Name: Voorbereiding en evaluatie van 99m Tc-gelabelde tridentaat Chelates voor Pre-targeting Met behulp Bioorthogonal Chemistry (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Leer de radiolabeling van tetrazine-derivaten met technetium-99m voor pre-targeting in bioorthogonale chemie. Deze methode maakt beeldvorming van organen en weefsels mogelijk en ondersteunt de ontwikkeling van nieuwe radiotherapeutica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door onderzoekssubsidiefinanciering van de Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) van Canada, het Ontario Institute for Cancer Research (OICR, #P.SI.015.8), en de Canadian Cancer Society (CCS, #703857). De auteurs erkennen de bijdragen van Dr. Denis Snider die assistentie verleende bij het voorbereiden van het manuscript.

Animal studies werden goedgekeurd door de Animal Research Ethics Board van de McMaster University in overeenstemming met de Canadese Raad over Animal Care (CCAC) richtlijnen. 1. Radioactief merken van Tz-tridentaat liganden met 99mTc VOORZICHTIG: De volgende procedures vereisen het gebruik van radioactieve verbindingen. Werk mag alleen worden gedaan in een erkend laboratorium met de naleving van veiligheid en milieu voorschriften. Magnetron moeten uitgevoerd worden in een magnetron speciaal voor chemische synthese. <ol><li> Synthese van [99mTc (CO) 3 (H2O) 3] + 19, 20 <ol><li> In een magnetron flesje combineren 8 mg K2 [BH 3 CO 2], 15 mg Na 2 CO 3, 20 mg Na 2 B 4 O 7 · 10H 2 O en 25 mg KOCO [CH (OH)]2 COONa · 4H 2 O. Purge het flesje gedurende 10 minuten met argon gas. </li><li> Voeg 4 ml 99m TcO 4 - (~ 1100 MBq, ~ 30 mCi) in 0,9% zoutoplossing aan het flesje. </li><li> Verwarm de reactie in een magnetron gedurende 3,5 minuten bij 110 ° C na 10 s roeren om grondig mengen van de reagentia te garanderen. </li><li> Stel de pH van de oplossing 3,5-4 gebruik ~ 400 pi van 1 M HCl. Controleren met behulp van pH-papier. </li></ol></li><li> Radioactief merken van tetrazine liganden 1-5 <ol><li> Los 2 mg van elk ligand (verbindingen 1-5) in 250 ul MeOH 21. </li><li> Voeg 250 ul van [99mTc (CO) 3 (H2O) 3] + (~ 74 MBq, ~ 2 mCi) aan elke oplossing. </li><li> Verwarm het reactiemengsel in de magnetron gedurende 20 minuten bij 60 ° C. LET OP: Deze stap was identiek voor alle 5 tetrazine. </li><li> Voor verbindingen 2- 5, damp het oplosmiddel en opnieuw dissolve de resulterende producten in 1 ml 1: 1 v / v DCM: TFA. </li><li> Verwarm de opgeloste reactieproducten (2-5) bij 60 ° C in een magnetron gedurende 6 min (2-4) of 10 min (5). </li><li> Na afkoelen tot kamertemperatuur, damp het oplosmiddel met behulp van een verdamper (36 ° C, 8 mbar, 3 min, 6000 rpm) en los het gedroogde verbinding in 1: 1 ACN: H 2 O of 1: 1 MeOH: H2O, voorafgaand aan HPLC zuivering. </li><li> Zuiver het 99mTc-gelabelde verbindingen (1-5), met inbegrip van het scheiden van het gemerkte product uit ongelabelde ligand tetrazine, middels HPLC (C-18 omgekeerde fase). Typisch gebruik van een elutiegradiënt van 30:70 ACN: H2O (beide met 0,1% TFA) tot 40:60 ACN: H2O gedurende 20 min (18 min) en een analytische 4,6 x 100 mm kolom C 18. Gebruik beide UV (254 nm) en gamma detectie. <ol><li> Neem een ​​klein monster van elk gemerkt product en vergelijk de HPLC retentietijd met die van een co-injecteerd, niet-radioactieve, Re-gemerkte standaard (0,125 mg in 20% methanol-H 2 O). De-Re gemerkte standaard wordt in de UV HPLC spoor en elueren tegelijkertijd de 99mTc-gelabelde verbinding in het γ-HPLC trace. Deze co-injectie toont pieken bij vergelijkbare retentietijden bevestigt de identiteit van de 99mTc-gelabelde verbinding. </li></ol></li><li> Verdamp het oplosmiddel van HPLC fracties met een verdamper (36 ° C, 8 mbar, 3 min, 6000 rpm). </li><li> Formuleren de gezuiverde verbinding in een concentratie van 7,4 kBq / ul in PBS, bevattende 0,5% BSA en 0,01% Tween-80. </li><li> Ter controle van de gemerkte verbindingen stabiel Voer een in vitro stabiliteitsonderzoek. Incubeer de geformuleerde verbinding bij 37 ° C gedurende 1, 4 en 6 uur, het injecteren van een kleine hoeveelheid (3,7 MBq) van het mengsel op HPLC op elk tijdstip om de stabiliteit te beoordelen. </li></ol></li></ol> 2. Pre-gerichte Bio-distributie Studies <ol><li&gt; Voorbereiding van de dieren <ol><li> Gebruik 7-9 weken oude, vrouwelijke Balb / c muizen (n = 3) toedienen TCO-BP geformuleerd in een zoutoplossing (20 mg / kg) (5 ug / ul) via-staartader injectie. </li><li> Plaats de muis in fysieke fixatie apparaat, en identificeren van de aderen op de zijvlakken van de staart en veeg met een alcoholdoekje. Op ongeveer 2 cm van het uiteinde van de staart, plaats een 30-gauge naald onder een kleine hoek, evenwijdig aan de ader. Langzaam op de zuiger om te injecteren, verwijder de naald en breng schoon gaasje spons op de injectieplaats met een lichte druk totdat het bloeden stopt. </li><li> Op 1 uur na de injectie van TCO-BP, beheren ~ 0,74 MBq (20 uCi) van 99m Tc-tetrazine geformuleerd in 100 ul van 0,5% BSA, 0,01% Tween-80 in PBS, via-staart ader injectie. </li></ol></li><li> Bio-distributie studies <ol><li> Op het gewenste tijdstip (t = 6 uur), verdoven de muizen middels 3% isofluraan en 2% zuurstof gasmengsel. Aantonen dat er een aane snufje terugtrekking van de verdoofde muis om te zorgen dat ze onder chirurgische vlak van