>BRICO Products</td><td>BN2210</td><td></td></tr><tr><td>Filtre Nuclépore 3.0 &micro ; m, 25 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>110612</td><td></td></tr><tr><td>Swin-Lok Porte-filtre 25 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>420200</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Propper MFG</td><td>90001</td><td></td></tr><tr><td>Sinefungin</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>380-070-M001</td><td></td></tr><tr><td>R&nbsp ;</td><td>The R Foundation</td><td>https://www.r-project.org/</td><td></td></tr> <tr><td>J/qtl</td><td>The Churchill Group</td><td>http://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml</td><td></td></tr><tr><td>Bowtie2</td><td>Université John Hopkins</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td><td></td></tr><tr><td>NCBI SRA Toolkit</td><td>NCBI</td><td>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?view=toolkit_doc</td><td></td></tr><tr><td>SAMtools</td><td>Wellcome Trust Sanger Institute</td><td>http://www.htslib.org/</td><td></td></tr> <tr><td>VarScan</td><td>Washington University, St Louis</td><td>http://varscan.sourceforge.net/</td><td></td></tr> <tr><td>MUMmer</td><td>JCVI & Univ Hamburg</td><td>http://mummer.sourceforge.net/</td><td></td></tr> <tr><td>pSAG1 ::CAS9-U6 ::sgUPRT</td><td></td><td>Addgene Plasmid #54467</td><td>T. gondii Plasmide CRISPR pour couper le gène UPRT</td></tr><tr><td>pSAG1 ::CAS9-U6 ::sg290860-6</td><td>Addgene</td><td>Plasmide #59855</td><td>T. gondii plasmide CRISPR pour couper le gène TG*_290860 SNR1</td></tr><tr><td>pUPRT ::D HFR-D</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #58528</td><td>Modèle pour DHFR* mini gène</td></tr><tr><td>Q5 Kit de mutagenèse dirigée vers le site&nbsp ;</td><td>New England Biolabs</td><td>E0552S</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep</td><td>Kit QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium dibasique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Triposhpate d’adénosine (ATP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>L-glutathion (GSH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 Système d’électroporation</td><td>BTX</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette d’électroporation 4 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0126</td><td></td></tr><tr><td>Crytal Violet</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21932-14</td><td></td></tr><tr><td>Plaque TC 6 puits</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Plaque TC 24 puits</td><td>Corning</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>Verre de couverture rond de 12 mm</td><td>VWR International</td><td>89015-724</td><td></td></tr><tr><td>Plaque TC à 96 puits</td><td>Corning</td><td>353075</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Cloning Kit (Multi-fragment)</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Polymérase haute fidélité&nbsp ;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Pyriméthamine</td><td>TCI AMERICA</td><td>P2037-1G</td><td>Utilisation de la cuation lors de l’utilisation de parasites résistants à la pyriméthamine - voir protocole</td></tr></tbody></table>

mapping qtl et édition crispr / cas9 pour identifier un gène de résistance aux médicaments<em&gt; toxoplasma gondii</em

