Name: Une cellule de Blood Red Simple Lysis Méthode pour la création de B lymphoblastoïdes lignées cellulaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Découvrez une méthode de lyse des globules rouges pour établir des lignées cellulaires B lymphoblastoïdes avec seulement 0,5 mL de sang. Cette technique accélère l'immortalisation des lymphocytes B humains par le virus EBV.

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Ce travail a été soutenu par les projets clés de l’Académie chinoise des sciences (KFZD-SW-205), le système stratégique de soutien technologique des ressources biologiques de l’Académie chinoise des sciences (CZBZX-1).

Cette étude a été approuvée par le Comité d&#39;éthique de l&#39;Institut de génétique et de biologie du développement, et le protocole suit les directives institutionnelles pour le bien-être humain. 1. Préparation de EB Virus <ol><li> Le jour 1, décongeler les cellules B95-8 et la culture dans 6 ml de milieu RPMI 1640 complet additionné de 10% de sérum bovin fœtal, 2 mM de L-glutamine et des antibiotiques (100 pg / ml de streptomycine, 100 U / ml de pénicilline) dans un T25 flacon de culture. Placer le flacon de culture dans 5% de CO 2 incubateur à 37 ° C. </li><li> Le jour 2, observer la morphologie des cellules au microscope. Les cellules sont en bon état quand ils sont lumineux et rond. Ajouter 10 ml milieu RPMI 1640 complet. </li><li> Le jour 4, ajouter 10 ml frais milieu RPMI 1640 complet, puis transférer dans un flacon de culture T75. </li><li> Le jour 8, ajouter 20 ml milieu RPMI 1640 complet. </li><li> Maintenir les cellules pendant 8 jours sans ajouter du milieu frais, à savoir, la famine. </li><li> Le jour 16, observer les cellulesobservé au microscope. Recueillir les cellules dans un tube de 15 ml centrifugeuse, 12 mL / tube. </li><li> Cryo-préserver à -80 ° C pendant 1 h, puis décongeler rapidement à 37 ° C. Répéter 3 fois jusqu&#39;à ce que les particules virales sont libérées à partir des cellules. </li><li> Centrifuger à 240 g pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Filtrer le surnageant à travers un filtre de 0,22 um, aliquote, 12 mL / tube et conserver à -80 ° C. </li></ol> 2. Traitement de sang total avec Red Blood Cell Lysis Buffer <ol><li> Ajouter 0,5 mL de sang total anticoagulé par EDTA · K 2 à un tube de 15 ml. </li><li> Mettre 1 ml de tampon de lyse des globules rouges (filtré par filtre de 0,22 um et décongelés à la température ambiante avant utilisation) pour le sang total et bien mélanger. Placer le mélange à température ambiante pendant 4 min. Puis ajouter 5 - 7 ml de PBS 1x rapidement à la réaction d&#39;arrêt. </li><li> Centrifuger à 240 g pendant 5 min à température ambiante. Les globules blancs précipitent au fond du tube. </li><li> Jeter le surnageant et laver la précipitation en ajoutant 7 ml 1640 de base. Centrifuger pendant 5 min à 240 xg à la température ambiante. Répéter deux fois. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 300 milieu de transformation ul (milieu RPMI 1640 contenant 20% de sérum de fœtus bovin et 10 ug / ml de phytohémagglutinine (PHA)). </li></ol> 3. EBV Infection <ol><li> Ajouter 60 ul de 20 ug / ml de cyclosporine A (CsA) à la suspension cellulaire. </li><li> Rapidement dégeler une partie aliquote de l&#39;EBV à 37 ° C. Ajouter 240 ul VEB à la suspension cellulaire. </li><li> Bien mélanger et placer la suspension cellulaire à une plaque de 96 puits, 200 ul par puits. Pour éviter l&#39;évaporation, ajouter 200 ul PBS 1x à chaque bien autour de la plaque de 96 puits. Placer la plaque dans un incubateur à CO2 de 5% à 37 ° C. </li></ol> 4. Expansion et Cryoconservation de B-LCLs <ol><li> Changer la moitié du milieu une fois par semaine pour le premier mois après l&#39;infection par l&#39;EBV. Seul un laye épaisr des fragments de cellules est visible au microscope au jour 7 (figure 2). Après un mois de l&#39; infection à EBV, des amas de cellules lymphoblastoïdes sont visibles sous une épaisse couche de fragments de cellules au microscope (Figure 2). </li><li> Changer la moitié du milieu tous les 3 jours jusqu&#39;à ce que les agrégats de cellules sont bien visibles au microscope (Figure 2). En règle générale, ce processus prend 10 à 20 jours. </li><li> Après le mélange, pipeter les cellules et transférer à la plaque de 24 puits. Doubler le volume du milieu de culture RPMI 1640 complet pendant qu&#39;elle vire au jaune. Ce processus dépend du taux de croissance cellulaire. </li><li> Par la suite, transférer les cellules à T25 flacon de culture. Doubler le volume du milieu de culture telle qu&#39;elle vire au jaune jusqu&#39;à ce que le volume du milieu augmente à 10 - 15 ml. </li><li> Changer moyenne 24 h avant la congélation. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 240 x g. Compter les cellules avec un compteur de cellules et le gel à une densité de 5 à 10 x 10 6 / ml dans frsolution mère ozen contenant 90% de FBS et 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO). Congeler à un taux de 1 ° C par minute à -80 ° C, puis les transférer directement dans l&#39;azote liquide. </li></ol> 5. 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényl-tétrazolium , le bromure de (MTT) 17 <ol><li> Préparer une suspension cellulaire unique B-LCL avec le milieu 1640 contenant 10% de sérum de veau foetal. Seed 3 x 10 4 cellules par puits sur la plaque de 96 puits, 100 pl par puits. </li><li> Placer la plaque dans 5% de CO 2 incubateur à 37 ° C pendant 12 à 16 heures. </li><li> Ajouter MTT (5 mg / ml) dans les puits dans lesquels les cellules sont en croissance et à l&#39;abri de la lumière pendant 4 h à 37 ° C. </li><li> Centrifugeuse plaque de cellule pendant 10 min à 168 x g. </li><li> Retirer le surnageant et ajouter 100 ul de DMSO par puits. NOTE: Soyez prudent. Ne touchez pas les cristaux de colorant en forme d&#39;aiguilles. </li><li> Agiter la plaque pendant 10 minutes à basse vitesse pour dissoudre complètement les cristaux. </li><li> l&#39;absorption de la mesure à 570 nm paren utilisant un spectrophotomètre de microplaque. </li></ol>

