Réalisé la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitif des cellules souches pluripotentes humaines

L’objectif global de cette méthode est d’orienter la différenciation des cellules souches pluripotentes humaines vers le programme hématopoïétique primitif ou définitif en utilisant une approche de manipulation du signal spécifique à l’étape. Cette méthode peut répondre à de nombreuses questions clés dans le domaine, telles que la compréhension du signal et des régulateurs transcriptionnels de l’hématopoïèse définitive humaine. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise instantanément une manipulation spécifique à l’étape.

La démonstration de cette procédure est faite par Carissa Dege, post-doc dans mon laboratoire. Pour commencer le protocole, procurez-vous des lignées de cellules souches pluripotentes humaines ou HPSC préalablement préparées, cultivées sur des fibreblastes embryonnaires de souris ou des MEF jusqu’à une confluence de 70 % à 80 % dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de CO2. Aspirez le milieu HPSC et ajoutez un millilitre de trypsine EDTA à 37 degrés Celsius 0,25 % dans chaque puits pendant une minute.

Au bout d’une minute, aspirez la trypsine et ajoutez un millilitre de milieu de pâte dans chaque puits. À l’aide d’un grattoir à cellules, grattez les cellules de la plaque. Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon de lavage dans chaque puits.

À l’aide d’une pipette sérologique de deux millilitres, triturez les cellules trois à cinq fois pour briser les gros amas. Et transférez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifugez les HPSC à 330 x G pendant cinq minutes.

Après l’essorage, ajoutez un média HPSC et remettez les cellules en suspension. Ensuite, ajoutez deux millilitres de HPSC remis en suspension dans chaque puits de la vaisselle en plastique codée MAT et incubez les cellules pendant la nuit. Après 24 heures, aspirez le milieu et remplacez-le par de l’EDTA à 37 degrés Celsius 0,05 % de trypsine pendant une minute.

Aspirez la trypsine EDTA. Ajoutez un millilitre de milieu de base et grattez vigoureusement les cellules avec un grattoir cellulaire. Ajoutez ensuite un millilitre de produit de lavage.

À l’aide d’une pipette sérologique de deux millilitres, triturez les cellules trois fois et transférez-les dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifugez les cellules à 220 x G pendant cinq minutes. Ensuite, aspirez le support, ajoutez 20 millilitres de produit de lavage et utilisez une pipette sérologique de cinq millilitres pour remettre doucement les cellules en suspension.

Après la centrifugation et l’aspiration, remettez soigneusement en suspension les corps embryoïdes ou EB dans le milieu du jour zéro. Distribuez deux millilitres de milieu de différenciation contenant des EB dans chaque puits d’une boîte de culture cellulaire à six puits à faible adhérence à l’aide d’une pipette sérologique de dix millilitres. Placez les EB dans un incubateur multigaz à 37 degrés Celsius, cinq pour cent de CO2 et cinq pour cent d’O2.

Vingt-quatre heures plus tard, ajoutez deux millilitres de média Day One. Incuber les cellules pendant la nuit dans un incubateur multigaz. Après 18 heures, récoltez doucement les EB à l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres et faites-les tourner à 100 x G pendant cinq minutes.

Lavez et combinez toute la culture avec dix millilitres de milieu Dulbecco modifié ou IMDM d’Iscove. Après avoir fait tourner à nouveau la culture à 100 X G pendant cinq minutes pour enlever les débris, aspirez le milieu. Remettez doucement en suspension les EB avec le milieu Day Two à l’aide d’une pipette P1000.

Ensuite, distribuez deux millilitres de EB par puits dans des plaques de culture cellulaire à six puits à faible adhérence. Ajoutez trois CHIR99021 micromolaires ou IWP2 pour spécifier respectivement les progéniteurs hématopoïétiques définitifs ou primitifs. Incuber la plaque dans un incubateur multigaz à 37 degrés Celsius pendant 30 heures.

Après 30 heures, isolez les EB à l’aide d’une pipette sérologique de deux millilitres en les transférant dans un tube conique de 50 millilitres et en les centifugant à 330 x G pendant cinq minutes. Remettez doucement les EB en suspension et lavez-les avec 10 millilitres d’IMDM. Suspendez à nouveau les EB dans le milieu du troisième jour et distribuez deux millilitres dans chaque puits de plaques à six puits à faible adhérence.

Incuber les cellules dans un incubateur multigaz à 37 degrés Celsius pendant 72 heures. Après 72 heures d’incubation, ajoutez deux millilitres de média du jour six dans chaque puits. Ensuite, incubez les EB dans un incubateur multigaz à 37 degrés Celsius pendant 48 heures supplémentaires.

Isolez les EB CHIR99021-traitées au huitième jour de différenciation et passez à la section suivante. Centrifugez les EB à 330 x G pendant cinq minutes. Aspirez le surnageant.

Ajoutez ensuite deux millilitres de 0,25 % de trypsine EDTA aux EB. Faites vortex les EB pendant cinq secondes et incubez les Ebs dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant huit minutes. Ajoutez ensuite cinq millilitres de solution d’arrêt et centrifugez les EB.