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Le savoir scientifique est intrinsèquement lié aux technologies et méthodes disponibles. Cet article présentera deux méthodes permettant l&#39;identification et la vérification d&#39;un gène de résistance aux médicaments dans le parasite d&#39;Apicomplexan Toxoplasma gondii , la méthode de la cartographie quantitative des locus de traits (QTL) en utilisant une carte génétique à base de séquences de génome entier (WGS) et la méthode Des répétitions palindromiques courtes clivées périodiquement et sans palpage (CRISPR) / Cas9. L&#39;approche de la cartographie QTL permet de tester s&#39;il existe une corrélation entre une (des) région (s) génomique (s) et un phénotype. Deux ensembles de données sont nécessaires pour exécuter une analyse QTL, une carte génétique basée sur la descendance d&#39;une croix recombinante et un phénotype quantifiable évalué dans chacune des progénitures de cette croix. Ces ensembles de données sont ensuite formatés pour être compatibles avec le logiciel R / qtl qui génère une analyse QTL pour identifier des loci significatifs corrélés avec le phénotype. Bien que cela puisse considérablement réduire la recherche wEn ce qui concerne les candidats possibles, les QTL couvrent des régions contenant un certain nombre de gènes à partir desquels le gène causal doit être identifié. L&#39;obtention de WGS de la progéniture était critique pour identifier la mutation de la résistance aux médicaments causale au niveau du gène. Une fois identifié, la mutation candidate peut être vérifiée par la manipulation génétique de parasites sensibles aux médicaments. La méthode la plus facile et efficace pour modifier génétiquement T. gondii est le système CRISPR / Cas9. Ce système comprenait seulement 2 composants codés sur un seul plasmide, un ARN guide unique (gRNA) contenant une séquence de 20 pb complémentaire de la cible génomique et l&#39;endonucléase Cas9 qui génère une rupture d&#39;ADN double brin (DSB) à la cible, Dont la réparation permet l&#39;insertion ou la suppression de séquences autour du site de rupture. Cet article fournit des protocoles détaillés pour utiliser les outils d&#39;édition du génome basés sur CRISPR / Cas9 pour vérifier le gène responsable de la résistance au sinefungine et pour construire des parasites transgéniques.

