Name: Réalisé la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitif des cellules souches pluripotentes humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 37 s
Description: Découvrez la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitifs à partir de cellules souches pluripotentes humaines par manipulation spécifique de la voie WNT. Cette méthode permet d'étudier les régulateurs transcriptionnels de l'hématopoïèse définitive humaine.

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Ce travail a été soutenu par le Department of Internal Medicine, Division d’hématologie, Washington University School of Medicine. CD a été pris en charge par T32HL007088 du National Heart, Lung, and Blood Institute. CMS a été pris en charge par une société américaine d’hématologie Scholar Award.

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li>
<li>Ditadi, A., Sturgeon, C. M., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+view+of+human+haematopoietic+development+from+the+Petri+dish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A view of human haematopoietic development from the Petri dish.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (1), 56-67 (2017).</li>
<li>Chen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythroid%2Fmyeloid+progenitors+and+hematopoietic+stem+cells+originate+from+distinct+populations+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).</li>
<li>McGrath, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Sources+of+Hematopoietic+Progenitors+Emerge+before+HSCs+and+Provide+Functional+Blood+Cells+in+the+Mammalian+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo.</a> Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).</li>
<li>McGrath, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+definitive+erythroid+lineage+with+unique+regulation+of+the+beta-globin+locus+in+the+mammalian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transient definitive erythroid lineage with unique regulation of the beta-globin locus in the mammalian embryo.</a> Blood. 117 (17), 4600-4608 (2011).</li>
<li>Palis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+emergence+of+high+proliferative+potential+hematopoietic+precursors+during+murine+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal emergence of high proliferative potential hematopoietic precursors during murine embryogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (8), 4528-4533 (2001).</li>
<li>Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+erythroid+and+myeloid+progenitors+in+the+yolk+sac+and+embryo+proper+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse.</a> Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).</li>
<li>Boiers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphomyeloid+contribution+of+an+immune-restricted+progenitor+emerging+prior+to+definitive+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lymphomyeloid contribution of an immune-restricted progenitor emerging prior to definitive hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (5), 535-548 (2013).</li>
<li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).</li>
<li>Hadland, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+requirement+for+Notch1+distinguishes+2+phases+of+definitive+hematopoiesis+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A requirement for Notch1 distinguishes 2 phases of definitive hematopoiesis during development.</a> Blood. 104 (10), 3097-3105 (2004).</li>
<li>Kumano, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch1+but+not+Notch2+is+essential+for+generating+hematopoietic+stem+cells+from+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Notch1 but not Notch2 is essential for generating hematopoietic stem cells from endothelial cells.</a> Immunity. 18 (5), 699-711 (2003).</li>
<li>Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origin+of+the+adult+hematopoietic+system%3A+advances+and+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions.</a> Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).</li>
<li>Robert-Moreno, A., Espinosa, L., de la Pompa, J. L., Bigas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RBPjkappa-dependent+Notch+function+regulates+Gata2+and+is+essential+for+the+formation+of+intra-embryonic+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">RBPjkappa-dependent Notch function regulates Gata2 and is essential for the formation of intra-embryonic hematopoietic cells.</a> Development. 132 (5), 1117-1126 (2005).</li>
<li>Chadwick, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+and+BMP-4+promote+hematopoietic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells.</a> Blood. 102 (3), 906-915 (2003).</li>
<li>Davis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+GFP+reporter+gene+to+the+MIXL1+locus+of+human+embryonic+stem+cells+identifies+human+primitive+streak-like+cells+and+enables+isolation+of+primitive+hematopoietic+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1 locus of human embryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enables isolation of primitive hematopoietic precursors.</a> Blood. 111 (4), 1876-1884 (2008).</li>
<li>Kaufman, D. S., Hanson, E. T., Lewis, R. L., Auerbach, R., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+colony-forming+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (19), 10716-10721 (2001).</li>
<li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocyte+potential+marks+the+emergence+of+definitive+hematopoietic+progenitors+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).</li>
<li>Ledran, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+hematopoietic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+on+stromal+cells+derived+from+hematopoietic+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells on stromal cells derived from hematopoietic niches.</a> Cell Stem Cell. 3 (1), 85-98 (2008).</li>
