Champ local Fluorescence Microscopy: Imagerie signaux cellulaires dans les coeurs intacts

L’objectif global de cette technique d’imagerie par microscopie à fluorescence en champ local est d’utiliser des sondes moléculaires pour mesurer les niveaux de calcium intracellulaire, ou les potentiels membranaires des régions cardiaques difficiles d’accès au niveau de l’ensemble du cœur. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions cardiovasculaires clés liées à l’arrêt cardiaque et à l’ischémie. Le principal avantage de cette technique est que les propriétés cardiaques sont mesurées à partir d’événements cellulaires dans l’organe intact où les cellules continuent d’être couplées électriquement, mécaniquement et métaboliquement.

Tout d’abord, préparez l’appareil horizontal de Langendorff. Chargez la solution Tyrode fraîchement préparée dans les seringues de 60 millilitres et ajoutez tous les tubes associés à l’installation. Une fois rempli, éliminez toutes les bulles d’air.

Ensuite, équilibrez la solution chargée avec de l’oxygène gazeux pur délivré par une pierre à air en plastique immergée. Ensuite, placez une suture chirurgicale non résorbable autour d’une aiguille. Celui-ci servira de canule pour rétroperfusionner le cœur lorsqu’il est attaché à l’appareil.

Ensuite, récupérez le cœur après avoir injecté de l’héparine et euthanasié l’animal. Tout d’abord, nettoyez la poitrine avec de l’éthanol. La démonstration se fait avec une souris, mais la même procédure fonctionne pour le prélèvement de cœurs de perruches.

Ensuite, à l’aide de ciseaux de dissection, faites une incision dans le bas-ventre, puis coupez les côtés vers le cou. Ensuite, ouvrez soigneusement le diaphragme, en évitant le cœur. Maintenant, retirez le tissu coupé et épinglez-le.

Ensuite, retirez les poumons et les tissus environnants pour exposer le cœur. Une fois exposé, utilisez une pince à épiler pour retirer le cœur sans le presser. Détachez-le de l’animal en coupant l’aorte et laissez autant d’aorte attachée au cœur que possible.

Ensuite, chargez le cœur dans un petit bateau de pesée avec un millilitre de solution Tyrode. À l’aide d’un microscope à dissection, retirez rapidement le sang et le tissu adipeux entourant le cœur à l’aide d’une pince à épiler et de ciseaux. À l’aide d’une suture chirurgicale non résorbable et d’une aiguille, fixez l’aorte à la connexion horizontale de l’appareil de Langendorff.

Fixez le nœud à l’aide de deux pinces fines. Ensuite, commencez la rétroperfusion en ouvrant la valve pour libérer la solution de Tyrode. Nettoyez les tissus environnants et aspirez les débris pour maintenir la chambre horizontale propre pendant que le cœur se stabilise pendant 10 minutes.

Faites la teinture fraîche. Pour Rhod-2 AM, ajoutez 20 microlitres de 20 % de Pluronic et de DMSO à l’emballage de 50 microgrammes de colorant du fabricant. Mélanger par pipetage, en évitant les bulles.

Ensuite, transférez le colorant liquéfié dans un flacon en verre transparent et ajoutez un millilitre de solution Tyrode. Dissoudre soigneusement le colorant dans ce mélange en utilisant 15 à 20 minutes de sonication. Ensuite, perfuser le colorant préparé à l’aide d’une pompe péristaltique à température ambiante.

Tout d’abord, chargez le colorant dans la chambre de teinture, puis fixez toutes les conduites de tubes connectées au collecteur et maintenez les pinces au-dessus du collecteur pour éviter le refoulement. Ensuite, allumez la pompe et fermez immédiatement la valve à trois voies sous la seringue de 60 millilitres. Placez le petit tube fixé à l’extrémité d’aspiration de la pompe à côté du cœur pour faire recirculer le colorant après qu’il ait été perfusé.

Prenez une aiguille de petit calibre et pincez-la à travers l’apex pour soulager la pression. Ensuite, laissez le cœur perfuser avec le colorant pendant 30 minutes. Pendant ce temps, il est très important d’évaluer le niveau de colorant afin que les bulles ne pénètrent pas dans les tissus, ce qui provoquerait une ischémie et des lésions tissulaires.

Après avoir perfusé le colorant, rétroperfusionnez le cœur avec la solution de Tyrode. Retirez la pince au-dessus du collecteur. Ouvrez la valve, puis laissez le cœur se stabiliser pendant 10 minutes.

Pendant la rétroperfusion, remplissez la chambre horizontale avec la solution Tyrode et allumez l’unité Peltier pour amener la température du bain à 37 degrés Celsius. Pour préparer la lumière à fibre optique pour l’expérience, placez d’abord la fibre optique à l’intérieur d’une pipette de deux millilitres. Ensuite, fixez la pipette à un micromanipulateur.

Utilisez le micromanipulateur pour appuyer légèrement la fibre optique contre la surface du ventricule latéral. Ensuite, programmez un générateur d’ondes pour qu’il fournisse une impulsion carrée d’une largeur d’une milliseconde. Et réglez un stimulateur cardiaque pour qu’il soit synchronisé de l’extérieur et connecté au générateur d’ondes.

À chacune des deux sorties du stimulateur, attachez un fil avec une aiguille d’acupuncture soudée à l’extrémité. Fixez deux aiguilles d’acupuncture à l’apex du cœur, à environ trois millimètres l’une de l’autre. Ce n’est qu’une fois les aiguilles placées que le stimulateur démarre, évitant ainsi les chocs accidentels.

Maintenant, pour enregistrer le signal épicardique, ajustez la fréquence d’acquisition dans le logiciel à 10 kilohertz. Pour recueillir le signal endocardique, suivez la même procédure, mais utilisez une aiguille de calibre 23 pour percer un trou dans le ventricule latéral près du septum. Et puis, à l’aide d’un micromanipulateur, positionnez la deuxième fibre optique dans l’endocarde.

Pour accéder à la fonction transmurale, la morphologie des potentiels d’action enregistrés à partir de l’endocarde et de l’épicarde a été comparée. Des enregistrements de fluorescence ont été réalisés après traitement du cœur avec du di-8-ANEPPS à l’aide de la technique CLFFM. Le potentiel d’action était plus lent dans l’endocarde, en particulier dans la première phase.

La durée du potentiel d’action a été décrite comme le temps qu’il faut pour que le potentiel d’action se repolarise dans une certaine mesure. Lorsque les durées ont été normalisées et décalées pour se chevaucher à la phase zéro, elles ont pu être comparées. Il y avait en effet une différence significative au cours de la première phase.

Ensuite, Rhod-2 AM a été utilisé pour surveiller le calcium intracellulaire. Afin de comparer les différences régionales dans le calcium intracellulaire, la cinétique de la transémience calcique a été évaluée. En comparaison, le temps nécessaire pour atteindre le pic de la fugacité était d’environ deux millisecondes plus long dans l’endocarde.

Dans l’ensemble, la transience calcique de l’endocarde avait une cinétique significativement plus lente que celle de l’épicarde. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour enregistrer la transémience et les potentiels d’action du calcium intracellulaire dans les régions difficiles d’accès du cœur. La partie Langendorff de la configuration rend très pratique la perfusion de différents produits chimiques dans le cœur et l’évaluation des effets sur les propriétés cardiaques.