anesthesie. </li><li> Verzamelen van bloed (1 ml) via hartpunctie met een injectiespuit voorbehandeld met heparine. Plaats de muis op zijn rug met de neus in de neuskegel voor verdere anesthesie en zoek de zwaardvormig proces op het dier. <ol><li> Plaats een 25 G naald, enigszins links van middellijn van het dier onder de processus xiphoideus, bij een 20 ° hoek. Steek de naald, en langzaam terug te trekken op de zuiger om bloed te zien in de naald hub als het hart werd doorboord. Iets passen de naald terwijl u de zuiger, indien nodig, naar het hart doorboren. Langzaam trekken bloed in de spuit. </li></ol></li><li> Euthanaseren het dier door cervicale dislocatie, terwijl onder verdoving. </li><li> Plaats elk dier in een plastic zak en gebruik een calibrator (99mTc instelling) op het geheel activiteit te meten. </li><li> Verzamel de volgende weefsels en vloeistoffen in de pre-wegened telbuizen: bloed, bot (knie en schouder), galblaas, nieren, lever, maag (met inhoud), dunne darm (met inhoud), dikke darm en blindedarm (met inhoud), de schildklier en luchtpijp, urineblaas met urine en staart. </li><li> Spoel de juiste weefsels (met uitzondering van bloed, galblaas en urineblaas) in PBS om bloed te verwijderen en dep droog is voordat u de weefsels in juiste telbuizen. </li><li> Plaats dier karkas in een plastic zak en meet resterende hele lichaam activiteit met een dosiskalibrator. </li><li> Weeg elke buis bevattende een weefselmonster. Trek aanvankelijke gewicht van de buis om de massa van het weefsel te verkrijgen. </li><li> Gebruik een calibrator (99mTc instelling) tot de hoeveelheid activiteit in een monster (100 pi) op het moment van injectie voor elke muis gemeten. Opmerking: Dit monster is gelijk aan het injectievolume, waardoor de telling activiteit op het moment van injectie. </li><li> Op het moment van meting weefsel, eenliquot 5 pi van het monster eerder gebruikte. Gebruik een multi-detector gammateller (99m Tc instelling) en tel tot de telling per minuut (CPM) te verkrijgen voor de 5 pi monster. </li><li> Gebruik de twee waarden verkregen in 2.2.9 en 2.2.10 van de activiteit en CPM relatie met vergelijking 1 tot een omrekeningsfactor (CPM uCi -1) te verkrijgen berekenen. (1) <img alt="vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/55188/55188eq1.jpg" /></li><li> Gebruik de gammateller om de hoeveelheid radioactiviteit in elk weefsel of vloeistofmonster. </li><li> Gebruik formule 1 om de hoeveelheid activiteit in elk weefsel of vloeistof op het tijdstip van de meting ten opzichte van het totale geïnjecteerde dosis te berekenen. Deze waarde wordt vervolgens genormaliseerd door orgaangewicht en gerapporteerd als percentage geïnjecteerde dosis per gram (dwz% ID / g) weefsel. </li><li> Volg stappen 2.1.2 tot 2.2.13 een negatieve controle experiment met de 99mTc-gelabelde liganden tetrazine in de afwezigheid opce van TCO-BP. Offer muizen (n = 3) op 0,5, 1, 4 en 6 uur na de injectie en het verkrijgen van weefsel of vloeistof zoals hierboven beschreven. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Jurisson, S. S., Lydon, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+Technetium+Small+Molecule+Radiopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Potential Technetium Small Molecule Radiopharmaceuticals.</a> Chem. Rev. 99 (9), 2205-2218 (1999).</li>
<li>Kluba, C. A., Mindt, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click-to-chelate%3A+Development+of+Technetium+and+Rhenium-Tricarbonyl+Labeled+Radiopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Click-to-chelate: Development of Technetium and Rhenium-Tricarbonyl Labeled Radiopharmaceuticals.</a> Molecules. 18, 3206-3226 (2013).</li>
<li>Amato, I. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cen-v087n036.p058">Nuclear Medicines Conundrum.</a> Chem. Eng. News. 87 (36), 58-70 (2009).</li>
<li>Hnatowich, D. J., Virzi, F., Rusckowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigations+of+Avidin+and+Biotin+for+Imaging+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">Investigations of Avidin and Biotin for Imaging Applications.</a> J. Nucl. Med. 28 (8), 1294-1302 (1987).</li>
<li>Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine+Ligation%3A+Fast+Bioconjugation+Based+on+Inverse-Electron-Demand+Diels-Alder+Reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactivity.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (41), 13518-13519 (2008).</li>
<li>Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine-Based+Cycloadditions%3A+Application+to+Pretargeted+Live+Cell+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Tetrazine-Based Cycloadditions: Application to Pretargeted Live Cell Imaging.</a> Bioconjugate Chem. 19 (12), 2297-2299 (2008).</li>
<li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Chemistry+for+Pretargeted+Tumor+Imaging+in+Live+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.%2C+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">In Vivo Chemistry for Pretargeted Tumor Imaging in Live Mice.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 49 (19), 3375-3378 (2010).</li>
<li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+Pretargeted+Strategy+for+the+PET+Imaging+of+Colorectal+Carcinoma+via+the+Modulation+of+Radioligand+Pharmacokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Optimization of a Pretargeted Strategy for the PET Imaging of Colorectal Carcinoma via the Modulation of Radioligand Pharmacokinetics.</a> Mol. Pharmaceutics. 12 (10), 3575-3587 (2015).</li>
