Name: Préparation et évaluation des 99m Tc marquée tridenté chélates de pré-ciblage utilisant Bioorthogonal Chemistry (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Apprenez à préparer des tétrazines marquées au technétium-99m pour l'imagerie pré-ciblée utilisant la chimie bioorthogonale. Cette méthode permet d'imager divers organes et tissus avec une grande spécificité.

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Ce travail est soutenu par des subventions de recherche du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG), de l’Institut ontarien de recherche sur le cancer (IORC, #P.SI.015.8) et de la Société canadienne du cancer (SCC, #703857). Les auteurs remercient Denis Snider, Ph. D., qui a contribué à la préparation du manuscrit.

Les études animales ont été approuvées par le Comité d&#39;éthique de la recherche animale à l&#39;Université McMaster en conformité avec Conseil canadien de protection des animaux (CCPA) Lignes directrices. 1. Ligands de radiomarquage Tz-tridentate avec 99mTc ATTENTION: Les procédures suivantes nécessitent l&#39;utilisation de composés radioactifs. Le travail ne doit être effectué dans un laboratoire agréé par le respect des règles de sécurité et d&#39;élimination. Les réactions à micro-ondes doivent être effectuées dans un four micro-ondes conçu spécifiquement pour la synthèse chimique. <ol><li> Synthèse du [99mTc (CO) 3 (H 2 O) 3] + 19, 20 <ol><li> Dans un flacon à micro - ondes, mélanger 8 mg de K 2 [BH 3 CO 2], 15 mg de Na 2 CO 3, 20 mg de Na 2 B 4 O 7 · 10H 2 O et 25 mg KOCO [CH (OH)]2 COONa · 4H 2 O. Purge le flacon pendant 10 minutes avec du gaz argon. </li><li> Ajouter 4 ml de 99m TcO 4 - (~ 1100 MBq, ~ 30 mCi) dans du sérum physiologique à 0,9% au flacon. </li><li> Chauffer le mélange réactionnel dans un micro-ondes pendant 3,5 minutes à 110 ° C, après 10 s d&#39;agitation pour assurer un mélange intime des réactifs. </li><li> Ajuster le pH de la solution à 3,5-4 à l&#39;aide ~ 400 ul de HCl 1 M. Vérifiez en utilisant du papier pH. </li></ol></li><li> Radiomarquage des ligands 1-5 tétrazine <ol><li> Dissoudre 2 mg de chaque ligand (composés 1-5) dans 250 ul de MeOH 21. </li><li> Ajouter 250 ul de [99mTc (CO) 3 (H 2 O) 3] + (~ 74 MBq ~ 2 mCi) à chaque solution. </li><li> Chauffer le mélange réactionnel à l&#39;aide d&#39;un four micro-ondes pendant 20 min à 60 ° C. REMARQUE: Cette étape est identique pour tous les 5 tétrazines. </li><li> Pour les composés 2 à 5, évaporer le solvant et re-dissolve les produits obtenus dans 1 ml de 1: 1 v / v DCM: TFA. </li><li> Chauffer les produits réactionnels dissous (2-5) à 60 ° C dans un four micro - ondes pendant 6 min (2-4) ou 10 min (5). </li><li> Après refroidissement à température ambiante, évaporer le solvant en utilisant un évaporateur (36 ° C, de 8 mbar, 3 min, 6000 rpm) et on dissout le composé séché dans 1: 1 d&#39; ACN: H 2 O ou 1: 1 MeOH: H 2 O, avant la purification par HPLC. </li><li> Purifier les 99m Tc-composés marqués (1-5), y compris la séparation du produit marqué du ligand tétrazine non marqué, par HPLC (C 18 en phase inverse). Typiquement, en utilisant un gradient d&#39;élution de 30:70 d&#39; ACN: H 2 O (tous deux avec 0,1% de TFA) à 40:60 d&#39; ACN: H 2 O de plus de 20 min (18 min) et une colonne 4,6 x 100 mm C 18 analytique. Utilisez les deux UV (254 nm) et la détection gamma. <ol><li> Prenez un petit échantillon de chaque produit étiqueté et de comparer son temps de rétention HPLC à celle d&#39;un co-injète, non radioactif, norme réétiquetée (0,125 mg dans 20% de méthanol-H 2 O). La norme de Re-marqué est identifié dans la trace HPLC UV, et éluer en même temps que le 99m Tc composé marqué dans la trace γ-HPLC. Cette co-injection présente des pics aux temps de rétention comparable, ce qui confirme l&#39;identité du composé 99m marqué par Tc. </li></ol></li><li> On évapore le solvant des fractions HPLC en utilisant un évaporateur (36 ° C, de 8 mbar, 3 min, 6000 rpm). </li><li> Formuler le composé purifié à une concentration de 7,4 kBq / pl dans du PBS contenant 0,5% de BSA et 0,01% de Tween-80. </li><li> Pour garantir que les composés marqués sont stables, effectuer une étude in vitro de la stabilité. Incuber le