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<li>Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-Examination+and+Further+Development+of+a+Precise+and+Rapid+Dye+Method+for+Measuring+Cell-Growth+Cell+Kill%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Re-Examination and Further Development of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell-Growth Cell Kill.</a> J Immunol Methods. 119 (2), 203-210 (1989).</li>
<li>Bogoslovsky, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+and+enumeration+of+endothelial+progenitor+and+endothelial+cells+from+peripheral+blood+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Med%22%5BJournal%5D)">Preservation and enumeration of endothelial progenitor and endothelial cells from peripheral blood for clinical trials.</a> Biomark Med. 9 (7), 625-637 (2015).</li>
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<li>Beck, J. C., Beiswanger, C. M., John, E. M., Satariano, E., West, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transformation+of+cryopreserved+lymphocytes%3A+A+resource+for+epidemiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Successful transformation of cryopreserved lymphocytes: A resource for epidemiological studies.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 10 (5), 551-554 (2001).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Nous rapportons ici le développement d&#39;un nouveau procédé d&#39;immortalisation de lymphocytes B humains à partir de sang total par lyse des globules rouges et la viabilité cellulaire établie de B-LCL a été évaluée par le test MTT. Les résultats ont montré que la viabilité des cellules B-LCL établies par la méthode de la lyse des globules rouges est beaucoup plus élevé que celui du procédé de séparation par gradient de densité. L&#39;avantage majeur de la méthode de la lyse des globules rouges est qu&#39;il est simp...