<li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Reactive+trans-Cyclooctene+Tags+with+Improved+Stability+for+Diels-Alder+Chemistry+in+Living+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Highly Reactive trans-Cyclooctene Tags with Improved Stability for Diels-Alder Chemistry in Living Systems.</a> Bioconjugate Chem. 24 (7), 1210-1217 (2013).</li>
<li>Rossin, R., Robillard, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretargeted+Imaging+Using+Bioorthogonal+Chemistry+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pretargeted Imaging Using Bioorthogonal Chemistry in Mice.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 21, 161-169 (2014).</li>
<li>Denk, C., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.201404277/abstract">Development of a 18F-Labeled Tetrazine with Favorable Pharmacokinetics for Bioorthogonal PET Imaging.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 53 (36), 9655-9659 (2014).</li>
<li>Herth, M. M., Andersen, V. L., Lehel, S., Madsen, J., Knudsen, G. M., Kristensen, J. L. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2013/CC/c3cc41027g#!divAbstract">Development of a 11C-labeled Tetrazine for Rapid Tetrazine-Trans-Cyclooctene Ligation.</a> Chem. Commun. 49 (36), 3805-3807 (2013).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine-Trans-Cyclooctene+Ligation+for+the+Rapid+Construction+of+18F+Labeled+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Tetrazine-Trans-Cyclooctene Ligation for the Rapid Construction of 18F Labeled Probes.</a> Chem. Commun. 46 (42), 8043(2010).</li>
<li>Nichols, B., Qin, Z., Yang, J., Vera, D. R., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((68Ga+Chelating+Bioorthogonal+Tetrazine+Polymers+for+the+Multistep+Labeling+of+Cancer+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">68Ga Chelating Bioorthogonal Tetrazine Polymers for the Multistep Labeling of Cancer Biomarkers.</a> Chem. Commun. 50 (40), 5215-5217 (2014).</li>
<li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Pretargeted+PET+Imaging+Strategy+Based+on+Bioorthogonal+Diels-Alder+Click+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">A Pretargeted PET Imaging Strategy Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry.</a> J. Nucl. Med. 54 (8), 1389-1396 (2013).</li>
<li>García, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S096808961630061X">99mTc-Bioorthogonal Click Chemistry Reagent for In Vivo Pretargeted Imaging.</a> Bioorg. Med. Chem. 24 (6), 1209-1215 (2016).</li>
<li>Russell, R. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphosphonates%3A+The+First+40+Years%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Bisphosphonates: The First 40 Years.</a> Bone. 49 (1), 2-19 (2011).</li>
<li>Yazdani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bone-Seeking+Trans-Cyclooctene+for+Pretargeting+and+Bioorthogonal+Chemistry%3A+A+Proof+of+Concept+Study+Using+99mTc+and+177Lu-Labeled+Tetrazines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">A Bone-Seeking Trans-Cyclooctene for Pretargeting and Bioorthogonal Chemistry: A Proof of Concept Study Using 99mTc and 177Lu-Labeled Tetrazines.</a> J. Med. Chem. , (2016).</li>
<li>Alberto, R., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja980745t">A Novel Organometallic Aqua Complex of Technetium for the Labeling of Biomolecules: Synthesis of [99mTc(OH2)3(CO)3]+ from [99mTcO4]- in Aqueous Solution and its Reaction with a Bifunctional Ligand.</a> J. Am. Chem. Soc. 120 (31), 7987-7988 (1998).</li>
<li>Alberto, R., Ortner, K., Wheatley, N., Schibli, R., Schubiger, A. P. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja003932b">Synthesis and properties of boranocarbonate: A convenient in situ CO source for the aqueous preparation of [99mTc(OH2)3(CO)3.</a> J. Am. Chem. Soc. 123 (13), 3135-3136 (2001).</li>
<li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960894X12011584">Synthesis and SAR of 99mTc/Re-labeled Small Molecule Prostate Specific Membrane Antigen Inhibitors with Novel Polar Chelates.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1557-1563 (2013).</li>
<li>Maresca, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0020169312001764">Small Molecule Inhibitors of PSMA Incorporating Technetium-99m for Imaging Prostate Cancer: Effects of Chelate Design on Pharmacokinetics.</a> Inorg. Chim. Acta. 389, 168-175 (2012).</li>
<li>Bartholomä, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+Mode+of+Action+of+Re%28CO%293+Thymidine+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Insight into the Mode of Action of Re(CO)3 Thymidine Complexes.</a> ChemMedChem. 5 (9), 1513-1529 (2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Een verzameling van gekoppelde tetrazine tridentaat chelaten van verschillende polariteiten bereid en het nut van de 99mTc complexen in de IEDDA reactie met een TCO derivaat in vivo onderzocht. Een effectief en reproduceerbaar Tc 99m labeling methode ontwikkeld vijf tetrazine-chelaten, waarbij het ligand concentratie 10 -3 M. Het labeling stap werd gevolgd door ontscherming van t-butylgroepen (voor verbindingen 2-5). De hoge concentratie ligand werd geb...