composé formulé à 37 ° C pendant 1, 4 et 6 h, en injectant une petite quantité (3,7 MBq) du mélange sur la HPLC à chaque point de temps pour évaluer la stabilité. </li></ol></li></ol> 2. Les études Bio-distribution de pré-ciblés <ol><li&gt; Préparation des animaux <ol><li> Utilisation de vieux 7-9 semaine souris Balb / c, femelles (n = 3), administrer TCO-BP formulé dans une solution saline (20 mg / kg) (5 ug / ul), par injection de queue veineuse. </li><li> Placez la souris dans le dispositif de contrainte physique, et d&#39;identifier les veines situées sur les surfaces latérales de la queue et essuyer avec un tampon imbibé d&#39;alcool. À environ 2 cm de l&#39;extrémité de la queue, à insérer une aiguille de calibre 30 à un angle faible, parallèlement à la veine. Appuyer lentement sur le piston pour injecter, retirer l&#39;aiguille et appliquer éponge propre et de gaze sur le site d&#39;injection avec une légère pression jusqu&#39;à ce que le saignement cesse. </li><li> À 1 h après l&#39; injection de TCO-BP, administrer ~ 0,74 MBq (20 uCi) de 99mTc-tétrazine formulés dans 100 ul de 0,5% de BSA, 0,01% de Tween-80 dans du PBS, par injection de la veine de queue. </li></ol></li><li> Études Bio de distribution <ol><li> Au point de temps désiré (t = 6 h), anesthésier les souris en utilisant 3% d&#39;isoflurane et le mélange de gaz d&#39;oxygène de 2%. Démontrer àe pincée retrait sur la souris anesthésiée pour assurer qu&#39;ils sont sous plan chirurgical de l&#39;anesthésie. </li><li> Recueillir du sang (1 ml) par ponction cardiaque en utilisant une seringue pré-traitée avec de l&#39;héparine. Placez la souris sur le dos avec le nez dans le cône de nez pour l&#39;anesthésie continue et de localiser le processus xiphoïde sur l&#39;animal. <ol><li> Insérez une aiguille G 25, légèrement à gauche de la ligne médiane de l&#39;animal dans le cadre du processus xiphoïde, à un angle de 20 °. Insérez complètement l&#39;aiguille et tirez lentement sur le piston pour voir le sang dans le moyeu de l&#39;aiguille si le cœur a été perforé. Légèrement réajuster l&#39;aiguille tout en maintenant le piston si nécessaire, pour percer le cœur. Aspirez lentement le sang dans la seringue. </li></ol></li><li> Euthanasier l&#39;animal par dislocation cervicale, alors que sous anesthésie. </li><li> Placez chaque animal dans un sac en plastique et utiliser un calibrateur de dose (99m Tc de réglage) pour mesurer l&#39;ensemble du niveau d&#39;activité du corps. </li><li> Recueillir les tissus et les fluides suivants en pré-peséeed compter tubes: le sang, les os (genou et de l&#39;épaule), la vésicule biliaire, les reins, le foie, l&#39;estomac (avec le contenu), l&#39;intestin grêle (avec contenu), gros intestin et le caecum (avec contenu), de la thyroïde et de la trachée, de la vessie avec de l&#39;urine , et la queue. </li><li> Rincer les tissus appropriés (à l&#39;exclusion du sang, de la vésicule biliaire et de la vessie) dans PBS pour éliminer le sang et le sécher avant de placer les tissus dans des tubes de comptage appropriés. </li><li> Placez la carcasse de l&#39;animal dans un sac en plastique et mesurer l&#39;activité du corps entier résiduel en utilisant un calibrateur de dose. </li><li> Peser chaque tube contenant un échantillon de tissu. Soustraire poids initial du tube pour obtenir la masse du tissu. </li><li> Utiliser un calibreur de dose (99m de réglage Tc) pour mesurer la quantité d&#39;activité dans un échantillon d&#39;essai (100 ul) au moment de l&#39; injection pour chaque souris. REMARQUE: Cet échantillon d&#39;essai est égal au volume d&#39;injection, ce qui donne le compte de l&#39;activité au moment de l&#39;injection. </li><li> Au moment de la mesure de tissu, unliquot 5 ul de l&#39;échantillon d&#39;essai utilisé précédemment. Utilisez un compteur gamma multi-détecteur (99m de réglage Tc) et compter pour obtenir le nombre par minute (CPM) pour l&#39;échantillon d&#39;essai de 5 pi. </li><li> Utilisez les deux valeurs obtenues en 2.2.9 et 2.2.10 pour calculer l&#39;activité et la relation CPM en utilisant l&#39; équation 1 pour obtenir un facteur de conversion (CPM uCi -1). (1) <img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/55188/55188eq1.jpg" /></li><li> Utiliser