Cet article décrit en détail plusieurs méthodes qui peuvent être utilisées successivement pour identifier un gène responsable de la résistance aux médicaments ( figure 1 ). La progéniture 24 de la croix M49-FUDR r X VAND-SNF a été évaluée en fonction de la résistance au médicament sinefungine comme décrit dans le Protocole 1. En utilisant la carte génétique et le phénotype SNF r de la descendance, une analyse QTL a été effectuée en R / Qtl - Protocole 2 ( Figure 2 ). Cela a entraîné un pic significatif sur le chromosome IX couvrant environ 1 Mbp. C&#39;est dans cette région que se situe la mutation causale. Pour identifier la mutation causale, les lectures WGS de la progéniture ont été alignées sur le génome de référence VAND-SNF s en utilisant Bowtie2 - Protocole 3.1, les SNP ont été appelés en utilisant VarScan mpileup2snp - Protocole 3.2 et le locus QTL dans le génome VAND a été identifié à l&#39;aide de MUMmer - ProtocOl 3.3. Les SNP de progéniture dans le locus QTL ont été extraits et scannés pour un motif où la progéniture SNF a un SNP et les SNF ne le font pas, ce qui est possible car les SNP de descendance ont été obtenus par rapport au génome de référence de VAND-SNF ( Figure 3 ) . Un seul SNP correspondait à ce schéma qui aboutit à un codon d&#39;arrêt précoce dans un gène putatif de transporteur d&#39;aminoacides appelé SNR1 . La confirmation que SNR1 est le gène de résistance SNF r a été effectuée en utilisant le système CRISPR / Cas9. Un nouveau plasmide CRISPR / Cas9 conçu pour l&#39;édition de gènes de T. gondii a été réalisé contenant un gRNA ciblant le gène SNR1 près de la mutation SNF r identifiée dans la progéniture - Protocole 4 ( Figure 4A ). Le SNR1 ciblant le plasmide CRISPR / Cas9 a été électroporé dans une souche de parasite WT de SNF et des mutants résistants ont été obtenus lorsque le culteDans 0,3 μM de sinefungine. Aucun SNF r parasites n&#39;a été obtenu lors de l&#39;électroporation avec l&#39;UPRT ciblant le plasmide CRISPR / Cas9. Plusieurs SNF r CRISPR mutants ont été clonés et la région autour de SNR1 gRNA cible a été séquencée. Chaque mutant avait un indel qui a perturbé la séquence codante du gène SNR1 ( figure 4B ). Cette méthode peut également être utilisée pour insérer une construction de ciblage dans le locus SNR1 via NHEJ ( Figure 5) ou par HR ( Figure 6 ) - Fichier supplémentaire 2 . <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig1.jpg" /> Figure 1: Flux de travail schématique pour les expériences décrites dans les protocoles. Les principales étapes de l&#39;identification et de la confirmation du gène SNF r en utilisant la croix ME49-FUDR r X VAND-SNF r sont indiquées en référence aux protocoles appropriés décrits dans tSon article. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig2.jpg" /> Figure 2: Commandes R / qtl pour exécuter QTL Scan sur le phénotype SNF r . Les commandes décrites dans le protocole 2 ont été exécutées dans R en utilisant le paquet qtl. Les commandes et l&#39;intrigue représentatives sont affichées. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="figure 3" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig3.jpg" /> Figure 3: Emplacement du SNP causal. Progéniture Les lectures WGS ont été alignées sur le génome de référence de VAND-SNF avec Bowtie 2, les SNP ont été appelés avec VarScan et les correspondants<html> VOG QTL locus identifié avec MUMmer. Les SNP situés dans le locus QTL ont été importés dans une feuille de calcul et le SNP causal a été identifié. Protéine SNF (jaune), descendance SNF (vert), SNF r SNP (rouge) (voir Fichier Data 3 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig4.jpg" /> Figure 4: Confirmer SNR1 en tant que SNF r Gene en utilisant CRISPR / Cas9. ( A ) mutations d&#39;indel induite par CRISPR / Cas9 (vert) dans le locus SNR1 . ( B ) Indels représentatifs dans SNR1 provoqués par deux plasmides CRISPR spécifiques SNR1 (C5 et C6 respectivement). RH est la souche WT et C5 et C6 sont des mutants SNF r . (B est pris de référenceS = &quot;xref&quot;&gt; 2). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig5.jpg" /> Figure 5. Mutagénèse Insertionnelle utilisant CRISPR / Cas9. ( A ) Insertion de gènes complémentaires ou transgéniques dans le locus SNR1 par intégration par site CRISPR / Cas9 médiée par site. Deux orientations possibles du mini-gène DHFR * inséré et les amorces utilisées pour l&#39;identification, F1 / 2 et R1 / 2 représentent les sites d&#39;amorçage des oligos utilisés dans les PCR diagnostiques. ( B ) Les PCR de diagnostic d&#39;un clone snr1 :: DHFR * , RH est utilisé comme témoin WT. La PCR du GRA1p est incluse dans le contrôle de la qualité de l&#39;ADN génomique en tant que modèle. Les astérisques indiquent des voies avec des bandes non spécifiques (la figure 5B est prise de référencerCe 2 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig5large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig6.jpg" /> Figure 6: Knockout génétique utilisant CRISPR / Cas9. Un design classique pour le remplacement de gènes homologues médié par CRISPR / Cas9 chez T. gondii . L&#39;orientation du transgène inséré est résolue dans ce cas. F1 / R1, F2 / R2 et F3 / R3 représentent les sites d&#39;amorçage des oligos utilisés dans les PCR diagnostiques. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig6large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> Fichier de données 1: ME49-FUDR r X VAND-SNF r Fichier croisé fOu utiliser dans R / qtl, &quot;csv&quot; Format. Un fichier .csv qui peut être chargé dans R / qtl avec l&#39;option format = &quot;csv&quot;. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_1.csv" target="_blank">Cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a> Fichier de données 2: (chrid txt, génotype txt, markerpos.txt, mname.txt, phenonames.txt et phenos.txt). ME49-FUDR r X VAND-SNF r Fichiers croisés pour utilisation dans le format R / qtl, &quot;gary&quot;. Six fichiers .txt qui peuvent être chargés en R / qtl avec l&#39;option format = &quot;gary&quot;. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_2.zip" target="_blank">Cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a> Fichier de données 3. Feuille de calcul avec SNP de progéniture à travers le SNF r <stronG&gt; QTL Locus. Contient une feuille de calcul avec les SNP de descendance et une deuxième feuille de travail avec les données phénotypiques des parents et la descendance de la croix. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_3.xlsx" target="_blank">Cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a> Fichier supplémentaire 1: Détails supplémentaires du protocole. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Supplementary_File_1_-_101916.docx" target="_blank">Cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a> Fichier supplémentaire 2: Protocole 5 - Utilisation de la sélection négative au site SNR1 pour la complétude génétique ou la construction de souches transgéniques. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Supplementary_File_2_-_101916.docx" target="_blank">Cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a></a>