99mTc radioisotoop nog steeds het meest gebruikt in de diagnostische nucleaire geneeskunde, met meer dan 50 miljoen beeldvormende procedures uitgevoerd per jaar wereldwijd 1, 2, 3. De meeste 99mTc middelen klinisch gebruikte soort perfusie radiofarmaca. Er zijn een beperkt aantal actief gerichte verbindingen waarin 99mTc is gericht op een specifieke biomerker ligatie tot binden aan een targeting construct. Ontwerp van gerichte 99mTc radiofarmaca wordt vaak belemmerd door de invloed van 99m Tc-ligand-complexen op het vermogen van de richtende molecule om de biomarker plaats binden, of isotopen halfwaardetijd te kort is voor gebruik met een hoger gewicht biomoleculen moleculair zoals antilichamen. Dit laatste vereist meestal enkele dagen voor afbeeldingen in volgorde worden verworven voor de biomolecuul te verwijderen uit non-target tiss<html> UES. Pre-targeting biedt een alternatieve benadering van deze uitdagingen te overwinnen. Pre-targeting gecombineerd met bioorthogonal chemie is aangetoond dat het een effectieve manier om nieuwe moleculaire beeldvorming probes voor zowel fluorescentie en radio-imaging 4, 5, 6, 7, 8 ontwikkelen. De inverse vraag elektron Diels-els (IEDDA) reactie tussen 1,2,4,5-tetrazine (Tz) en trans -cyclooctene (TCO) derivaten, zoals weergegeven in figuur 1, is bijzonder effectief gebleken 6 te zijn. De IEDDA reactie met deze componenten kunnen snel kinetiek vertonen in PBS (k 2 ≈ 6000 M -1 s -1) en hoge selectiviteit, waardoor het ideaal is voor in vivo pre-targeting toepassingen 9, 10. e_content &quot;&gt; De meest voorkomende aanpak omvat het toedienen van een TCO-afgeleide targeting vector en na een voldoende vertraging periode, is een radioactief tetrazine toegediend. Radioactief gemerkt tetrazine gebaseerd op 11 C, 18 F, 64 Cu, 89 Zr en 111 In zijn geweest meldde 11, 12, 13, 14, 15. daarentegen is er slechts een rapport van een 99mTc-gelabelde Tz, dat werd bereid onder toepassing van een HYNIC soort ligand die het gebruik van co-liganden voor eiwitbinding en afbraak in vivo voorkomen 16. Als alternatief beschrijven we hier de synthese van 99m Tc (I) gemerkt met een tetrazine familie van liganden die stabiele tridentate complexen vormen met een [99mTc (CO) 3] + kern. Figuur 1: De bioorthogonal IEDDA reactie tussen tetrazine en trans -cyclooctene. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55188/55188fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> De familie van liganden bevatten bereid drietandige chelaten die variëren in polariteit en de aard van de verbindingsgroep tussen het metaal en het bindingsgebied Tz (figuur 2). Het doel was om een 99mTc-tetrazine construeren die effectief kunnen lokaliseren en reageren met TCO-gelabelde plaatsen in vivo en snel duidelijk wanneer niet gebonden identificeren om hoge target-to-non-target-verhoudingen verkregen. De liganden te testen, een TCO-derivaat van een bisfosfonaat (TCO-BP) gebruikt 17. We hebben eerder aangetoond dat TCO-BP lokaliseert gebieden actieve botmetabolisme en kan reageren metradiolabeled tetrazine in vivo 18. Het is handig om nieuwe reagens tetrazine testen, omdat het kan worden bereid in een enkele stap en experimenten kunnen worden uitgevoerd bij normale muizen waarbij lokalisatie vindt voornamelijk plaats in de gewrichten (knieën en schouders).