Les lymphocytes B au repos pourraient être transformés in vitro par le virus d’Epstein-Barr (EBV) en lignées de lymphoblastoïdes B (LCL-B) à prolifération active. Les B-LCL sont similaires aux cellules germinales en termes de différenciation et de développement, et le taux de mutation somatique des B-LCL n’était que de 0,3 %1, avec une altération génétique et phénotypique négligeable. Par conséquent, les B-LCL, en tant que substituts des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC), ont considérablement accéléré les progrès de l’étude génomique, transcriptomique et protéomique des maladies associées à l’EBV2,3. De plus, les B-LCL ont également une application importante dans le criblage des anticorps monoclonaux4,5. 
Plusieurs méthodes ont été développées pour l’immortalisation des lymphocytes B par l’EBV. Les procédures les plus courantes comprennent l’isolement des lymphocytes B et l’utilisation de lignées cellulaires B95-8 pour produire de l’EBV infectieux. De l’isolement à la transformation, ces méthodes se déclinent en trois stratégies. Les lymphocytes sont séparés du sang frais par centrifugation à gradient de densité et transformation de l’EBV directement6-8, appelée méthode de séparation par gradient de densité dans cette étude. Cependant, d’autres techniques surmontent la difficulté d’expédier du sang frais et utilisent une procédure de congélation des lymphocytes purifiés et de décongélation ultérieure et d’infection parl’EBV 9-11. Le sang total cryoconservé peut également être utilisé pour l’isolement et la transformation des lymphocytes B12,13. En plus de la centrifugation par gradient de densité pour séparer les lymphocytes B, certains chercheurs utilisent un trieur de cellules magnétique pour sélectionner les lymphocytes B12. Cependant, la séparation magnétique est un processus coûteux, complexe et long. Bien que ces méthodes soient utiles pour immortaliser les lymphocytes B avec un taux de réussite élevé, la nécessité de traiter un grand nombre d’échantillons cliniques et le volume de sang relativement faible nécessitent une méthode plus simple pour l’établissement d’une lignée cellulaire permanente.
Une autre méthode moins couramment utilisée consiste à utiliser le sang total comme source de cellules nucléées pour l’infection par l’EBV et l’établissement de B-LCL. Ces méthodes simplifient la technique en omettant la procédure de séparation. Seule une petite quantité de sang total, qu’il soit fraisou congelé15,16, est suffisante pour obtenir les lignées cellulaires. Malheureusement, le succès varie considérablement entre les documents15 et 16 et plusieurs de nos tests de validation. De plus, les colonies transformées sont à peine reconnues au microscope en raison des grandes impuretés contaminantes. Ainsi, une méthode de transformation plus fiable est nécessaire.
Sur la base des considérations ci-dessus, nous avons développé une nouvelle méthode pour établir des LCL-B sans purification préalable des lymphocytes, appelée méthode de lyse des globules rouges. Cette méthode est pratique, permet de gagner du temps et s’applique à un grand nombre d’échantillons. Aussi peu que 0,5 ml de sang total a suffi pour obtenir des B-LCL qui sont facilement disponibles chez les nourrissons et les personnes âgées sans nuire de manière significative à leur santé.

<table><tbody><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Techcomp</td><td>CT6T</td><td>Centrifugation</td></tr><tr><td>Compteur de cellules automatisé&nbsp ;</td><td>Countstar</td><td>&nbsp ; IC 1000&nbsp ;</td><td>Pour le comptage cellulaire&nbsp ;</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre de microplaques Epoch</td><td>BioTek Instruments</td><td>SN263839</td><td>Pour mesurer l’absorbance</td></tr><tr><td>96 puits cluster de culture cellulaire</td><td>Corning Incorporated</td><td>3599</td><td>Plaques de polystyrène</td></tr><tr><td>24 puits cluster de culture cellulaire</td><td>Corning Incorporated</td><td>3524</td><td>Plaques de polystyrène</td></tr><tr><td>25 cm2 flacon de culture cellulaire</td><td>Nest</td><td>707001</td><td>Polystyrène& nbsp ;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>Composant des B-LCLs medium</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco</td><td>31800-022</td><td>Pour les B-LCLs medium</td></tr><tr><td>L-Glutamine&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Amresco</td><td>0374</td><td>Composant des B-LCLs moyen</td></tr><tr><td>100x streptomycine pénicilline solution BioRoYeeBRY-2309</td><td>BioRoYee</td><td>BRY-2309</td><td>Composant des B-LCLs medium</td></tr><tr><td>Ficoll paque plus</td><td>GE&nbsp ; Soins de santé</td><td>17-1440-03</td><td>Pour in vitro isolement des lymphocytes</td></tr><tr><td>PHA-M</td><td>Sigma</td><td>L8902</td><td>Pour stimuler la prolifération des lymphocytes</td></tr><tr><td>Cyclosporin A</td><td>Caïmans&nbsp ; Produit chimique</td><td>12088</td><td>Pour inhiber l’effet cytotoxique des lymphocytes T</td></tr><tr><td>Tampon de lyse des globules rouges</td><td>Tiangen</td><td>RT122-01</td><td>Pour lyser les globules rouges</td></tr><tr><td>MTT</td><td>Amresco</td><td>0793</td><td>Pour la détection de la viabilité cellulaire</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Pour la congélation des cellules</td></tr></tbody></table>

une cellule de blood red simple lysis méthode pour la création de b lymphoblastoïdes lignées cellulaires

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

Il existe un certain nombre de méthodes pour la transformation des lymphocytes B par le virus d’Epstein Barr in vitro en lignées cellulaires immortalisées. Nous avons développé une nouvelle méthode avec une stratégie puissante et simple pour la mise en place des B-LCLs, la méthode de lyse des globules rouges. Cette méthode a simplifié la procédure de séparation PBMC avec l’élimination des globules rouges, et a utilisé aussi peu que 0,5 ml de sang total pour établir des lignées cellulaires immortalisées par l’EBV, qui peuvent proliférer jusqu’à un grand nombre de cellules dans un laps de temps relativement court avec un taux de réussite de 100 %. La méthode est simple, fiable, permet de gagner du temps et est applicable au traitement d’un grand nombre d’échantillons cliniques.