le compteur de rayons gamma pour mesurer la quantité de radioactivité dans chaque échantillon de tissu ou de fluide. </li><li> Utiliser l&#39;équation 1 pour calculer la quantité d&#39;activité dans chaque tissu ou de liquide au moment de la mesure par rapport à la dose totale injectée. Cette valeur est ensuite normalisée en fonction du poids des organes et rapportée comme dose injectée par gramme pour cent ( par exemple,% ID / g) de tissu. </li><li> Suivez les étapes 2.1.2 à 2.2.13 pour mener une expérience de contrôle négatif en utilisant les 99m Tc marqué ligands tétrazine dans le Absence du TCO-BP. Sacrifice des souris (n = 3) après l&#39;injection de 0,5, 1, 4 et 6 h, et d&#39;obtenir un tissu ou d&#39;un fluide tel que décrit ci-dessus. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Jurisson, S. S., Lydon, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+Technetium+Small+Molecule+Radiopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Potential Technetium Small Molecule Radiopharmaceuticals.</a> Chem. Rev. 99 (9), 2205-2218 (1999).</li>
<li>Kluba, C. A., Mindt, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click-to-chelate%3A+Development+of+Technetium+and+Rhenium-Tricarbonyl+Labeled+Radiopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Click-to-chelate: Development of Technetium and Rhenium-Tricarbonyl Labeled Radiopharmaceuticals.</a> Molecules. 18, 3206-3226 (2013).</li>
<li>Amato, I. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cen-v087n036.p058">Nuclear Medicines Conundrum.</a> Chem. Eng. News. 87 (36), 58-70 (2009).</li>
<li>Hnatowich, D. J., Virzi, F., Rusckowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigations+of+Avidin+and+Biotin+for+Imaging+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">Investigations of Avidin and Biotin for Imaging Applications.</a> J. Nucl. Med. 28 (8), 1294-1302 (1987).</li>
<li>Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine+Ligation%3A+Fast+Bioconjugation+Based+on+Inverse-Electron-Demand+Diels-Alder+Reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactivity.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (41), 13518-13519 (2008).</li>
<li>Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine-Based+Cycloadditions%3A+Application+to+Pretargeted+Live+Cell+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Tetrazine-Based Cycloadditions: Application to Pretargeted Live Cell Imaging.</a> Bioconjugate Chem. 19 (12), 2297-2299 (2008).</li>
<li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Chemistry+for+Pretargeted+Tumor+Imaging+in+Live+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.%2C+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">In Vivo Chemistry for Pretargeted Tumor Imaging in Live Mice.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 49 (19), 3375-3378 (2010).</li>
<li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+Pretargeted+Strategy+for+the+PET+Imaging+of+Colorectal+Carcinoma+via+the+Modulation+of+Radioligand+Pharmacokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Optimization of a Pretargeted Strategy for the PET Imaging of Colorectal Carcinoma via the Modulation of Radioligand Pharmacokinetics.</a> Mol. Pharmaceutics. 12 (10), 3575-3587 (2015).</li>
<li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Reactive+trans-Cyclooctene+Tags+with+Improved+Stability+for+Diels-Alder+Chemistry+in+Living+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Highly Reactive trans-Cyclooctene Tags with Improved Stability for Diels-Alder Chemistry in Living Systems.</a> Bioconjugate Chem. 24 (7), 1210-1217 (2013).</li>
<li>Rossin, R., Robillard, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretargeted+Imaging+Using+Bioorthogonal+Chemistry+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pretargeted Imaging Using Bioorthogonal Chemistry in Mice.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 21, 161-169 (2014).</li>
<li>Denk, C., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.201404277/abstract">Development of a 18F-Labeled Tetrazine with Favorable Pharmacokinetics for Bioorthogonal PET Imaging.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 53 (36), 9655-9659 (2014).</li>