<table><tbody><tr><td>Argon gas</td><td>Alphagaz</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>EMD Millipore</td><td>106395</td><td>---</td></tr><tr><td>Na2B4O7&#183;10H2O</td><td>Anachemia</td><td>S9640</td><td>---</td></tr><tr><td>KNaC4H4O6&#183;4H2O</td><td>Anachemia</td><td>217255</td><td>---</td></tr><tr><td>Technelite 99mTc generator</td><td>Lantheus medical imaging</td><td>---</td><td>Bron van 99mTcO4-</td></tr><tr><td>0.9% Saline</td><td>Lantheus medical imaging</td><td>---</td><td>Om de generator te elueren</td></tr><tr><td>1 M HCl</td><td>Lab Chem</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>ACN</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>HPLC kwaliteit</td></tr><tr><td>Millipore H2O</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Barnstead Nanopure</td><td>---</td></tr><tr><td>DCM</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>TFA</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pH 7.4 1x</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td>---</td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8047</td><td>---</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>CDMV</td><td>108737</td><td>Leverancier: Fresenius Kabi Animal Health</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Waters</td><td>1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (item # 15590)</td><td>---</td></tr><tr><td>HPLC kolom voor analyse en zuivering van verbindingen 2-4</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4435-E0</td><td>Gemini&reg; 5 &micro;m C18 110&nbsp;&Aring;, LC kolom 250 x 4.6 mm</td></tr><tr><td>HPLC kolom voor analyse en zuivering van verbindingen 1 en 5</td><td>Waters&nbsp;</td><td>186003115</td><td>XBridge BEH C18 kolom, 130 &Aring;, 5 &micro;m, 4.6 mm x 100 mm</td></tr><tr><td>Microwave Reactor&nbsp;</td><td>Biotage&nbsp;</td><td>Initiator 8</td><td>---</td></tr><tr><td>Biotage V10 Evaporator</td><td>Biotage&nbsp;</td><td>Serienummer # V1041</td><td>---</td></tr><tr><td>Dose kalibrator</td><td>Capintec, Inc.&nbsp;</td><td>CRC-25R</td><td>---</td></tr><tr><td>Gammateller</td><td>Perkin Elmer</td><td>Wizard 1470 Automatic Gamma Counter</td><td>---</td></tr><tr><td>Dierenkamerweegschaal&nbsp;</td><td>Mettler Toledo</td><td>XP105 Delta Range</td><td>---</td></tr><tr><td>Microwave vials&nbsp;</td><td>Biotage&nbsp;</td><td>355629</td><td>0.5-2 mL&nbsp;</td></tr></tbody></table>