Au cours du processus de transformation, les changements morphologiques des cellules sont visualisées par microscopie optique (Figure 2). De petites grappes de cellules étaient clairement visibles par le procédé de séparation par gradient de densité au bout de 7 jours après l&#39;infection, alors que seule une couche épaisse de fragments cellulaires sont visibles à partir de la méthode de la lyse des globules rouges. Cependant, des amas de cellules lymphoblastoïdes sont ...

Une méthode de lyse simple, des globules rouges du sang pour établir B-LCLs a été développé avec une grande efficacité de l&#39;immortalisation, ce qui nécessite une petite quantité de sang et un gain de temps de l&#39;initiation à la cryoconservation.

Une cellule de Blood Red Simple Lysis Méthode pour la création de B lymphoblastoïdes lignées cellulaires

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

L'objectif général de cette méthode simple est d'établir des lignées cellulaires de lymphoblastoïdes B, ou LCB-B, avec une forte efficacité d'immortalisation, en utilisant uniquement une petite quantité de sang et en réduisant le temps entre le démarrage et la cryoconservation. Il s'agit d'une méthode innovante permettant d'immortaliser des lymphocytes B humains à partir de sang total par lyse des globules rouges. Les LCB-B constituent une source précieuse de biomatériaux pour réaliser diverses études.Le principal avantage de cette méthode est qu'une quantité de sang de seulement 0,5 millilitre suffit à obtenir des LCL-B avec une efficacité d'immortalisation et une viabilité cellulaire élevées. Pour établir des LCL-B par transformation des lymphocytes B à l'aide du virus d'Epstein-Barr, ou VEB, la méthode couramment utilisée consiste à isoler séparément les cellules mononucléées du sang périphérique, ou CMSP, par centrifugation en gradient de densité au Ficoll. Toutefois, lorsque l'échantillon est inférieur à un millilitre, l'ajout d'un lyseur des hématies échouera.Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque nous avons constaté qu'il était difficile d'isoler

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Les neutrophiles sont le type de globules blancs le plus abondant. L’isolement des neutrophiles du sang humain par la méthode de séparation par gradient de densité et la différenciation des cellules promyélocytaires humaines (HL60) le long de la voie granulocytaire sont décrits ici ; Tester leur rôle sur la sensibilité des cellules du lymphome aux agents anti-lymphomes.

Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

Les lymphocytes sont les principaux acteurs des réponses immunitaires adaptatives. Ici, nous présentons un protocole de purification des lymphocytes pour déterminer les fonctions physiologiques des molécules souhaitées dans l’activation des lymphocytes in vitro et in vivo. Les procédures expérimentales décrites conviennent pour comparer les capacités fonctionnelles entre les lymphocytes témoins et les lymphocytes génétiquement modifiés.

Isolement et activation de murins Lymphocytes

Nous présentons dans l'étude d'un nouveau test basé sur la fluorescence en utilisant des lymphocytes dérivés d'une souris transgénique. Ce dosage est adapté pour le criblage à haut débit (HTS) de petites molécules dotées de la capacité de l'une ou l'inhibition de la promotion de l'activation des lymphocytes.

A base Fluorescence-lymphocytaire Assay Convient pour Criblage à haut débit des petites molécules

Classe  La mitogenèse des lymphocytes T s’accompagne d’une transformation blastogène, après quoi le volume cellulaire augmente avant la division cellulaire. Ici, nous décrivons une méthode pour quantifier la blastogenèse dans les lymphocytes T à l’aide d’un compteur de cellules automatisé capable de mesurer les diamètres des cellules.

Quantification rapide de blastogenesis mitogene induite dans les lymphocytes T pour l&#39;identification des médicaments immunomodulateurs

Une méthode simple permettant d’obtenir des clones NK et des lymphocytes T chez des patients CAEBV a été développée avec rendement élevé, une petite quantité de sang périphérique et une faible dose d’il-2.

Une méthode Simple et efficace pour établir les NK et les lymphocytes T lignes provenant de Patients avec une Infection chronique Active Virus Epstein - Barr

Leucémie lymphoïde chronique (LLC) est la leucémie la plus courante dans le monde occidental. Facteurs de transcription NFAT sont des régulateurs importants de développement et l’activation de nombreux types de cellules. Nous présentons ici un protocole pour l’utilisation de l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) dans les cellules humaines de CLL pour identifier les gènes de la nouvelle cible de NFAT2.

Une analyse d’immunoprécipitation de la chromatine pour identifier les gènes cibles de nouveaux NFAT2 dans la leucémie lymphoïde chronique

Découvrez une méthode de lyse des globules rouges pour établir des lignées cellulaires B lymphoblastoïdes avec seulement 0,5 mL de sang. Cette technique accélère l'immortalisation des lymphocytes B humains par le virus EBV.

Une cellule de Blood Red Simple Lysis Méthode pour la création de B lymphoblastoïdes lignées cellulaires

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