Des détails sont présentés sur la façon dont le cartographie QTL avec une carte génétique basée sur la séquence génomique complète peut être utilisé pour identifier un gène de résistance aux médicaments chez Toxoplasma gondii et comment cela peut être vérifié avec le système CRISPR / Cas9 qui modifie efficacement une cible génomique, dans ce cas le Gène de résistance aux médicaments.

Mapping QTL et édition CRISPR / Cas9 pour identifier un gène de résistance aux médicaments<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

L'objectif général de cette méthodologie de cartographie de locus de caractères quantitatifs et d'édition du génome par CRISPR/Cas9 est d'identifier, puis de valider, un gène impliqué dans la résistance à la sinefungine chez Toxoplasma. Ces méthodes permettent de répondre à des questions clés en parasitologie, telles que les bases génétiques des variants, de la pathogenèse et de la résistance aux médicaments. Le principal avantage de ces techniques réside dans l'utilisation de données de séquençage complet du génome pour une analyse précise des QTL et de l'édition génomique CRISPR/Cas9 pour une manipulation génétique efficace chez Toxoplasma.Le Dr Robin Powell, chercheur associé de mon laboratoire, démontrera la procédure. Les parasites Toxoplasma gondii sont cultivés dans des cellules de fibroblastes de prépuce humain (HFF) confluentes, semées dans des flacons T25 avec du milieu D10. Pour tester la résistance au sinefungin chez des clones de progéniture individuels, faire croître chaque clone jusqu'à une densité élevée de parasites, jusqu'à ce qu'une majorité des parasites commence à lyser les cellules hôtes.Après avoir préparé la solution de parasites comme décrit dans le protocole écrit, utilisez une pipette pour transférer 2,5 × 10⁵ parasites dans un nouveau flacon de culture T25 contenant des cellules HFF et le milieu D10, avec une concentration working de 0,3 µM de la drogue sinefungine. Incubez les parasites à 37 °C et 5 % CO₂ pendant sept à dix jours. Observez la monocouche de cellules HFF au microscope inversé en contraste de phase et évaluez la descendance pour le phénotype de croissance en présence de la drogue sinefungine.Par exemple, attribuez un score de zéro en l'absence de croissance et un score de un en cas de croissance et de lyse de la monocouche. Une fois que tous les descendants ont été évalués, les données seront utilisées comme phénotype binaire pour la cartographie de locus de caractères quantitatifs (QTL). Pour identifier la mutation causale, les lectures de séquençage du génome entier des descendants sont alignées sur le génome de référence sensible à la sinefungine de la souche van, les SNP sont déterminés et le locus QTL est analysé afin de détecter un SNP associé à la résistance à la sinefungin.La confirmation que SNR1 est le gène de résistance à la sinefungine sera effectuée en inactivant SNR1 dans un fond génétique sauvage sensible à la sinefungine à l'aide de mutations insertionnelles/délétionnelles induites par CRISPR/Cas9. Pour construire le plasmide CRISPR spécifique de SNR1, le plasmide CRISPR ciblant UPRT est utilisé comme matrice dans une mutagenèse dirigée par PCR basée sur des amorces spécifiques. Les produits de mutagenèse contenant les plasmides CRISPR spécifiques du gène d'intérêt sont transformés dans des cellules d’E. coli.Des clones individuels sont ensuite sélectionnés et cultivés dans un milieu LB, et les plasmides extraits sont analysés par électrophorèse sur gel d'ADN afin de vérifier leur taille. Les plasmides sont ensuite séquencés pour confirmer la séquence d'ARN guide spécifique de la cible. Lorsque le plasmide CRISPR spécifique de la cible est introduit dans une cellule de Toxoplasma, l'ARN guide dirige la Cas9 vers la cible afin d'induire une cassure double brin de l'ADN au niveau d'un locus spécifique chez la cible.La cassure de l'ADN est ensuite réparée par une activité de jonction non homologue sujette aux erreurs, entraînant des mutations d'insertion-délétion (indel) dans le gène ciblé. Deux à trois jours avant la transfection des parasites avec le plasmide CRISPR spécifique de SNR1, ajouter suffisamment de parasites dans un flacon T25 contenant une monocouche de cellules HFF confluentes pour obtenir une lyse de 70 % à 80 % des cellules HFF en deux à trois jours. Examiner la culture au microscope inversé à contraste de phase afin de confirmer que la monocouche de cellules HFF est lysée à 70 % à 80 % par les parasites.Retirez délicatement le milieu à l’aide d’une pipette et lavez les cellules de la surface du flacon avec cinq millilitres de tampon cytomix. Transférez la solution de parasites dans un tube conique de 15 millilitres. Faites passer la solution de parasites à travers une seringue de 10 millilitres équipée d’une aiguille courte de calibre 22, deux à trois fois.Pour éliminer les cellules HFF et les débris cellulaires, filtrer la solution de parasites à travers une membrane de trois micromètres dans un nouveau tube conique. Récupérer les parasites filtrés par centrifugation à 400 ×g pendant 10 minutes. Éliminer le surnageant et remettre en suspension les parasites pelletés avec 10 millilitres de tampon cytomix.Prélevez un aliquot de 10 microlitres pour déterminer la