voorbereiding en evaluatie van<sup&gt; 99m</sup&gt; tc-gelabelde tridentaat chelates voor pre-targeting met behulp bioorthogonal chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Pre-targeting gecombineerd met bioorthogonale chemie ontwikkelt zich tot een effectieve manier om nieuwe radiofarmaca te creëren. Van de beschikbare methoden is de inverse elektrone-vraag Diels-Alder (IEDDA) cycloadditie tussen een radiogelabelde tetrazine en trans-cycloocteen (TCO) gekoppeld aan een biomolecuul bewezen als een zeer effectieve bioorthogonale aanpak voor het beeldvormen van specifieke biologische doelen. Ondanks het feit dat technetium-99m het meest gebruikte isotoop blijft in diagnostische nucleaire geneeskunde, is er een tekort aan methoden voor het bereiden van 99mTc-gelabelde tetrazines. Hierin rapporteren we de bereiding van een familie van tridentaat-chelaat-tetrazine-derivaten en hun Tc(I)-complexen. Deze tot nu toe onbekende verbindingen werden radiogelabeld met 99mTc met behulp van een microgolf-geassisteerde methode in 31% tot 83% radiochemische opbrengst. De producten zijn stabiel in zoutoplossing en PBS en reageren snel met TCO-derivaten in vitro. Hun in vivo pre-targeting capaciteiten werden aangetoond met behulp van een TCO-bisfosfonaat (TCO-BP) derivaat dat zich lokaliseert in gebieden met actieve botmetabolisme of letsel. In muizenstudies vertoonden de 99mTc-tetrazines hoge activiteitsconcentraties in knieën en schoudergewrichten, wat niet werd waargenomen wanneer experimenten werden uitgevoerd in afwezigheid van TCO-BP. De algehele opname in niet-doelorganen en farmacokinetiek varieerde sterk afhankelijk van de aard van de linker en de polariteit van het chelaat.

De liganden werden gesynthetiseerd met verschillende linkers en chelatoren met eenvoudige reductieve aminering strategie (figuur 2), gevolgd door koppeling van het product aan een commercieel verkrijgbare tetrazine 22, 23. Radiolabeling werd uitgevoerd met dezelfde werkwijze voor alle verbindingen en was zeer reproduceerbaar. Het proces werd geoptimaliseerd door het variëren van de pH, hoeveelheid ligand, reactie...

Hier beschrijven we een protocol voor het radiolabelen en in vivo testen van tridentaat 99mTc(I) chelaat-tetrazine afgeleiden voor pre-targeting en bioorthogonale chemie.

Voorbereiding en evaluatie van<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc-gelabelde tridentaat Chelates voor Pre-targeting Met behulp Bioorthogonal Chemistry

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...

