Isolement de cellules progénitrices endothéliales de volontaires sains et de leur potentiel migratoire Influencé par échantillons de sérum après chirurgie cardiaque

des cellules progénitrices endothéliales (EPCs) sont fondamentalement impliqués dans la néovascularisation des tissus ischémiques. Cette méthode décrit l'isolement de EPCs humains provenant du sang périphérique, ainsi que l'identification de leur potentiel migratoire avec des échantillons de sérum de patients de chirurgie cardiaque.

L’objectif global de cette procédure d’isolement cellulaire et de ce protocole de migration est de montrer un moyen fiable d’isoler les cellules progénitrices endothéliales et leur potentiel migratoire vers des échantillons de sérum de patients en chirurgie cardiaque. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la régénération de la muqueuse endothéliale et des vaisseaux sanguins, qui est nécessaire après une chirurgie cardiaque en raison de lésions liées à l’ischémie et à la reperfusion. Le principal avantage de cette technique est la manière relativement simple d’isoler les cellules progénitrices, y compris le pré-isolement des cellules CD-34 positives.

En plus des décès, les complications majeures de la chirurgie cardiaque restent trop fréquentes. Soulignant la nécessité d’identifier le risque de cravate et les mécanismes de protection lors d’une chirurgie cardiaque. Les cellules progénitrices endothéliales sont impliquées de manière cruciale dans la néovascularisation des tissus ischémiques et sont connues pour fournir des propriétés cardioprotectrices.

Pour commencer l’expérience, mélangez du sang, un à un, avec du PBS sans calcium et sans magnésium. Ajoutez 15 millilitres de solution à gradient de densité dans un tube de 50 millilitres. Et superposez lentement le sang dilué sur la solution de gradient de densité.

Ensuite, centrifugez les échantillons. À l’aide d’une pipette en plastique stérile, prélevez soigneusement la couche de couche leucocytaire de chaque tube et placez-la dans un autre tube tout en évitant la solution à gradient de densité. Diluez la cellule mononucléée du sang périphérique, ou fraction PBMC, avec au moins trois volumes de PBS et mélangez la solution par pipetage.

Centrifugez le mélange à température ambiante pendant 15 minutes à 200 fois G.Ensuite, aspirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans cinq millilitres de milieu de croissance cellulaire endothéliale, MV-2. Après avoir remis les cellules en suspension, ajoutez 100 microlitres d’anticorps CD-34 humains par couche leucocytaire utilisée et faites pivoter les cellules. Ajoutez 50 microlitres de billes magnétiques recouvertes de Dextran par couche leucocytaire utilisée et faites pivoter les cellules.

Après l’incubation, transférez la suspension dans des tubes de fax avec un maximum de trois millilitres dans chaque tube. Ensuite, insérez les tubes de télécopie dans les aimants et attendez cinq minutes. Jetez le super natant sans retirer les tubes de télécopie de l’aimant.

Ensuite, à l’extérieur des aimants, remettez en suspension les cellules dans chaque tube de télécopie avec trois millilitres de support MV-2. Transférez la suspension cellulaire dans des flacons T-75 pré-enduits. Ajouter 17 millilitres de MV-2 medium dans chaque flacon.

Pour préparer l’essai de migration, à l’aide d’une pipette, on utilise une pipette pour prélever le milieu des cellules progénitrices endothéliales ou des CPE, dans la fiole T-75. Lavez les cellules avec cinq millilitres de solution saline tamponnée au phosphate ou PBS et secouez soigneusement le flacon. Ensuite, retirez le PBS et ajoutez cinq millilitres de solution commerciale de détachement de cellules.

Ensuite, attendez que les cellules se détachent au microscope optique. Accélérez le détachement en tapotant soigneusement le fond de la fiole. Lorsque les cellules sont détachées, ajoutez rapidement cinq millilitres de milieu complet MV-2 et transférez la suspension cellulaire dans un autre tube.

Centrifugez les cellules à 2 000 x G pendant cinq minutes. Après avoir granulé les cellules, remettez-les en suspension dans cinq à dix millilitres de PBS. Et les centrifuger à nouveau.

Remettez les cellules en suspension dans cinq à dix millilitres de PBS et poursuivez avec la centrifugation. Remettez en suspension la pastille de cellule dans un milieu affamé MV-2. Ensuite, diluez l’échantillon de sérum d’un à cinq dans un milieu affamé de MV-2.

Préparez la plaque de migration en ajoutant 235 microlitres de l’échantillon de sérum dans la chambre inférieure. Ajoutez l’insert peu de temps avant d’ajouter la solution cellulaire. Ensuite, ajoutez 75 microlitres de la solution cellulaire dans la chambre supérieure.

Autorisez les EPC à migrer. Retirez la chambre supérieure contenant toutes les cellules non migrées. Ajouter 75 microlitres de solution de paraformaldéhyde à 3,6 %, y compris le colorant hoechst dilué à 1 à 1 000.

Centrifugez brièvement la plaque pour mettre toutes les cellules dans le même plan focal à 2 000 x G pendant une à deux minutes. Pour éviter les artefacts d’autofluorescence sérique, quantifiez les cellules migrées en prenant cinq photos par puits avec un grossissement de 100x au microscope. Enfin, comptez les cellules migrées à l’aide du logiciel semi-automatisé.

L’analyse par fax des EPC vérifie l’absorption de l’acLDL, ainsi que l’expression de CD-31 à la surface de la population cellulaire isolée. L’isolement de l’analyse de l’acLDL et du CD-31 révèle une distribution homogène de chaque marqueur. Elyso pour identifier l’influence de la chirurgie cardiaque suite à une lésion de reperfusion myocardique sur les concentrations sériques circulantes de MIF, CXCL12, CXCL8 et VEGF.

Des échantillons de sérum ont été prélevés avant et pendant l’opération. Les taux sériques de MIF, CXCL12 et CXCL8 ont montré une augmentation peropératoire significative par rapport aux valeurs initiales. En revanche, les concentrations de VEGF n’ont pas montré de changements significatifs.

Un test de migration ex vivo, utilisant des échantillons de sérum prélevés avant et pendant l’opération, a été réalisé à l’aide d’EPC isolés de volontaires sains, et a révélé une augmentation significative du taux de migration vers les échantillons prélevés en peropératoire. En suivant cette technique, les cellules mononucléées du sang périphérique peuvent facilement être isolées, afin de répondre à des questions supplémentaires liées à l’inflammation.