Préparation et évaluation des ^99m Tc marquée tridenté chélates de pré-ciblage utilisant Bioorthogonal Chemistry

L’objectif global de cette procédure est de produire des tétrazines marquées au technétium-99m pour l’imagerie pré-ciblée en utilisant la chimie bioorthogonale avec des biomolécules modifiées au trans-cyclooctène comme vecteurs de ciblage. Cette méthode fournit une nouvelle plate-forme importante pour le développement de nouveaux produits radiopharmaceutiques. Grâce au pré-ciblage, les complexes de technétium décrits ici peuvent être utilisés pour imager un large éventail d’organes, de tissus et de biomarqueurs.

Cette technique est avantageuse car elle fournit une méthode robuste étape par étape pour produire des tétrazines radiomarquées au technétium-99m, l’isotope médical le plus largement utilisé en médecine diagnostique. Cette technique peut être utilisée avec différents vecteurs de ciblage, y compris les petites molécules et les anticorps. Il peut également être utilisé pour la radiothérapie en échangeant du technétium avec des isotopes émetteurs bêta du rhénium.

Nancy Janzen, technicienne en biologie dans notre laboratoire, fera la démonstration d’une partie des procédures sur les animaux. Pour commencer la procédure de radio-marquage, dans un flacon à micro-ondes, combinez huit milligrammes de boranocabonate de potassium, 15 milligrammes de carbonate de sodium, 20 milligrammes de tétraborate de sodium décahydraté et 25 milligrammes de tartrate de sodium de potassium tétrahydraté. Purgez le flacon avec du gaz argon pendant 10 minutes.

Ensuite, ajoutez quatre millilitres de pertechnétate de technétium-99m dans une solution saline à 0,9 % avec une activité de 1 110 mégabecquerels dans le flacon. Chargez le mélange réactionnel dans un réacteur à micro-ondes et remuez pendant 10 secondes. Ensuite, chauffez le mélange à 110 degrés Celsius pendant 3,5 minutes pour obtenir le cation triaqua tricarbonyl technétium-99m.

Ajoutez environ 400 microlitres d’acide chlorhydrique molaire pour ajuster le pH de la solution à 3,5 à quatre. Ensuite, pour chaque ligand de tétrazine, dissolvez deux milligrammes de ligand dans 250 microlitres de méthanol. Ajouter 250 microlitres du complexe technétium-99m avec une activité de 74 mégabecquerels à chaque solution de ligand.

Chauffer le mélange dans un réacteur à micro-ondes à 60 degrés Celsius pendant 20 minutes. Pour les ligands de tétrazine avec des groupes protecteurs t-butyle, transférez la solution d’un flacon micro-ondes dans un flacon à scintillation de 20 millilitres, puis évaporez le solvant et dissolvez à nouveau chaque complexe dans un millilitre d’une solution individuelle par volume de dichlorométhane et d’acide trifluoroacétique. Ensuite, transférez la solution dans un flacon à micro-ondes et chauffez ces complexes dans un réacteur à micro-ondes à 60 degrés Celsius pendant six à 10 minutes pour déprotéger les ligands.

Refroidissez les complexes à température ambiante, puis évaporez le solvant. Redissolvez les résidus dans 500 microlitres d’une solution aqueuse individuelle d’acétonitrile ou de méthanol et d’eau avant de procéder à la purification HPLC. Utilisez la HPLC en phase inverse C18 pour purifier chaque complexe de tétrazine radiomarqué avec un gradient d’élution de 30 à 70 à 40 à 60 acétonitrile dans l’eau pendant 20 minutes avec 0,1 % d’acide trifluoroacétique présent dans l’éluant partout.

Récupérez le produit purifié lorsqu’il est montré en train de s’échapper dans la trace gamma. Ensuite, co-injectez chaque complexe marqué avec une solution de 0,125 milligramme du complexe radium-tétrazine correspondant dans 20 % de méthanol dans de l’eau. Comparez les temps de rétention du pic du complexe rhénium dans la trace UV et du pic du complexe technétium dans la trace gamma pour vérifier l’identité du pic gamma.

Retirer le solvant de chaque complexe technétium-tétrazine purifié. Formuler chaque complexe à une concentration de 7,4 kilobecquerels par microlitre dans une solution saline tamponnée au phosphate avec 0,5 % d’albumine sérique bovine et 0,01 % de polysorbate 80. Pour chaque sujet de souris, prélever dans une seringue 100 microlitres d’une solution de cinq microgrammes par microlitre du dérivé du TCOPB dans une solution saline pour préparer une dose de 20 milligrammes par kilogramme.

Connectez une aiguille de calibre 30 à la seringue doseuse. Placez le sujet de la souris dans un dispositif de contention physique. Identifiez les veines sur la surface latérale de la queue à environ deux centimètres de l’extrémité de la queue et essuyez la zone avec un tampon imbibé d’alcool.

Insérez l’aiguille de la seringue à un angle peu profond parallèle à la veine. Injectez lentement le dérivé TCOBP. Retirez l’aiguille et appliquez une éponge de gaze propre avec une légère pression sur le site d’injection jusqu’à ce que le saignement cesse.