Het algemene doel van deze procedure is het produceren van technetium-99m gelabelde tetrazinen voor pre-targeted imaging met behulp van bioorthogonale chemie, waarbij trans-cycloocteen gemodificeerde biomoleculen als targeting vectoren dienen. Deze methode biedt een belangrijk nieuw platform voor de ontwikkeling van nieuwe radiofarmaca. Door middel van pre-targeting kunnen de hier beschreven technetiumcomplexen worden gebruikt voor het beelden van een breed scala aan organen, weefsels en biomarkers.Deze techniek is voordelig omdat deze een robuuste stapsgewijze methode biedt om tetrazines te produceren die zijn radiogemarkeerd met technetium-99m, het meest gebruikte medische isotoop in de diagnostische geneeskunde. Deze techniek kan worden toegepast met verschillende targeting-vectoren, waaronder kleine moleculen en antilichamen. Het kan ook worden gebruikt voor radiotherapie door technetium te vervangen door bèta-emitterende isotopen van rhenium.Nancy Janzen, biologisch technicus in ons laboratorium, zal een deel van de dierprocedures demonstreren. Om te beginnen met de radiomerkingsprocedure, combineert u in een magnetronbuisje acht milligram kaliumboranocarbonaat, 15 milligram natriumcarbonaat, 20 milligram natriumtetraboraatdecahydraat en 25 milligram kaliumnatriumtartraat-tetrahydraat. Spoel het buisje gedurende 10 minuten door met argongas.Voeg vervolgens vier milliliter technetium-99m pertechnetaat in 0,9% zoutoplossing met een activiteit van 1.110 megabecquerel toe aan het vial. Breng het reactiemengsel over in een magnetronreactor en roer gedurende 10 seconden. Verhit het mengsel vervolgens gedurende 3,5 minuten bij 110 °C om het triaqua tricarbonyl technetium-99m kation te verkrijgen.Voeg ongeveer 400 µL 1 M zoutzuur toe om de pH van de oplossing aan te passen naar 3,5 tot 4. Los vervolgens voor elk tetrazineligand twee milligram ligand op in 250 µL methanol. Voeg aan elke ligandoplossing 250 µL van het technetium-99m-complex met een activiteit van 74 MBq toe.Verhit het mengsel in een magnetronreactor bij 60 °C gedurende 20 minuten. Voor tetrazine-liganden met t-Butyl-beschermgroepen wordt de oplossing overgebracht van een magnetronbuisje naar een scintillatiebuisje van 20 ml, waarna het oplosmiddel wordt verdampt en elk complex opnieuw wordt opgelost in 1 ml van een volumeverhouding één-op-één oplossing van dichloormethaan en trifluorazijnzuur. Breng de oplossing vervolgens over naar een magnetronbuisje en verhit deze complexen in een magnetronreactor bij 60 °C gedurende zes tot 10 minuten om de liganden te deprotecteren.Koel de complexen af tot kamertemperatuur en verdampt vervolgens het oplosmiddel. Los de residuen op in 500 microliters van een waterige oplossing in een one-op-one verhouding van methanol of acetonitril en water voordat u overgaat tot HPLC-zuivering. Gebruik C18 reversed phase HPLC om elk radiogemarkeerd tetrazinecomplex te zuiveren met een elutiegradiënt van 30 naar 70 naar 40 naar 60 acetonitril in water gedurende 20 minuten, waarbij gedurende het gehele proces 0,1% trifluorazijnzuur in het eluent aanwezig is.Verzamel het gezuiverde product zodra het elueert in de gamma-trace. Co-injecteer vervolgens elk gelabeld complex met een oplossing van 0,125 milligram van het corresponderende radium-tetrazinecomplex in 20% methanol in water. Vergelijk de retentietijden van de piek van het rheniumcomplex in de UV-trace en de piek van het technetiumcomplex in de gamma-trace om de identiteit van de gammapiek te verifiëren.Verwijder het oplosmiddel uit elk gezuiverd technetium-tetrazinecomplex. Formuleer elk complex tot een concentratie van 7,4 kBq per µL in fosfaatgebufferde zoutoplossing met 0,5% runderseumalbumine en 0,01% polysorbaat 80. Trek voor elke muis 100 µL van een 5 µg per µL oplossing van het TCOPB-derivaat in zoutoplossing op in een spuit om een dosis van 20 mg per kg voor te bereiden.Koppel een naald van 30 gauge aan de doseerspuit. Plaats de muis in een fysiek fixatieapparaat. Identificeer de venen op het laterale oppervlak van de staart, ongeveer twee centimeter vanaf het uiteinde van de staart, en veeg het gebied schoon met een alcohol-doekje.Voer de injectienaald in onder een flauwe hoek, parallel aan de ader. Injecteer langzaam het TCOBP-derivaat. Verwijder de naald en druk met een schoon gaasje lichtjes op de injectieplaats totdat het bloeden stopt.Eén uur na injectie van het TCOBP-derivaat dient een dosis van 100 µL van het gewenste technetium-99m tetrazinecomplex met een activiteit van ongeveer 0,74 MBq via de staartvene te worden toegediend. Gebruik een dosiscalibrator om de activiteit van een testmonster van 100 µL van het technetiumcomplex op het moment van injectie te meten. Bewaar het testmonster voor latere metingen.Anestheseer de muis met een mengsel van 3% isofluraan en 2% zuurstofgas zes uur na de injectie. Plaats de muis op de rug met de neus in de neuskegel voor voortgezette anesthesie en lokaliseer het xiphoïd proces. Verbind een naald van 25-gauge met een spuit die vooraf is behandeld met heparine.Voer de naald onder een hoek van 20 graden in onder het xiphoid proces, iets links van de middellijn. Zodra de naald volledig is ingevoerd, trekt u de zuiger langzaam terug om te controleren op bloed in de naaldhub, wat een succesvolle hartpunctie bevestigt. Pas de positie van de naald indien nodig aan.Zodra het hart is gepuncteerd, wordt er langzaam één milliliter bloed in de spuit getrokken. Breng het bloedmonster over naar een vooraf gewogen telbuis. Euthanaseer de muis door middel van cervicale dislocatie terwijl deze onder anesthesie is.Plaats het geëuthanaseerde dier in een plastic zak en meet de activiteit van het gehele lichaam met een dosiscalibrator. Verzamel vervolgens de knie- en schouderbeenderen, de galblaas, de nieren, de lever, de schildklier en luchtpijp, en de staart. Verzamel daarnaast de maag, de dunne darm, de dikke darm en het caecum, en de urineblaas, inclusief hun inhoud.Spoel het bloed uit alle verzamelde weefsels, behalve de galblaas en de urineblaas, met fosfaatgebufferde zoutoplossing. Dep de weefsels droog en plaats elk weefsel in een vooraf gewogen telbuis. Meet de residuele activiteit van het karkas.Weeg elk weefselmonster en bereken de massa van het weefsel alleen. Gebruik een gamma-teller met meerdere detectoren om de activiteit van een aliquot van 5 µL van het testmonster met het technetiumcomplex te meten. Bereken een conversiefactor met behulp van de verkregen waarde in counts per minute en de activiteit gemeten op het moment van injectie.Meet de activiteit van elk weefsel- en vloeistofmonster met de gammadetector. Reken de waarden om naar microcurie en normaliseer elke waarde op basis van het orgaangewicht om het percentage van de geïnjecteerde dosis per gram weefsel te bepalen. Herhaal dit proces met aanvullende muizen zonder injectie van het TCOPB-derivaat als negatieve controleserie.Met behulp van deze methode werden vijf tetrazïnecomplexen, die verschilden in hun linker- en key-leadercombinaties, gelabeld met technetium-99m. Een TCOPB-derivaat, dat lokaliseert in gebieden met een hoge calciumomzet in het bot, werd gebruikt voor pre-targeting van de schouder- en kniegewrichten van muizen. De ratio's van het percentage geïnjecteerde dosis per gram weefsel voor bot ten opzichte van bloed werden berekend voor elk tetrazïneverbinding.Alle vijf de verbindingen werden snel uit het bloed geklaard en richtten zich op het bot, wat aangeeft dat de selectieve bio-orthogonale koppelingsreactie tussen de tetrazineverbindingen en het TCOBP-derivaat in vivo had plaatsgevonden. Verbinding drie vertoonde de beste combinatie van targeting en klaring uit het bloed. Negatieve controle-experimenten wezen uit dat de radiogemarkeerde tetrazinecomplexen in afwezigheid van het TCOBP-derivaat niet significant in het bot lokaliseerden.Wanneer het TCOBP-derivaat bijvoorbeeld niet werd toegediend, vertoonde verbinding twee hoge concentraties in de galblaas en darmen, maar zeer weinig in het bot. Bij muizen die het TCOBP-derivaat ontvingen, werd een grote variatie in weefsellokalisatie waargenomen tussen de vijf geteste verbindingen. Zo was er van verbinding drie zeer weinig aangetroffen in de dikke darm, lever, urine of blaas in vergelijking met andere complexen, terwijl er veel meer van verbinding drie in het bot werd waargenomen.Zodra de methode onder de knie is, kan de hier beschreven labelingstechniek in minder dan twee uur van begin tot eind worden uitgevoerd, mits deze correct wordt toegepast. Bij het uitvoeren van deze techniek is het belangrijk om ervoor te zorgen dat alle reagentia nauwkeurig worden afgewogen en dat de zouten met argon worden gespoeld voordat ze aan de technetiumoplossing worden toegevoegd. Het is daarnaast cruciaal dat de pH van de technetiumoplossing wordt ingesteld op 3,5 tot 4 voordat het tetrazine-ligand wordt toegevoegd.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe technetium-gelabelde tetrazinen worden geprepareerd en gezuiverd, en hoe deze kunnen worden gebruikt om nieuwe radiofarmaca te creëren middels pre-targeting en bio-orthogonale chemie. Vergeet niet de passende voorzorgsmaatregelen te nemen bij het werken met radioactiviteit, zoals het begrijpen van het type uitgestraalde straling en de beste manier om monsters af te schermen en te hanteren.

