Une cellule de Blood Red Simple Lysis Méthode pour la création de B lymphoblastoïdes lignées cellulaires

L’objectif global de cette méthode simple est d’établir des lignées cellulaires lymphoblastoïdes B, ou B-LCL, avec une efficacité d’immortalisation élevée en utilisant seulement une petite quantité de sang et en économisant du temps entre l’initiation et la cryoconservation. Il s’agit d’une nouvelle méthode pour immortaliser les lymphocytes B humains à partir du sang total en lysant les globules rouges. Les B-LCLs constituent une source précieuse de biomatériaux pour la réalisation de diverses études.

Le principal avantage de cette méthode est que seulement 0,5 millilitre de sang suffit pour obtenir des B-LCL avec une efficacité d’immortalisation et une viabilité cellulaire élevée. Pour établir des lymphocytes B par le virus d’Epstein-Barr, ou EBV, la méthode largement utilisée en cellules mononucléées de sang périphérique séparées ou PBMC, par centrifugation à gradient de densité de Ficoll. Cependant, lorsque l’échantillon contient moins d’un millilitre de lyse des globules rouges, l’ajout échouera.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons constaté qu’il était difficile d’isoler le PBMC des petits globules rouges en utilisant une méthode de séparation par gradient de densité. Pour préparer l’EBV, le premier jour, commencez par décongeler les cellules B95-8 et cultivez-les dans un flacon de culture T25 dans six millilitres de milieu complet RPMI 1640 complété par 10 % de FBS, deux millimolaires de L-glutamine et des antibiotiques. Incuber la culture à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Le deuxième jour, au microscope, observez la morphologie cellulaire. Les cellules sont en bon état lorsqu’elles sont brillantes et rondes. Ajoutez 10 millilitres de RPMI 1640 Medium complet à la culture.

Le quatrième jour, ajoutez 10 millilitres de milieu frais et transférez les cellules dans une fiole de culture T75. Ensuite, le huitième jour, ajoutez 20 millilitres de milieu de taille et maintenez les cellules pendant huit jours sans ajouter de milieu frais. Le 16e jour, vérifiez les cellules au microscope.

Ensuite, collectez 12 millilitres de cellules dans des tubes à centrifuger de 15 millilitres. Ensuite, cryoconservez les cellules à moins 80 degrés Celsius pendant une heure et décongelez rapidement les cultures à 37 degrés Celsius. Répétez la congélation et la décongélation, trois fois de plus jusqu’à ce que les particules virales soient libérées des cellules.

Centrifuger les cultures à 240 fois g à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, filtrez le surnageant à travers un filtre de 0,22 micron. Prélever 12 millilitres de filtrat par tube et stocker les tubes à moins 80 degrés Celsius.

Dans un tube de 50 millilitres, ajoutez 0,5 millilitre de sang total qui a été anticoagulé par EDTA K2. Ajoutez un millilitre de tampon de lyse des globules rouges au sang entier et mélangez bien. Incuber le mélange à température ambiante pendant quatre minutes. Ajoutez ensuite rapidement cinq à sept millilitres de 1x PBS pour arrêter la réaction de lyse.

Après avoir ajouté le tampon de lyse des globules rouges au sang, assurez-vous de bien mélanger. L’inversion garantit que la réaction est terminée en temps opportun. Ensuite, centrifugez le tube à 240 fois g à température ambiante pendant cinq minutes.

Les globules blancs vont précipiter au fond du tube. Jetez le surnageant et lavez le précipité en ajoutant sept millilitres de 1640 Basic Medium. Ensuite, centrifugez la solution avant de répéter le lavage.

Avec 300 microlitres de milieu de transformation, remettre en suspension la pastille de cellule. Ensuite, pour réaliser l’infection par l’EBV, ajoutez 60 microlitres de 20 microgrammes par millilitre de cyclosporine A à la suspension cellulaire. Décongeler rapidement une aliquote d’EBV à 37 degrés Celsius et ajouter 240 microlitres du virus aux cellules.

Mélangez soigneusement la suspension et transférez 200 microlitres par puits dans une plaque de 96 puits. Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Pendant le premier mois suivant l’infection par le VEB, changez la moitié du milieu de la culture cellulaire une fois par semaine.

Le septième jour, seule une épaisse couche de fragments cellulaires est visible au microscope. Après un mois d’infection, des amas de cellules lymphoblastoïdes sont visibles sous une épaisse couche de fragments cellulaires. À partir de ce moment, changez la moitié du milieu tous les trois jours jusqu’à ce que les amas de cellules soient clairement visibles au microscope.

Après avoir remis les cellules en suspension, transférez la suspension dans les puits d’une plaque à 24 puits. Ensuite, en fonction du taux de croissance cellulaire, lorsque le milieu de culture jaunit, doublez le volume du milieu complet RPMI 1640. Lorsque les amas de cellules lymphoblastoïdes sont visibles à l’œil nu, transférez la culture dans une fiole de culture T25.

Lorsque le milieu de culture jaunit, doublez le volume du milieu jusqu’à ce que le volume atteigne 10 à 15 millilitres. Avant de congeler, changez le milieu 24 heures à l’avance. Ensuite, pour congeler les cellules, centrifugez la suspension cellulaire et utilisez un compteur de cellules pour compter les cellules.

Avec la solution mère congelée contenant 90 % de FBS et 10 % de DMSO, ajustez la suspension à une densité de cinq à 10 fois 10 à six cellules par millilitre. Ensuite, congelez la suspension à une vitesse d’un degré Celsius par minute à moins 80 degrés Celsius avant de transférer les cellules congelées directement dans de l’azote liquide. Au cours du processus de transformation, les changements morphologiques des cellules sont visibles par microscopie optique.

Après sept jours d’infection, de petits amas de cellules sont clairement visibles à l’aide de la méthode de séparation par gradient de densité, tandis que seule une épaisse couche de fragments cellulaires est visible à l’aide de la méthode de lyse des globules rouges. 30 jours après l’infection, les amas de cellules lymphoblastoïdes sont visibles sous l’épaisse couche de fragments cellulaires. Avec des changements de milieu plus fréquents, les débris cellulaires sont réduits et les amas de cellules sont clairement visibles et ressemblent à la culture établie par séparation par gradient de densité.

Enfin, le test MTT a été utilisé pour évaluer la viabilité des B-LCL. Les résultats présentés ici indiquent que les cellules B-LCLs cultivées à l’aide de la méthode de lyse des globules rouges étaient significativement plus viables que la culture établie à l’aide de la méthode de séparation par gradient de densité. Une fois maîtrisé, le processus de transformation virale de l’EBV peut se faire en 30 minutes lorsqu’il est effectué correctement.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’établir des B-LCL avec une méthode de lyse des globules rouges simple et rapide sans purification préalable des lymphocytes. Après son développement, cette technique a accéléré les progrès de l’étude génomique, transcriptomique et protéomique des maladies associées à l’EBV et de cette application dans la production d’anticorps mononucléaires. N’oubliez pas que travailler avec des agents pathogènes humains, tels que l’EBV, peut être extrêmement dangereux et que des précautions doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.