<li>Ng, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primitive+streak+gene+Mixl1+is+required+for+efficient+haematopoiesis+and+BMP4-induced+ventral+mesoderm+patterning+in+differentiating+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The primitive streak gene Mixl1 is required for efficient haematopoiesis and BMP4-induced ventral mesoderm patterning in differentiating ES cells.</a> Development. 132 (5), 873-884 (2005).</li>
<li>Pick, M., Azzola, L., Mossman, A., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+in+serum-free+medium+reveals+distinct+roles+for+bone+morphogenetic+protein+4%2C+vascular+endothelial+growth+factor%2C+stem+cell+factor%2C+and+fibroblast+growth+factor+2+in+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells in serum-free medium reveals distinct roles for bone morphogenetic protein 4, vascular endothelial growth factor, stem cell factor, and fibroblast growth factor 2 in hematopoiesis.</a> Stem Cells. 25 (9), 2206-2214 (2007).</li>
<li>Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+CD34%2B+cells%3A+efficient+production+in+the+coculture+with+OP9+stromal+cells+and+analysis+of+lymphohematopoietic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential.</a> Blood. 105 (2), 617-626 (2005).</li>
<li>Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukosialin+%28CD43%29+defines+hematopoietic+progenitors+in+human+embryonic+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures.</a> Blood. 108 (6), 2095-2105 (2006).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+enhances+the+generation+of+hematopoietic+progenitors+from+human+embryonic+stem+cell-derived+hemato-vascular+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid enhances the generation of hematopoietic progenitors from human embryonic stem cell-derived hemato-vascular precursors.</a> Blood. 116 (23), 4786-4794 (2010).</li>
<li>Zambidis, E. T., Peault, B., Park, T. S., Bunz, F., Civin, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+progresses+through+sequential+hematoendothelial%2C+primitive%2C+and+definitive+stages+resembling+human+yolk+sac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial, primitive, and definitive stages resembling human yolk sac development.</a> Blood. 106 (3), 860-870 (2005).</li>
<li>Sturgeon, C. M., Ditadi, A., Awong, G., Kennedy, M., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+Signaling+Controls+the+Specification+of+Definitive+and+Primitive+Hematopoiesis+From+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Wnt Signaling Controls the Specification of Definitive and Primitive Hematopoiesis From Human Pluripotent Stem Cells.</a> Nat Biotechnol. 32 (6), 554-561 (2014).</li>
<li>Choi, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+hemogenic+endothelial+progenitor+and+its+direct+precursor+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).</li>
<li>Ditadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Definitive+Haemogenic+Endothelium+and+Arterial+Vascular+Endothelium+Represent+Distinct+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human Definitive Haemogenic Endothelium and Arterial Vascular Endothelium Represent Distinct Lineages.</a> Nat Cell Biol. 17 (5), 580-591 (2015).</li>
<li>Conner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryo+fibroblast+%28MEF%29+feeder+cell+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 23, Unit 23.2 (2001).</li>
<li>La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T-cell+development+from+human+cord+blood+hematopoietic+stem+cells+by+Delta-like+1+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro.</a> Blood. 105 (4), 1431-1439 (2005).</li>
<li>Schmitt, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T+cell+development+and+establishment+of+T+cell+competence+from+embryonic+stem+cells+differentiated+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro.</a> Nat Immunol. 5 (4), 410-417 (2004).</li>
<li>Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OP9-DL1+system%3A+generation+of+T-lymphocytes+from+embryonic+or+hematopoietic+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), (2009).</li>
<li>Polychronopoulos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+synthesis+of+indirubins+as+potent+and+selective+inhibitors+of+glycogen+synthase+kinase-3+and+cyclin-dependent+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the synthesis of indirubins as potent and selective inhibitors of glycogen synthase kinase-3 and cyclin-dependent kinases.</a> J Med Chem. 47 (4), 935-946 (2004).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-mediated+disruption+of+Wnt-dependent+signaling+in+tissue+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer.</a> Nat Chem Biol. 5 (2), 100-107 (2009).</li>
<li>Sugimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+and+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Ohgushi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathway+and+cell+state+responsible+for+dissociation-induced+apoptosis+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).</li>
<li>Peschle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic----Fetal+Hb+switch+in+humans%3A+studies+on+erythroid+bursts+generated+by+embryonic+progenitors+from+yolk+sac+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Embryonic----Fetal Hb switch in humans: studies on erythroid bursts generated by embryonic progenitors from yolk sac and liver.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (8), 2416-2420 (1984).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Ce protocole décrit une méthode rapide, sans sérum, exempt de stroma de la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives ou définitifs. Mésodermiques spécification des progéniteurs hématopoïétiques primitives ou définitifs peut être réalisée de façon fiable utilisant notre protocole, qui exploite uniquement des petites molécules inhibitrices de la signalisation WNT canonique. Activation de WNT spécifiques au stade de l’inhibiteur de la GSK3β CHIR9902133 donne lieu à mésoderme hémato...