preparation-evaluation-99mtc-labeled-tridentate-chelates-for-pre

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

This video describes the technique of pretargeted radioimmunotherapy or PRIT, in which immunoconjugates followed by radioligands are administered for treating tumors. This radioimmunotherapy reduces radiation doses to healthy tissues and utilizes radionuclides with very low half-lives incompatible with antibody-based vectors.

Pretargeted Radioimmunotherapy: A Method for Targeted Delivery of Therapeutic Radionuclides to Tumors

MR kanker moleculaire beeldvorming aantonen met een kleine peptide gerichte MRI-contrastmiddel specifiek voor clotted plasma-eiwitten in tumor stroma in een muizen prostaatkanker model.

MR Molecular imaging van prostaatkanker met een kleine moleculaire CLT1 Peptide Gerichte contrastmiddel

We presenteren een methode voor een snelle, omkeerbare immobilisatie van kleine moleculen en gefunctionaliseerde nanodeeltjes assemblages voor Surface Plasmon Resonance (SPR) studies, met behulp van sequentiële on-chip bioorthogonal cycloadditiereactie chemie en antilichaam-antigen capture.

Microfluïdische On-chip Capture-cycloadditiereactie omkeerbaar Immobiliseer Small Molecules of Multi-component Structuren voor biosensortoepassingen

De bioorthogonale inverse elektrone-vraag Diels-Alder cycloadditie is gebruikt om een effectieve en modulaire pretargeted PET-beeldvormingsstrategie voor kanker te creëren. In dit protocol worden de stappen van deze methodologie beschreven in de context van een modelsysteem dat gebruikmaakt van het op colorectale kanker gerichte antilichaam huA33 en een 64Cu-gelabelde radioligand.

Het benutten van de Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloadditiereacties voor Pretargeted PET Imaging

Vanwege zijn meerdaagse radioactieve halfwaardetijd en gunstige vervaleigenschappen, is het positron-emitterende radiometaal 89Zr uitermate geschikt voor gebruik in antilichaamgebaseerde radiofarmaca voor PET-beeldvorming. In dit protocol worden de bioconjugatie, radiosynthese en preklinische toepassing van 89Zr-gelabelde antilichamen beschreven.

De bioconjugatie en radiosynthese van<sup&gt; 89</sup&gt; Zr-DFO-gemerkte antilichamen

Een gedetailleerde procedure voor de synthese van een 125 I-gemerkt azide en het radioactief merken van dibenzocyclooctyne (DBCO) -groep geconjugeerd, 13-nm-sized goud nanodeeltjes met behulp kopervrij click reactie wordt beschreven.

Een geoptimaliseerde protocol voor de efficiënte Radioactief merken van Gold Nanodeeltjes met behulp van een<sup&gt; 125</sup&gt;-Gemerkte azide prosthetische groep

Na de bereiding van een 64 Cu-gemodificeerd monoklonaal antilichaam dat aan een transgene muizen T-celreceptor, T-cellen radiogelabeld in vivo geanalyseerd op levensvatbaarheid functionaliteit labeling stabiliteit en apoptose en adoptief overgebracht in muizen met een luchtweg vertraagde hypersensitiviteit reactie voor niet-invasieve beeldvorming met positron emission tomography / computed tomography (PET / CT).

Muizen-lymfocyt Labeling door<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antibody Receptor targeting voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Celverkeer PET / CT

Viral afkomstige peptiden gekoppeld aan antilichaam-geconjugeerde (ACs) is een aanpak die wint dynamiek als gevolg van het potentieel van het leveren van moleculaire payloads met verhoogde tumor cel accumulatie. Gebruik makend van gemeenschappelijke methoden voor evaluatie van peptide conjugatie, AC en lading intracellulaire accumulatie en tumor gericht op, helpt dit protocol onderzoekers tijdens de cruciale eerste ontwikkelingsfasen.

Eerste beoordeling van antilichaam-geconjugeerde bewerkt met virale afkomstige peptiden voor verhoging van cellulaire accumulatie en verbetering van de Tumor gericht op

Dit protocol beschrijft de synthese en de karakterisering van een trans- Cycloocteen (TCO)-gemodificeerde antilichaam en een 177Lu-geëtiketteerden tetrazine (Tz) radioligand voor pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). Daarnaast geeft het het gebruik van deze twee constructies voor in vivo ook en longitudinale therapie studies in een lymfkliertest model van colorectal kanker.

Pretargeted Radioimmunotherapy op basis van de Inverse Electron vraag Diels-Alder reactie

In dit protocol beschrijven we de synthese van PODS, een phenyoxadiazolyl methyl-sulfon gebaseerde reagens voor de site-selectieve bevestiging van cargos aan de thiolen van biomoleculen, met name antilichamen. Daarnaast beschrijven we de synthese en de karakterisering van een Peul-bevattende bifunctionele complexvormer en zijn geconjugeerde aan een model antilichaam.

Synthese en Bioconjugation van Thiol-reactieve reagentia voor de oprichting van Site-selectief bewerkt Immunoconjugates

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het radioactief labelen van cellen met een positronemissietomografie (PET) radio-isotoop, 89 Zr (t1/2 78,4 uur), met behulp van een kant-en-klaar radioactief labelend synthon, [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN). Radiolabeling van cellen met [89Zr]Zr-DBN maakt niet-invasieve tracking en beeldvorming mogelijk van toegediende radioactief gelabelde cellen in het lichaam met PET tot 7 dagen na toediening.

Positronemissietomografie Beeldvorming van celhandel: een methode voor celradiolabeling

Leer de radiolabeling van tetrazine-derivaten met technetium-99m voor pre-targeting in bioorthogonale chemie. Deze methode maakt beeldvorming van organen en weefsels mogelijk en ondersteunt de ontwikkeling van nieuwe radiotherapeutica.

Voorbereiding en evaluatie van

Meer video's verkennen