<li>Herth, M. M., Andersen, V. L., Lehel, S., Madsen, J., Knudsen, G. M., Kristensen, J. L. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2013/CC/c3cc41027g#!divAbstract">Development of a 11C-labeled Tetrazine for Rapid Tetrazine-Trans-Cyclooctene Ligation.</a> Chem. Commun. 49 (36), 3805-3807 (2013).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine-Trans-Cyclooctene+Ligation+for+the+Rapid+Construction+of+18F+Labeled+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Tetrazine-Trans-Cyclooctene Ligation for the Rapid Construction of 18F Labeled Probes.</a> Chem. Commun. 46 (42), 8043(2010).</li>
<li>Nichols, B., Qin, Z., Yang, J., Vera, D. R., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((68Ga+Chelating+Bioorthogonal+Tetrazine+Polymers+for+the+Multistep+Labeling+of+Cancer+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">68Ga Chelating Bioorthogonal Tetrazine Polymers for the Multistep Labeling of Cancer Biomarkers.</a> Chem. Commun. 50 (40), 5215-5217 (2014).</li>
<li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Pretargeted+PET+Imaging+Strategy+Based+on+Bioorthogonal+Diels-Alder+Click+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">A Pretargeted PET Imaging Strategy Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry.</a> J. Nucl. Med. 54 (8), 1389-1396 (2013).</li>
<li>García, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S096808961630061X">99mTc-Bioorthogonal Click Chemistry Reagent for In Vivo Pretargeted Imaging.</a> Bioorg. Med. Chem. 24 (6), 1209-1215 (2016).</li>
<li>Russell, R. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphosphonates%3A+The+First+40+Years%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Bisphosphonates: The First 40 Years.</a> Bone. 49 (1), 2-19 (2011).</li>
<li>Yazdani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bone-Seeking+Trans-Cyclooctene+for+Pretargeting+and+Bioorthogonal+Chemistry%3A+A+Proof+of+Concept+Study+Using+99mTc+and+177Lu-Labeled+Tetrazines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">A Bone-Seeking Trans-Cyclooctene for Pretargeting and Bioorthogonal Chemistry: A Proof of Concept Study Using 99mTc and 177Lu-Labeled Tetrazines.</a> J. Med. Chem. , (2016).</li>
<li>Alberto, R., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja980745t">A Novel Organometallic Aqua Complex of Technetium for the Labeling of Biomolecules: Synthesis of [99mTc(OH2)3(CO)3]+ from [99mTcO4]- in Aqueous Solution and its Reaction with a Bifunctional Ligand.</a> J. Am. Chem. Soc. 120 (31), 7987-7988 (1998).</li>
<li>Alberto, R., Ortner, K., Wheatley, N., Schibli, R., Schubiger, A. P. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja003932b">Synthesis and properties of boranocarbonate: A convenient in situ CO source for the aqueous preparation of [99mTc(OH2)3(CO)3.</a> J. Am. Chem. Soc. 123 (13), 3135-3136 (2001).</li>
<li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960894X12011584">Synthesis and SAR of 99mTc/Re-labeled Small Molecule Prostate Specific Membrane Antigen Inhibitors with Novel Polar Chelates.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1557-1563 (2013).</li>
<li>Maresca, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0020169312001764">Small Molecule Inhibitors of PSMA Incorporating Technetium-99m for Imaging Prostate Cancer: Effects of Chelate Design on Pharmacokinetics.</a> Inorg. Chim. Acta. 389, 168-175 (2012).</li>
<li>Bartholomä, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+Mode+of+Action+of+Re%28CO%293+Thymidine+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Insight into the Mode of Action of Re(CO)3 Thymidine Complexes.</a> ChemMedChem. 5 (9), 1513-1529 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Une collection de tridentes chélates tétrazine liés de différentes polarités a été préparé, et l&#39;utilité de leurs complexes 99m Tc dans la réaction IEDDA avec un dérivé TCO in vivo a été évaluée. Un procédé de marquage 99mTc efficace et reproductible a été développée pendant cinq tétrazine chelates, où la concentration de ligand était de 10 -3 M. L&#39;étape de marquage est suivie par une déprotection des groupes butyle T- (pour les composés 2-5). L...