concentration de parasites à l’aide d’un hématimètre. Pelletez le reste de la suspension par centrifugation à 400 × g pendant 10 minutes. Éliminez le surnageant et resuspendez le culot dans le tampon de mélange pour obtenir une densité de 4 × 10⁷ parasites par millilitre.Dans une cuvette à entrefer de quatre millilitres, mélanger 250 à 300 microlitres de la solution de parasites avec 7,5 microgrammes de plasmide CRISPR, six microlitres d'ATP et six microlitres de glutathion. Électroporer les parasites en suivant une procédure standard de transfection de T gondii. Inclure une électroporation distincte comme témoin négatif, dans laquelle un plasmide CRISPR cible un autre site.Faire pousser les parasites électroporés dans un flacon T25, ensemencé avec des cellules HFF, à 37 degrés Celsius pendant deux jours. Pour commencer la procédure d'analyse des mutations induites, remplacer d'abord le milieu dans le flacon par cinq millilitres de D10, contenant 0,3 micromole de sinefungine. Maintenir les parasites et le milieu de sélection pendant au moins trois passages jusqu'à ce que la population résistante devienne stable.Comme indiqué par l'absence de croissance parasitaire dans le groupe témoin négatif, mais une croissance parasitaire robuste dans le groupe expérimental. Sous-cloner le pool résistant à la sinefungine afin d'obtenir des souches clonales. Récolter les parasites fraîchement sortis, les purifier par filtration sur membrane de trois microns et les sous-cloner dans des plaques de 96 puits, ensemencées avec des cellules HFF confluentes dans 150 microlitres de milieu D10.Faites croître les cultures de sous-clonage dans un incubateur à CO2 à 37 degrés Celsius pendant sept à dix jours, sans déranger les plaques. Après sept à dix jours, examinez les plaques de 96 puits au microscope inversé à contraste de phase. Recherchez les puits contenant un seul plaque et marquez ces puits.Transférez les cellules de chaque puits dans des plaques de 24 puits, ensemencées avec des cellules HFF. Incubez à 37 degrés Celsius. Lorsque les parasites commencent à lyser la monocouche, passez 50 microlitres de la solution parasitaire dans un nouveau puits afin de maintenir la souche, et récoltez le reste pour l'isolement de l'ADN génomique.Centrifuger le reste de la solution de parasites à 1000 ×g pendant 10 minutes. Laver les parasites centrifugués avec du PBS et les centrifuger à nouveau. Isoler l'ADN génomique des cellules centrifuguées à l'aide d'un kit commercial ou par ébullition, puis redisperser les parasites dans 50 à 100 microlitres de PBS.Enfin, réalisez une PCR comme décrit dans le protocole écrit afin d'obtenir un fragment du gène SNR1 destiné au séquençage. La descendance issue du croisement, utilisant les souches parentales ME49 résistantes au FUDR et les souches van résistantes à la sinefungine, a été analysée pour leur résistance au médicament sinefungine, indiquée par la croissance et la lyse de la monocouche de HFF. Une analyse QTL a révélé un pic significatif unique sur le chromosome neuf, s'étendant sur environ un Mpb.La mutation causale se situe dans cette région. Le séquençage complet du génome a permis l'identification de la mutation. Les SNP des descendants situés dans le locus QTL ont été importés dans un tableur et analysés afin de détecter un motif selon lequel les descendants résistants à la sinefungine, indiqués en jaune, possèdent un SNP, tandis que les descendants sensibles à la sinefungine, indiqués en vert, n'en possèdent pas.Un seul SNP indiqué en rouge correspondait à ce motif, entraînant un codon stop précoce dans un gène putatif de transporteur d'acides aminés nommé SNR1. Lorsque le plasmide CRISPR ciblant SNR1 de type neuf a été électroporé dans une souche sauvage sensible à la sinefungine, des mutants résistants ont été obtenus après culture en présence de sinefungine. En revanche, aucun parasite résistant à la sinefungine n'a été obtenu avec un plasmide CRISPR ciblant une autre région.Plusieurs mutants CRISPR résistants à la sinefungine ont été clonés et la région entourant la cible de l'ARN guide SNR1 a été séquencée. Un exemple représentatif des résultats obtenus avec la souche sauvage RH et les mutants C5 et C6 résistants à la sinefungine montre que chaque mutant présentait une délétion ou insertion (indel) ayant interrompu la séquence codante du gène SNR1. N'oubliez pas que le travail avec Toxoplasma gondii peut présenter un danger, car il est infectieux pour l'homme.Des précautions doivent être prises pendant cette procédure, telles qu'une manipulation appropriée des objets tranchants qui pourraient entrer en contact avec le parasite. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme l'insertion exogène ciblée de gènes par CRISPR/Cas9, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la complémentation génétique ou la construction de parasites transgéniques. Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la parasitologie moléculaire pour explorer la biologie complexe et les mécanismes de pathogénèse de Toxoplasma gondii.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser une analyse de QTL à l’aide de données de séquençage génomique, ainsi que la modification génétique de Toxoplasma gondii par édition génique CRISPR/Cas9.