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) sont définis comme englobant les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCs) et ont la capacité unique non seulement en cours de renouvellement automatique dans des conditions appropriées de croissance, mais aussi, la capacité à se différencier en tous types de cellules dérivées des trois couches de germe : ectoderme, mésoderme et endoderme1. En raison de ces capacités uniques, hPSCs sont très prometteurs pour la médecine régénérative, modélisation de maladies et thérapies à base cellulaire2. Alors que plusieurs types de cellules ont été différenciés avec succès de hPSCs, un défi important est la spécification in vitro d’exclusivement adulte comme dérivé de hPSC les cellules souches hématopoïétiques (CSH) et des progéniteurs hématopoïétiques définitifs.
Une barrière susceptible au développement du CSH humaine de hPSCs est la présence de multiples programmes hématopoïétiques dans l' embryon humain3. Le premier programme qui émerge, appelé « hématopoïèse primitif », prend sa source dans les tissus extra-embryonnaires sac vitellin et est mieux caractérisé par sa production transitoire des progéniteurs des érythroblastes (EryP-CFC), les macrophages et les mégacaryocytes. Notamment, ce programme ne donne pas lieu à CSH, ni il donne naissance à des progéniteurs lymphoïdes T et B. Toutefois, le sac vitellin transitoirement suscite restreints progéniteurs hématopoïétiques définitifs, tels que le progéniteur myéloïde érythro (EMP4,5,6,7,8) et le déficient érythroïdes lymphoïdes-amorcé multipotentes progéniteurs (PPSP9). Cependant, PGE ni LMPPs sont entièrement multipotentes, ou capable de prise de greffe de CSH-comme chez les receveurs adultes. En revanche, plus tard dans le développement, le programme hématopoïétique « définitif » classiquement définie est spécifié dans la région de l’aorte-gonades-celles de l’embryon proprement dit, donnant lieu à toutes les lignées hématopoïétiques adultes, y compris le HSC. La spécification de ces cellules hématopoïétiques définitifs intra embryonnaires se produit de manière Notch-dépendante, via une transition endothéliales-à-hématopoïétiques du hemogenic l’endothélium (il)3,10,11 ,12,13,14. En dehors de la capacité de reconstitution, le potentiel de multilineage et Notch-dépendance à l’égard de ces cellules peuvent être utilisé pour distinguer ces progéniteurs hématopoïétiques définitifs de l’EMP et le PPSP (révisé dans les références3,13 ).
Comprendre les mécanismes qui régissent la spécification hématopoïétique primitive et définitive de hPSCs est probablement essentiel à la production reproductible de progéniteurs hématopoïétiques définitifs dans un éventail de lignes hPSC. Jusqu'à tout récemment, des protocoles de différenciation hPSC qui pourraient séparer multipotentes progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitives n’existaient pas de15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25. Beaucoup d’approches à l’aide de sérum fœtal (SVF) et/ou stromal co-culture tout d’abord souligné le potentiel hématopoïétique de différenciation hPSC, avec des mélanges de primitives et définitive hématopoïétiques potentiel15,16, 17,19,22,23,25. En outre, de nombreux protocoles sans sérum hématopoïétiques ont décrit les exigences en matière de signal pour la spécification du mésoderme de hPSCs qui abrite hématopoïétiques potentiels18,20,21, 24. Cependant, comme ces méthodes ont toujours donné lieu à des mélanges hétérogènes des deux programmes, leur utilisation dans des applications cliniques et de la compréhension des mécanismes du développement peut être limitée.
Nous avons récemment construit sur ces études, alors que nous avons décrit les exigences spécifiques au stade signal ACTIVIN/NODAL et signalisation WNT dans spécification hématopoïétique primitive et définitive du mésoderme dérivé hPSC18,26 . Ce dernier était particulièrement unique, car son utilisation de la manipulation de signaux spécifiques au stade WNT permet la spécification d’exclusive primitive ou exclusivement des progéniteurs hématopoïétiques définitif26. Au cours de la spécification du mésoderme, l’inhibition de la signalisation WNT canonique avec l’inhibiteur de la PORCN IWP2 se traduit par la spécification de CD43+ EryP-CFC et des progéniteurs myéloïdes, sans potentiel lymphoïdes détectable. Contraste, stimulation des canonique WNT signaling avec l’inhibiteur de la GSK3β, CHIR99021, au cours de la même étape de différenciation a provoqué l’absence totale de CD43 détectable+ EryP-CFC, tout en menant simultanément à la spécification du CD34+CD43− HE. Cette population possédait myéloïde, HBG-exprimant érythroïdes et lymphoïdes T potentiel. Les analyses subséquentes identifié ce qu’il manque l’expression CD7327,28 CD18428et son potentiel hématopoïétique était dépendante NOTCH28. En outre, unicellulaires analyses clonales ont démontré que ces lignées hématopoïétiques définitives pourraient provenir de cellules multipotentes28. Pris ensemble, ces études indiquent que stade WNT signaling manipulation permet de spécifier des progéniteurs hématopoïétiques primitives pures, ou multipotentes progéniteurs hématopoïétiques définitifs de NOTCH-dépendante.
Ici, nous exposons notre stratégie de différentiation qui génère des progéniteurs hématopoïétiques exclusivement primitifs ou définitifs, par manipulation de canonique WNT signalisation lors mésodermiques structuration et leur lignée hématopoïétique en aval des essais. Ce protocole est d’une grande utilité pour les chercheurs qui s’intéressent à la production de progéniteurs hématopoïétiques primitives ou définitifs de hPSCs pour les applications de la médecine régénérative.