Une heure après l’injection du dérivé du TCOBP, administrer une dose de 100 microlitres du complexe technétium-99m tétrazine désiré avec une activité d’environ 0,74 mégabecquerel par injection dans la veine de queue. À l’aide d’un calibrateur de dose, mesurez l’activité d’un échantillon d’essai de 100 microlitres du complexe technétium au moment de l’injection. Conservez l’échantillon de test pour des mesures ultérieures.

Anesthésez la souris avec un mélange gazeux d’isoflurane à 3 % et d’oxygène six heures après l’injection. Placez la souris sur son dos avec son nez dans le cône nasal pour une anesthésie continue, et localisez le processus xiphoïde. Connectez une aiguille de calibre 25 à une seringue prétraitée à l’héparine.

Insérez l’aiguille à un angle de 20 degrés sous le processus xiphoïde, légèrement à gauche de la ligne médiane. Une fois l’aiguille complètement insérée, retirez lentement le piston pour vérifier s’il y a du sang dans l’embout de l’aiguille, confirmant ainsi une ponction cardiaque réussie. Réajustez l’aiguille au besoin.

Une fois que le cœur a été perforé, aspirez lentement un millilitre de sang dans la seringue. Transférez l’échantillon de sang dans un tube de comptage pré-pesé. Euthanasier la souris par luxation cervicale sous anesthésie.

Placez l’animal euthanasié dans un sac en plastique et mesurez l’activité de tout le corps à l’aide d’un calibrateur de dose. Ensuite, collectez les os du genou et de l’épaule, la vésicule biliaire, les reins, le foie, la thyroïde et la trachée, ainsi que la queue. Avec leur contenu, recueillez l’estomac, l’intestin grêle, le gros intestin et le caecum et la vessie.

Rincer le sang de tous les tissus prélevés, à l’exception de la biliaire et de la vessie, dans une solution saline tamponnée au phosphate. Séchez les mouchoirs par épongement et placez chaque mouchoir dans un tube de comptage pré-pesé. Mesurez l’activité résiduelle de la carcasse.

Pesez chaque échantillon de tissu et calculez la masse du tissu seul. Utilisez un compteur gamma multi-détecteurs pour mesurer l’activité d’une aliquote de cinq microlitres de l’échantillon d’essai du complexe de technétium. À l’aide de la valeur obtenue en nombres par minute et de l’activité mesurée au moment de l’injection, calculer un facteur de conversion.

Mesurez l’activité de chaque échantillon de tissu et de liquide à l’aide du détecteur gamma. Convertissez les valeurs en microcurie et normalisez chaque valeur en fonction du poids de l’organe pour déterminer le pourcentage de biches injectées par gramme de tissu. Répétez ce processus avec d’autres souris sans l’injection du dérivé TCOPB en tant que série de contrôle négative.

En utilisant cette méthode, cinq complexes de tétrazine différant dans leurs combinaisons de linker et de clé-leader ont été marqués au technétium-99m. Un dérivé de TCOPB, qui se localise dans les régions à fort renouvellement calcique dans les os, a été utilisé pour pré-cibler les articulations de l’épaule et du genou de souris. Les rapports entre le pourcentage de dose injectée et par gramme de tissu pour les os et le sang ont été calculés pour chaque composé de tétrazine.

Les cinq composés ont rapidement évacué le sang et ciblé l’os, ce qui indique que la réaction de couplage bioorthogonal sélectif entre les composés de la tétrazine et le dérivé du TCOBP s’est produite in vivo. Le troisième composé a montré la meilleure combinaison de ciblage et d’élimination du sang. Des expériences de contrôle négatif ont indiqué que les complexes de tétrazine radiomarqués ne se localisaient pas de manière significative dans l’os en l’absence du dérivé TCOBP.

Par exemple, lorsque le dérivé du TCOBP n’a pas été administré, le composé deux avait des niveaux élevés dans la vésicule biliaire et les intestins, mais très peu dans les os. Une grande variation a été observée dans la localisation tissulaire chez les souris recevant le dérivé TCOBP parmi les cinq composés testés. Par exemple, très peu du composé trois a été observé dans le gros intestin, le foie ou l’urine et la vessie par rapport aux autres complexes, tandis que beaucoup plus du composé trois a été observé dans les os.

Une fois maîtrisée, la technique d’étiquetage décrite ici peut être réalisée du début à la fin en moins de deux heures si elle est correctement exécutée. Lors de l’essai de cette technique, il est important de s’assurer que tous les réactifs sont pesés avec précision et que les sels sont purgés avec de l’argon avant d’être ajoutés à la solution de technétium. Il est également essentiel que le pH de la solution de technétium soit ajusté à 3,5 à 4 avant l’ajout du ligand tétrazine.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer et de purifier les tétrazines marquées au technétium et comment elles peuvent être utilisées pour créer de nouveaux produits radiopharmaceutiques en utilisant le pré-ciblage et la chimie bioorthogonale. N’oubliez pas de prendre les précautions appropriées lorsque vous travaillez avec de la radioactivité, comme comprendre le type de rayonnement émis et la meilleure façon de protéger et de manipuler les échantillons.