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Manipulation génétique<em&gt; Δku80</em&gt; Les souches pour l&#39;analyse génomique fonctionnelle de<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Nous décrivons une méthode pour effectuer l'analyse génétique dans Chlamydia basé sur la mutagenèse chimique et le séquençage complet du génome. En outre, un système d'échange de l'ADN dans les cellules infectées est décrite qui peut être utilisé pour la cartographie génétique. Cette méthode peut être largement applicable à des systèmes microbiens manquant des systèmes de transformation et des outils de génétique moléculaire.

Approches avant génétiques dans<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

La génétique avancée est une approche puissante pour identifier les gènes des pathogènes intracellulaires importants pour la résistance à l’immunité autonome cellulaire. L’approche actuelle utilise des cellules immunitaires innées, en particulier des macrophages, pour identifier de nouveaux gènes de Toxoplasma gondii importants pour l’évasion immunitaire.

Forward Génétique écrans à l&#39;aide pour identifier les macrophages<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; gènes importants pour la résistance à l&#39;IFN-γ-cellulaire dépendant immunité autonome

Les auteurs décrivent une méthode pour générer des MLG-base conditionnelles mutants knockdown de Plasmodium falciparum à l’aide de CRISPR/Cas9 génome édition.

CRISPR/Cas9 gène édition à faire conditionnel Mutants de Human Parasite du paludisme à P. falciparum

Ici, nous décrivons un protocole pour introduire un KO de gène dans l'amastigote extracellulaire de Trypanosoma cruzi, utilisant le système CRISPR/Cas9. Le phénotype de croissance peut être suivi soit par le comptage cellulaire de la culture amastigote axenique ou par la prolifération des amastigotes intracellulaires après l'invasion de cellules hôtes.

Présentation d'un Knockout Génique Directement dans la phase Amastigote de Trypanosoma cruzi à l'aide du système CRISPR/Cas9

Décrit ici est une méthode pour la suppression ciblée et sans marqueur de gène dans Chlamydia trachomatis utilisant la mutagénèse allélique d'échange allélique de cassette floxed, FLAEM.

Markerless Gene Deletion par Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Présenté ici est un protocole pour évaluer l’efficacité d’inhibition des composés chimiques contre la croissance intracellulaire in vitro de Toxoplasma gondii en utilisant un essai de croissance à base de luciferase. La technique est utilisée pour confirmer la spécificité de l’inhibition par la suppression génétique du gène cible correspondant. L’inhibition de LHVS contre la protéase TgCPL est évaluée en exemple.

Détermination de l’efficacité de l’inhibiteur chimique contre la croissance intracellulaire de Toxoplasma Gondii utilisant un essai de croissance basé sur luciferase

L’objectif de ce protocole est de permettre l’édition CRISPR/Cas9 transparente du génome de C. elegans en utilisant des complexes de ribonucléoprotéines assemblés et le marqueur co-CRISPR dpy-10 pour le dépistage. Ce protocole peut être utilisé pour effectuer une variété de modifications génétiques chez C. elegans, y compris des insertions, des délétions, des remplacements de gènes et des substitutions de codon.

CRISPR/Cas9 Édition du gène C. elegans rbm-3.2 à l’aide du marqueur de criblage co-CRISPR dpy-10 et des complexes de ribonucléoprotéines assemblés.

La Biotinylation par illumination restreinte par localisation spécifique à AviTag (ALIBi) est une méthode novatrice activée par l’optogénétique développée pour marquer et purifier par affinité les populations subcellulaires de ribosomes pour le séquençage en aval et l’analyse protéomique.

Isolement des sous-populations de ribosomes subcellulaires basé sur la biotinylation enrichie par éclairage restreinte par peptide peptidique spécifique à la marque de recombinaison

La génétique chimique implique la substitution d’un résidu gardien par un acide aminé contenant une chaîne latérale différente au locus cible. Ici, nous avons généré un parasite mutant contenant un allèle hypomorphe de cdpk1 et identifié des voies compensatoires adoptées par le parasite dans le fond mutant.

Comprendre le développement de voies compensatoires chez un parasite mutant du paludisme hébergeant un allèle hypomorphe de kinases ressemblant à des plantes

Découvrez le mapping QTL et l'édition CRISPR/Cas9 pour identifier le gène SNR1 de résistance à la sinéfungine chez Toxoplasma gondii. Cette méthode combine séquençage génomique et manipulation génétique.

Mapping QTL et édition CRISPR / Cas9 pour identifier un gène de résistance aux médicaments

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