99m Tc reste le radio - isotope dominant utilisé en médecine nucléaire diagnostique, avec plus de 50 millions de procédures d&#39;imagerie effectuées par an dans le monde entier 1, 2, 3. La majorité des agents 99m Tc utilisés cliniquement sont radiopharmaceutiques de type perfusion. Il y a un nombre limité de composés activement ciblés dans lesquels 99m Tc est dirigé pour lier un biomarqueur spécifique à travers la ligature à une construction de ciblage. La création de 99m ciblée radiopharmaceutiques Tc est souvent entravée par l&#39;influence de 99m complexes Tc-ligand sur la capacité de la molécule de ciblage pour lier le biomarqueur d&#39;intérêt, ou les isotopes demi-vie est pas assez long pour une utilisation avec des biomolécules de poids moléculaire élevé telles que des anticorps. Ce dernier nécessite généralement plusieurs jours avant que les images sont acquises pour que la biomolécule pour effacer de la non-cible tiss<html> ues. Pré-ciblage propose une approche alternative pour surmonter ces défis. Pré-ciblage combinée avec la chimie bioorthogonal a été montré pour être un moyen efficace de développer de nouvelles sondes d&#39;imagerie moléculaire à la fois pour la fluorescence et la radio-imagerie 4, 5, 6, 7, 8. La réaction de la demande d&#39;électrons inverse de Diels-Alder (IEDDA) entre 1,2,4,5-tétrazine (Tz) et -cyclooctene trans (TCO) , ses dérivés, comme le montre la figure 1, a été montré comme étant particulièrement efficace 6. La réaction IEDDA avec ces composants peut présenter une cinétique rapide dans du PBS (k 2 ≈ 6.000 M -1 s -1) et une sélectivité élevée, le rendant idéal pour des applications in vivo pré-ciblage 9, 10. e_content &quot;&gt; L&#39;approche la plus couramment utilisée consiste à administrer un vecteur de ciblage TCO dérivés et à la suite d&#39; une période de retard suffisant, un tétrazine radiomarqué est administré. tétrazines radiomarqués sur la base de 11 C, 18 F, 64 Cu, 89 Zr, et 111 en ont été rapporté 11, 12, 13, 14, 15. en revanche, il n&#39;y a qu&#39;un seul rapport d&#39;une 99mTc marqué Tz, qui a été préparé en utilisant un ligand de type HYNIC nécessitant l&#39;utilisation de co-ligands pour éviter la liaison aux protéines et à la dégradation in vivo , 16. a titre d&#39;alternative, nous rapportons ici la synthèse de 99mTc (I) marqué tétrazines en utilisant une famille de ligands qui forment des complexes stables avec un tridentate [99mTc (CO) 3] + noyau. Figure 1: La réaction IEDDA bioorthogonal entre tétrazine et -cyclooctene trans. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55188/55188fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> La famille de ligands préparés contiennent des chélates tridentés qui varient en polarité et de la nature du groupe de liaison entre la région de liaison métallique et la Tz (figure 2). L&#39;objectif était d&#39;identifier un 99m Tc-tétrazine construire qui pourrait efficacement localiser et de réagir avec des sites TCO marqués in vivo et rapidement clair lorsqu&#39;ils ne sont pas liés, afin de produire une valeur cible élevée à non-cible ratios. Pour tester les ligands, un TCO-dérivé d&#39;un bisphosphonate (TCO-BP) a été utilisé 17. Nous avons montré précédemment que le TCO-BP se localise dans les zones du métabolisme osseux actif et peut réagir avectétrazines radiomarqués in vivo 18. Il est un réactif commode pour tester de nouveaux tétrazines, car il peut être préparé en une seule étape et les expériences peuvent être effectuées chez des souris normales lorsque la localisation a lieu principalement au niveau des articulations (genoux et des épaules).

<table><tbody><tr><td>Gaz argon</td><td>Alphagaz</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>EMD Millipore</td><td>106395</td><td>---</td></tr><tr><td>Na2B4O7&#183 ; 10H2O</td><td>Anachemia</td><td>S9640</td><td>---</td></tr><tr><td>KNaC4H4O6&#183 ; 4H2O</td><td>Anachemie</td><td>217255</td><td>---</td></tr><tr><td>Technelite 99mTc générateur</td><td>Lantheus medical imaging</td><td>---</td><td>Source of 99mTcO4-</td></tr><tr><td>0,9 % Saline</td><td>Lantheus medical imaging</td><td>---</td><td>To élue</td></tr><tr><td>generator 1 M HCl</td><td>Lab Chem</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>ACN</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Millipore H2O</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Barnstead