Puis aspirez le surnageant. Remettez les EB en suspension dans cinq millilitres de Collagenase II.Vortex le tube pendant cinq secondes, puis incubez les EB dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Après 60 minutes, agitez les EB pendant cinq secondes et ajoutez cinq millilitres de solution d’arrêt.

Après la centrifugation, aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de tampon FACS. Passez les cellules à travers une passoire cellulaire de 40 microns pour éliminer les amas de cellules non dissociés. Procéder au marquage par anticorps et à l’isolement FACS des progéniteurs endothéliales hémogènes CD34 positifs.

Après l’isolement FACS, remettre les cellules en suspension dans le milieu HE. Répartissez les cellules en aliquotes de 50 microlitres dans une plaque de culture à faible adhérence de 96 puits, puis incubez les cellules pendant la nuit. Le lendemain matin, les progéniteurs hématopoïétiques doivent s’agréger en amas de six à dix cellules.

Transférez doucement les volumes de 50 miroliter de cellules réagrégées au centre d’une plaque codée MAT à 24 puits. Placez délicatement la plaque dans l’incubateur multigaz pendant quatre à six heures jusqu’à ce que les cellules soient fixées. Après quatre à six heures, pour permettre aux cellules de se fixer, ajoutez lentement un millilitre de milieu HE fraîchement préparé dans chaque puits.

Incuber les cellules dans l’incubateur multigaz jusqu’à ce que les cellules hématopoïétiques soient visibles. Ensuite, récoltez les progéniteurs hématopoïétiques définitifs en retirant délicatement le milieu HE des cellules et en le passant à travers une passoire cellulaire de 40 microns pour recueillir le flux. Pour les cellules adhérentes restantes, ajoutez 0,5 millilitre de 0,25 % de trypsine EDTA aux cellules et incubez-les dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Après la trypsinisation, ajoutez 0,5 millilitre de solution d’arrêt dans chaque puits. Faites passer les cellules dans la même passoire cellulaire de 40 microns pour regrouper toutes les cellules adhérentes et non adhérentes et faire tourner les cellules. Ajoutez 2 000 à 10 000 cellules isolées FACS à un puits des cellules OP9 DL4 dans le milieu OP9.

Incuber dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % de CO2. Pour passer les cellules tous les quatre à cinq jours, triturez les cellules à l’aide d’une pipette d’un millilitre. Passez à travers un filtre de 40 microns pour éliminer les grumeaux.

Après la centrifugation, aspirez le média. Remettez les cellules en suspension dans deux millilitres de milieu frais pour cellules T et placez-les sur des cellules OP9 DL4 fraîches. Après au moins 21 jours de culture à froid, triturez vigoureusement les cellules et passez-les à travers un filtre de 40 microns pour éliminer les débris cellulaires.

Centrifuger à 330 x G pendant cinq minutes et aspirer le surnageant, puis poursuivre avec la cytométrie en flux standard. La cytométrie en flux montre que les cultures de différenciation traitées par IWP2 produisent une population distincte de CD34 positifs, de CD43 négatifs et de CD34 faiblement CD43 positifs. Alors que les cultures de différenciation traitées par CHIR ont moins de 1 % de cellules CD43 positives au huitième jour de la différenciation.

Des progéniteurs hématopoïétiques primitifs dérivés dans des conditions IWP2 isolés au neuvième jour donneront naissance à des progéniteurs érythroïdes et myéloïdes primitifs dans les essais de méthylcellulose. La population CD34 positive CD43 négative dérivée du traitement CHIR99021 est une population hétérogène contenant des progéniteurs endothéliales ainsi que des endothéliums hémogéniques CD34 positifs, CD43 négatifs, CD73 négatifs, CD184 négatifs, qui, lorsqu’ils sont isolés par FACS, forment initialement une monocouche de cellules endothéliales qui subissent ensuite une transition endothéliale à hématopoïétique aboutissant à des endothéliales rondes, réfractaires, cellules hématopoïétiques non adhérentes. Ces cellules hématopoïétiques peuvent être évaluées par cytométrie en flux pour l’expression de CD34 et CD45.

Les progéniteurs hématopoïétiques isolés des tests EHT peuvent être utilisés dans les tests de méthylcellulose et donner naissance à de grandes unités formant des colonies érythroïdes en forme d’éclatement, de petites unités formant des colonies érythroïdes et des progéniteurs myéloïdes. Ces analyses cytométriques en flux représentatives du potentiel de dosage des lymphocytes T à partir CHIR99021 de CD34 positifs, CD43 négatifs, CD73 négatifs, CD184 négatifs et de progéniteurs hématopoïétiques CD34 positifs et CD43 négatifs dérivés d’IWP2 montrent la présence d’une population CD45 positive, CD56 négative, CD4 positive et CD8 positive chez les progéniteurs dérivés de CHIR, ce qui indique le potentiel hématopoïétique au sein de la population CD34 positive d’entrée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de différencier les cellules souches pluripotentes humaines en une quantité primitive ou définitive de progéniteurs hématopoïétiques.