<table><tbody><tr><td>Milieu Dulbecco’s modifié (IMD)</td><td>Corning</td><td>10-016</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS), ES noté cellule</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>100-500</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine, solution 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Vie Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine, peau porcine, type A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>12000-022</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Corning</td><td>10-092-CV</td><td></td></tr><tr><td>Remplacement sérique knock-out</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td>"KOSR"</td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels (NEAA)</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>b-mercaptoéthanol, solution 55 mM</td> Life <td>Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Fraction V, Albumine sérique</td><td>bovine Fisher Scientific</td><td>BP1605</td><td></td></tr><tr><td>Ham’s F12</td><td>Corning</td><td>10-080</td><td></td></tr><tr><td>Supplément N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>supplément B27, sans vitamine A</td> Life <td>Technologies</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Stempro-34 (SP34)</td><td>Life Technologies</td><td>10639011</td><td>"SP34"</td></tr><tr><td>Facteur de croissance réduit Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>"MAT"</td></tr><tr><td>Acide L-absorbique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Transferrine sérique humaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10652202001</td><td></td></tr><tr><td>Monothioglycérol (MTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase B</td><td>Roche</td><td>11088831001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase II</td> Life <td>Technologies</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D Systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>R& D Systems</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>R& D Systems</td><td>255-SC</td><td></td></tr><tr><td>IGF-1</td><td>R& D Systems</td><td>291-G1</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>R& D Systems</td><td>203-IL</td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>R& D Systems</td><td>206-IL</td><td></td></tr><tr><td>IL-7</td><td>R& D Systems</td><td>207-IL</td><td></td></tr><tr><td>IL-11</td><td>R& D Systems</td><td>218-1L</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>R& D Systems</td><td>288-TP</td><td></td></tr><tr><td>EPO</td><td>Peprotech</td><td>100-64</td><td></td></tr><tr><td>Flt-3 ligand (FLT3-L)</td><td>R& D Systems</td><td>308-FK</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>IWP2</td><td>Tocris</td><td>3533</td><td></td></tr><tr><td>Angiotensine II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9525</td><td></td></tr><tr><td>Losartan Potassium</td><td>Tocris</td><td>3798</td><td></td></tr><tr><td>CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4</td><td>BD Biosciences</td><td>560650</td><td>Dilution 1:100 ; Dosage des lymphocytes</td></tr><tr><td>T CD8 PE Clone RPA-T8</td><td>BD Biosciences</td><td>561950</td><td>Dilution 1:10 ; Dosage des lymphocytes</td></tr><tr><td>T CD34 APC Clone 8G12</td><td>BD Biosciences</td><td>340441</td><td>Dilution 1:100 ; Test EHT</td></tr><tr><td>CD34 PE-Cy7 Clone 8G12</td><td>BD Biosciences</td><td>348801</td><td>Dilution 1:100 ; Endothélium</td></tr><tr><td>hémogénique CD43 FITC Clone 1G10</td><td>BD Biosciences</td><td>555475</td><td>Dilution 1:10 ; Endothélium hémogénique</td></tr><tr><td>CD45 APC-Cy7 Clone 