Nanopure</td><td>---</td></tr><tr><td>DCM</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>TFA</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pH 7.4 1x</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td>---</td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8047</td><td>---</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>CDMV</td><td>108737</td><td>Fournisseur : Pompe binaire Fresenius Kabi Animal Health</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Waters</td><td>1525, Détecteur à réseau de photodiodes 2998, E-SAT/IN, Détecteur PMT Bioscan Flowcount (article # 15590)</td><td>---</td></tr><tr><td>Colonne HPLC pour l’analyse et la purification des composés 2-4</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4435-E0</td><td>Gemini®® 5 & micro ; m C18 110&nbsp ; Colonne LC 250 x 4,6 mm</td></tr><tr><td>Colonne HPLC pour l’analyse et la purification des composés 1 et 5</td><td>Eaux&nbsp ;</td><td>186003115</td><td>XBridge BEH C18 Colonne, 130 & Aring ;, 5 & micro ; m, réacteur à micro-ondes de 4,6 mm x 100 mm</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Biotage&nbsp ;</td><td>Initiateur 8</td><td>---</td></tr><tr><td>Biotage V10 Évaporateur</td><td>Biotage&nbsp ;</td><td>Série # V1041</td><td>---</td></tr><tr><td>Calibrateur de dose</td><td>Capintec, Inc.&nbsp ;</td><td>CRC-25R</td><td>---</td></tr><tr><td>Compteur gamma</td><td>Perkin Elmer</td><td>Wizard 1470 Compteur gamma automatique</td><td>---</td></tr><tr><td>Balance pour salle d’animaux&nbsp ;</td><td>Mettler Toledo</td><td>XP105 Delta Range</td><td>---</td></tr><tr><td>Flacons pour micro-ondes&nbsp ;</td><td>Biotage&nbsp ;</td><td>355629</td><td>0,5 à 2 mL</td></tr></tbody></table>

préparation et évaluation des<sup&gt; 99m</sup&gt; tc marquée tridenté chélates de pré-ciblage utilisant bioorthogonal chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Le pré-ciblage combiné à la chimie bioorthogonale apparaît comme un moyen efficace de créer de nouveaux produits radiopharmaceutiques. Parmi les méthodes disponibles, la cycloaddition IEDDA (Editon Demand Diels-Alder inverse) entre des tétrazines radiomarquées et un trans-cyclooctène (TCO) lié à une biomolécule s’est avérée être une approche bioorthogonale très efficace pour imager des cibles biologiques spécifiques. Malgré le fait que le technétium-99m reste l’isotope le plus largement utilisé en médecine nucléaire diagnostique, il existe une pénurie de méthodes pour préparer des tétrazines marquées au 99mTc. Nous rapportons ici la préparation d’une famille de dérivés tridentés-chélates-tétrazine et de leurs complexes Tc(I). Ces composés jusqu’alors inconnus ont été radiomarqués avec du 99mTc à l’aide d’une méthode assistée par micro-ondes avec un rendement radiochimique de 31 % à 83 %. Les produits sont stables dans les produits salins et PBS et réagissent rapidement avec les dérivés du TCO in vitro. Leurs capacités de pré-ciblage in vivo ont été démontrées à l’aide d’un dérivé du TCO-bisphosphonate (TCO-BP) qui se localise dans les régions du métabolisme osseux actif ou des blessures. Dans les études sur les murins, les tétrazines de Tc à 99 mont montré des concentrations d’activité élevées dans les articulations du genou et de l’épaule, ce qui n’a pas été observé lorsque des expériences ont été réalisées en l’absence de TCO-BP. L’absorption globale dans les organes non cibles et la pharmacocinétique variaient considérablement en fonction de la nature de l’agent de liaison et de la polarité du chélate.

Les ligands ont été synthétisés en utilisant différents agents de liaison et des chélateurs via une stratégie simple d&#39;amination réductrice (figure 2), suivie par le couplage du produit à un tétrazine disponible dans le commerce 22, 23. Le radiomarquage a été réalisé en utilisant la même méthode que pour tous les composés et a été hautement reproductible. Le processus a été optimisé en faisant varier le pH, l...

Ici, nous décrivons un protocole de radiomarquage et de test in vivo de dérivés tridentés de chélate-tétrazine de Tc(I) 99mpour le pré-ciblage et la chimie bioorthogonale.

Préparation et évaluation des<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc marquée tridenté chélates de pré-ciblage utilisant Bioorthogonal Chemistry

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...