2D1</td><td>BD Biosciences</td><td>557833</td><td>Dilution 1:50 ; Dosage des lymphocytes</td></tr><tr><td>T CD45 eFluor450 Clone 2D1</td><td>BD Biosciences</td><td>642284</td><td>Dilution 1:50 ; Test EHT</td></tr><tr><td>CD56 APC Clone B159</td><td>BD Biosciences</td><td>555518</td><td>Dilution 1:20 ; Dosage des lymphocytes</td></tr><tr><td>T CD73 PE Clone AD2</td><td>BD Biosciences</td><td>550257</td><td>Dilution 1:50 ; Endothélium hémogénique</td></tr><tr><td>CD184 Clone APC 12G5</td><td>BD Biosciences</td><td>555976</td><td>Dilution 1:50 ; endothélium hémogénique</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)</td><td>BD Biosciences</td><td>564907</td><td>Dilution 1:10 000 ; Dosage des lymphocytes</td></tr><tr><td>T Cellules</td><td></td><td></td> OP9 DL4 <td>Holmes, R. et J.C. Zuniga-Pflucker. Printemps froid Harb Protoc, 2009. 2009(2) : p. pdb prot5156</td></tr><tr><td>MethoCult H4034</td><td>Stemcell Technologies</td><td>4034</td><td>"MeC"</td></tr><tr><td>Système de purification d’eau Milli-Q</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 % CO2 incubateur</td><td></td><td></td><td>Set à 37 C</td></tr><tr><td>Incubateur</td><td></td><td></td> multigaz <td>Set à 37 C, 5 % CO2, 5 % O2</td></tr> 6 <tr><td>puits plaque de culture tissulaire</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire à 24 puits</td><td>Corning</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire à faible adhérence à 6 puits</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire à faible adhérence à 24 puits</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture tissulaire de 35 mm</td><td>Corning</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille à extrémité arrondie, calibre 16</td><td>Corning</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>seringues</td> <td>de 3 ccTube</td><td></td> à essai en polypropylène Corning 309657 <td></td></tr><tr><td>5 mL Tube à essai en polystyrène</td><td>Corning</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Tube à essai en polypropylène</td><td>conique Corning</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>15 mL</td><td></td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>cône en polypropylène</td><td>Corning</td><td>430921</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Pipette sérologique</td><td>Corning</td><td>357507</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique 5 mL</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique 10 mL</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique 25 mL</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Racleurs cellulaires</td><td>Corning</td><td>353085</td> 2,0 mL cryoviaux Corning 430488 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL tube à essai avec 40 &micro ; Crépine à cellules M</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro ; Filtre à cellules M</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td></td><td></td><td></td>de culture cellulaire</tr><tr><td>Hotte</td><td></td><td></td><td></td>de biosécurité</tr><tr><td>FACS AriaII ou équivalent</td> LSRii ou équivalent <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>logiciel FlowJo TreeStar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bain</td><td></td><td></td><td>d’eau réglé à 37 °C</td></tr><tr><td>0,22 et micro ; Système de filtration M</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 C réfrigérateur-20</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>C Congélateur-80</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>C Congélateur</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

réalisé la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitif des cellules souches pluripotentes humaines

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Un des objectifs majeurs pour la médecine régénérative est la production et la maintenance de cellules souches hématopoïétiques (CSH) dérivé des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs). Jusqu'à une date récente, efforts pour hPSCs se différencient en CSH ont généré principalement des progéniteurs hématopoïétiques qui manquent potentiel d’HSC et plutôt ressembler à l’hématopoïèse sac vitellin. Ces progéniteurs hématopoïétiques qui en résulte peuvent ont une utilité pour in vitro de modélisation maladie de divers troubles hématopoïétiques adultes, particulièrement ceux des lignées lymphoïdes limitée. Cependant, nous avons récemment décrit des méthodes pour générer l’érythro-myélo-lymphoïdes multilignées progéniteurs hématopoïétiques définitifs de hPSCs à l’aide d’un protocole spécifique au stade de différenciation dirigée, qui nous exposons ici. Par le biais de dissociation enzymatique du hPSCs sur la membrane basale enduit de matrice ustensiles en plastique, corps embryoïdes (EBs) sont forment. EBs sont différenciés au mésoderme par BMP4 recombinant, qui est spécifié par la suite au programme hématopoïétique définitif par l’inhibiteur de la GSK3β, CHIR99021. Alternativement, l’hématopoïèse primitif est spécifiée par l’inhibiteur de la PORCN, IWP2. Hématopoïèse est plus entraîné par l’addition de recombinant VEGF et soutien hématopoïétique cytokines. Les progéniteurs hématopoïétiques résultants générés à l’aide de cette méthode ont le potentiel d’être utilisé pour la modélisation du développement, in vitroet de maladie.

Un schéma illustrant l’induction des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitives de hPSCs est illustré à la Figure 1. Mésoderme structuration par canonique WNT signaling se produit pendant les jours 2 et 3 de la différenciation, suivie de la spécification des cellules souches hématopoïétiques.
Représentatif de cytométrie et formant les dosages de méthylcellulose de cultures hPSC dérivé d...

Nous présentons ici pluripotentes humaines protocoles de culture de cellules souches (hPSC), utilisés pour différencier les hPSCs en CD34+ progéniteurs hématopoïétiques. Cette méthode utilise la manipulation spécifique au stade de canonique WNT de signalisation indiquer les cellules exclusivement pour le programme hématopoïétique de définitif ou primitif.

Réalisé la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitif des cellules souches pluripotentes humaines

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

L'objectif général de cette méthode est d'orienter la différenciation des cellules souches pluripotentes humaines vers le programme hématopoïétique primitif ou définitif en utilisant une approche de modulation spécifique aux stades. Cette méthode peut répondre à de nombreuses questions clés dans le domaine, telles que la compréhension des régulateurs signalétiques et transcriptionnels de l'hématopoïèse définitive humaine. Le principal avantage de cette technique réside dans son utilisation d'une modulation spécifique au stade appliquée instantanément.Carissa Dege, post-doctorante dans mon laboratoire, démontre cette procédure. Pour commencer le protocole, obtenez des lignées de cellules souches pluripotentes humaines ou HPSC préparées au préalable et cultivées sur des fibroblastes embryonnaires de souris ou MEF jusqu'à une confluence de 70 à 80 % dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2. Aspirez le milieu des HPSC et ajoutez un millilitre de trypsine-EDTA 0,25 % à 37 °C dans chaque puits pendant une minute.Après une minute, aspirer la trypsine et ajouter un millilitre de milieu stock dans chaque puits. À l’aide d’un grattoir à cellules, détacher les cellules de la plaque. Ensuite

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Génération des lymphocytes T à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPS) donne une approche alternative de l'utilisation de cellules souches embryonnaires à des cellules T à base d'immunothérapie. Procédé montre que, en utilisant...

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Réalisé la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitif des cellules souches pluripotentes humaines

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