L'objectif général de cette procédure est de produire des tétrazines marquées au technétium-99m pour l'imagerie par pré-ciblage utilisant une chimie bioorthogonale avec des biomolécules modifiées par du cyclooctène trans comme vecteurs de ciblage. Cette méthode fournit une plateforme importante et nouvelle pour le développement de radio-pharmaceutiques innovants. Grâce au pré-ciblage, les complexes de technétium décrits ici peuvent être utilisés pour imager une grande variété d'organes, de tissus et de biomarqueurs.Cette technique présente l'avantage de fournir une méthode étape par étape robuste pour produire des tétrazines marquées radioactivement au technétium-99m, l'isotope médical le plus utilisé en médecine diagnostique. Cette technique peut être utilisée avec différents vecteurs ciblés, notamment des petites molécules et des anticorps. Elle peut également être utilisée en radiothérapie en remplaçant le technétium par des isotopes du rhénium émetteurs de particules bêta.La partie des procédures animales sera démontrée par Nancy Janzen, technicienne en biologie dans notre laboratoire. Pour commencer la procédure de marquage radioactif, introduire dans un flacon de micro-ondes huit milligrammes de boranocarbonate de potassium, 15 milligrammes de carbonate de sodium, 20 milligrammes de tétraborate de sodium décahydraté et 25 milligrammes de tartrate de potassium et de sodium tétrahydraté. Purger le flacon avec du gaz argon pendant 10 minutes.Ensuite, ajoutez quatre millilitres de pertechnétate de technétium-99m dans du sérum physiologique à 0,9 % ayant une activité de 1 110 mégabecquerels dans le flacon. Chargez le mélange réactionnel dans un réacteur à micro-ondes et agitez pendant 10 secondes. Puis, chauffez le mélange à 110 degrés Celsius pendant 3,5 minutes afin d'obtenir le cation triaqua tricarbonyle de technétium-99m.Ajoutez environ 400 microlitres d'acide chlorhydrique à une molaire pour ajuster le pH de la solution entre 3,5 et 4. Ensuite, pour chaque ligand tétrazine, dissolvez deux milligrammes de ligand dans 250 microlitres de méthanol. Ajoutez 250 microlitres du complexe de technétium-99m ayant une activité de 74 mégabecquerels à chaque solution de ligand.Chauffer le mélange dans un réacteur à micro-ondes à 60 degrés Celsius pendant 20 minutes. Pour les ligands tétrazine portant des groupes protecteurs t-butyle, transférer la solution d’un flacon pour micro-ondes vers un flacon scintillation de 20 millilitres, puis évaporer le solvant et redissoudre chaque complexe dans un millilitre d’une solution volume à volume un pour un de dichlorométhane et d’acide trifluoroacétique. Ensuite, transférer la solution dans un flacon pour micro-ondes et chauffer ces complexes dans un réacteur à micro-ondes à 60 degrés Celsius pendant six à dix minutes afin de déprotéger les ligands.Refroidir les complexes à température ambiante, puis évaporer le solvant. Redissoudre les résidus dans 500 microlitres d'une solution aqueuse à un pour un d'acétonitrile ou de méthanol et d'eau avant de procéder à la purification par HPLC. Utiliser une HPLC en phase inverse C18 pour purifier chaque complexe tétrazine radio-marqué avec un gradient d'élution de 30 à 70, puis de 40 à 60 d'acétonitrile dans l'eau sur 20 minutes, en présence d'acide trifluoroacétique à 0,1 % dans l'éluant tout au long du processus.Recueillir le produit purifié lorsque celui-ci apparaît en sortie dans le tracé gamma. Ensuite, effectuer une co-injection de chaque complexe marqué avec une solution contenant 0,125 milligramme du complexe radium-tétrazine correspondant dans un mélange d’eau et de méthanol à 20 %. Comparer les temps de rétention du pic du complexe de rhénium dans le tracé UV et du pic du complexe de technétium dans le tracé gamma afin de confirmer l'identité du pic gamma.Éliminer le solvant de chaque complexe purifié de technétium-tétrazine. Formuler chaque complexe à une concentration de 7,4 kilobecquerels par microlitre dans une solution saline tamponnée au phosphate contenant 0,5 % d'albumine sérique bovine et 0,01 % de polysorbate 80. Pour chaque souris, prélever dans une seringue 100 microlitres d'une solution de dérivé TCOPB à cinq microgrammes par microlitre en solution saline afin de préparer une dose de 20 milligrammes par kilogramme.Connectez une aiguille de calibre 30 à la seringue de dosage. Placez la souris dans un dispositif de contention physique. Repérez les veines situées sur la surface latérale de la queue à environ deux centimètres de l'extrémité, puis nettoyez la zone avec un coton-tige imbibé d'alcool.Insérez l'aiguille de la seringue à un angle faible, parallèlement à la veine. Injectez lentement le dérivé de TCOBP. Retirez l'aiguille et appliquez un tampon de gaze propre avec une légère pression sur le site d'injection jusqu'à l'arrêt du saignement.Une heure après l'injection du dérivé TCOBP, administrer une dose de 100 microlitres du complexe de tétrazine marqué au technétium-99m souhaité, ayant une activité d'environ 0,74 mégabecquerel, par injection intraveineuse dans la queue. Utiliser un calibrateur de dose pour mesurer l'activité d'un échantillon témoin de 100 microlitres du complexe de technétium au moment de l'injection. Conserver l'échantillon témoin pour des mesures ultérieures.Anesthésiez la souris avec un mélange gazeux contenant 3 % d'isoflurane et 2 % d'oxygène six heures après l'injection. Placez la souris sur le dos, avec le nez dans le cône nasal pour maintenir l'anesthésie, puis localisez le processus xiphoïde. Connectez une aiguille de calibre 25 à une seringue prétraitée avec de l'héparine.Insérez l'aiguille sous le processus xiphoïde selon un angle de 20 degrés, légèrement à gauche de la ligne médiane. Une fois l'aiguille entièrement insérée, retirez lentement le piston pour vérifier la présence de sang dans l'embase de l'aiguille, ce qui confirme une ponction cardiaque réussie. Ajustez l'aiguille au besoin.Une fois que le cœur a été perforé, aspirez lentement un millilitre de sang dans la seringue. Transférez l'échantillon de sang dans un tube de comptage préalablement pesé. Euthanasiez la souris par dislocation cervicale pendant l'anesthésie.Placer l'animal euthanasié dans un sac en plastique et mesurer l'activité corporelle totale à l'aide d'un calibrateur de dose. Ensuite, prélever les os du genou et de l'épaule, la vésicule biliaire, les reins, le foie, la thyroïde et la trachée, ainsi que la queue. Prélever également l'estomac, les intestins grêles, les intestins épais et le caecum, ainsi que la vessie urinaire, avec leur contenu.Rincez le sang de tous les tissus collectés, à l'exception des vésicules biliaire et urinaire, à l'aide de solution saline tamponnée au phosphate. Séchez les tissus par tamponnement, puis placez chaque tissu dans un tube de comptage préalablement pesé. Mesurez l'activité résiduelle du cadavre.Pesez chaque échantillon de tissu et calculez la masse du tissu seul. Utilisez un compteur gamma à détecteurs multiples pour mesurer l'activité d'un aliquot de cinq microlitres de l'échantillon test du complexe de technétium. À l'aide de la valeur obtenue en comptes par minute et de l'activité mesurée au moment de l'injection, calculez un facteur de conversion.Mesurez l'activité de chaque échantillon de tissu et de fluide à l'aide du détecteur gamma. Convertissez les valeurs en microcurie et normalisez chaque valeur par rapport au poids de l'organe afin de déterminer le pourcentage de dose injectée par gramme de tissu. Répétez ce processus avec des souris supplémentaires n'ayant pas reçu l'injection du dérivé TCOPB, en tant que série de contrôle négatif.À l'aide de cette méthode, cinq complexes de tétrazine, différenciant par leurs combinaisons d'éléments de liaison et de leaders-clés, ont été marqués au technétium-99m. Un dérivé de TCOPB, qui se localise dans les régions osseuses présentant un fort renouvellement du calcium, a été utilisé pour pré-cibler les articulations de l'épaule et du genou chez la souris. Les rapports entre le pourcentage de dose injectée par gramme de tissu osseux et sanguin ont été calculés pour chaque composé de tétrazine.Les cinq composés ont été rapidement éliminés du sang et se sont dirigés vers l'os, indiquant que la réaction de couplage bioorthogonale sélective entre les composés de tétrazine et le dérivé TCOBP s'était produite in vivo. Le composé trois a présenté la meilleure combinaison d'adressage et d'élimination sanguine. Des expériences contrôles négatives ont indiqué que les complexes de tétrazine marqués au radionucléide ne se localisaient pas de manière significative dans l'os en l'absence du dérivé TCOBP.Par exemple, lorsque le dérivé TCOBP n'avait pas été administré, le composé deux présentait des concentrations élevées dans la vésicule biliaire et les intestins, mais très faibles dans l'os. Une grande variation a été observée concernant la localisation tissulaire chez les souris ayant reçu le dérivé TCOBP parmi les cinq composés testés. Par exemple, très peu du composé trois était détecté dans le gros intestin, le foie ou l'urine et la vessie par rapport aux autres complexes, tandis qu'une quantité nettement plus importante du composé trois était présente dans l'os.Une fois maîtrisée, la technique de marquage décrite ici peut être réalisée de bout en bout en moins de deux heures, si elle est effectuée correctement. Lors de la mise en œuvre de cette technique, il est important de s'assurer que tous les réactifs sont pesés avec précision et que les sels sont purgés à l'argon avant leur ajout à la solution de technétium. Il est également essentiel que le pH de la solution de technétium soit ajusté à 3,5-4 avant l'ajout du ligand tétrazine.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer et purifier des tétrazines marquées au technétium et comment elles peuvent être utilisées pour créer de nouveaux radio-pharmaceutiques grâce au ciblage préalable et à la chimie bioorthogonale. N’oubliez pas de prendre les précautions appropriées lorsque vous travaillez avec des matières radioactives, comme identifier le type de rayonnement émis et savoir comment mieux protéger et manipuler les échantillons.

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