Les modèles aigus et chroniques de l'hyperglycémie dans le poisson-zèbre: une méthode pour évaluer l'impact de l'hyperglycémie sur la neurogénèse et la biodisposition des molécules radiomarquées

L’objectif global de la procédure suivante est d’évaluer le remodelage cérébral dans des conditions hyperglycémiques et de suivre les molécules radiomarquées chez le poisson zèbre. L’hyperglycémie se caractérise par une concentration excessive de glucose dans le sang. L’hyperglycémie chronique peut être due à des conditions diabétiques et provoquer différents dysfonctionnements vasculaires, qui peuvent à leur tour déclencher des complications cliniques, telles que l’infarctus du myocarde, les accidents vasculaires cérébraux ou les ulcères du pied diabétique.

De plus, l’hyperglycémie aiguë due au stress peut favoriser des complications hémorragiques en cas d’AVC ischémique. Le poisson-zèbre est un modèle intéressant pour comprendre les maladies humaines et leur impact sur le système nerveux central. C’est particulièrement vrai, étant donné que le cerveau des poissons adultes présente une capacité neurogène intense et une capacité exceptionnelle pour les mécanismes de réparation du cerveau, par rapport aux mammifères, par conséquent, les poissons-zèbres représentent un bon modèle pour étudier le remodelage du cerveau, après un stress dans des conditions aiguës et hyperglycémiques.

Il permet également d’étudier la biodistribution de molécules radiomarquées et d’agents thérapeutiques potentiels. Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives des communautés françaises et européennes pour l’utilisation des animaux en recherche, et approuvées par le comité local d’éthique de l’expérimentation animale. Attrapez un poisson en douceur avec un filet de pêche.

Mettez le poisson dans un petit volume d’anesthésique tricaïne, dilué à une concentration finale de 0,02 % dans l’eau. Attendez que le poisson cesse de bouger. Retirez le poisson, à l’aide d’une pipette coupée, et placez-le délicatement sur du papier de soie absorbant pour enlever un maximum d’eau.

Pesez le poisson afin de préparer une seringue de d-glucose pour injection, de 50 microlitres de 2,5 grammes par kilo de poids corporel. Par exemple, un poisson de 0,6 gramme recevra 50 microlitres d’une solution PBS à 3 % de glucose. Mettez le poisson sur son dos et maintenez-le d’une main.

De l’autre main, insérez l’aiguille de la seringue dans la cavité intrapéritonéale et injectez lentement la solution de d-glucose PBS. Retirez l’aiguille et remettez le poisson dans l’eau du poisson. Vérifiez le poisson jusqu’à ce qu’il se rétablisse complètement.

Leur glycémie est généralement mesurée après 1 heure et demie. Afin d’imiter l’hyperglycémie chronique, préparez un réservoir de deux litres de d-glucose, à une concentration finale de 111 millimolaires. Pour cela, pesez 40 grammes de d-glucose et mettez-le dans un réservoir vide.

Remplissez le réservoir avec deux litres d’eau de poisson et placez-y jusqu’à sept poissons. Changez la solution de glucose tous les deux jours, afin d’éviter la croissance de bactéries ou d’autres micro-organismes. L’hyperglycémie chronique est obtenue par un traitement de 14 jours au d-glucose.

Attrapez un poisson avec un filet de pêche et mettez-le sur de la glace. Couvrez le poisson de glace pour une euthanasie rapide. Prenez le poisson et essuyez-le, afin d’éliminer toute goutte d’eau qui pourrait diluer les échantillons de sang.

Retirez un œil à l’aide d’une pince à dissection et attendez que la cavité oculaire soit remplie de sang. Placez une bandelette de test sur le glucomètre et insérez-la dans la cavité oculaire. Notez la valeur de la concentration de glucose dans le sang.

Pour l’hyperglycémie aiguë, une injection intrapéritonéale de d-glucose induit une augmentation significative de la glycémie, comme indiqué, 1 heure et demie après l’injection. Pour l’hyperglycémie chronique, l’immersion du poisson dans une solution de d-glucose entraîne une augmentation significative de la glycémie, comme on le voit après 14 jours de traitement. À la fin de la procédure, séparez le corps de la tête avec des ciseaux de dissection et mettez la tête dans 4 % de paraformaldéhyde, dilué dans du PBS pour des expériences d’immunohistochimie.

Incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Alternativement, le cerveau peut être directement extrait et congelé pour d’autres expériences, telles que l’extraction d’ARNm. Le lendemain, les têtes fixes sont rincées au PBS et maintenues à l’aide d’une aiguille sous un microscope à dissection.

L’œil restant est retiré et le haut du crâne est doucement ouvert avec des pinces. Le cerveau est ensuite soigneusement extrait et placé dans 1x PBS. Les cerveaux fixes sont déshydratés par étapes, dans une série de concentrations croissantes d’éthanol, suivies de deux bains de toluène de 30 minutes.

Les cerveaux sont ensuite placés dans une cassette d’enrobage et le couvercle est soigneusement fermé. Mettez la cassette dans de la paraffine fondue, à 58 à 60 degrés Celsius. Pendant l’incorporation de la paraffine dans le cerveau, allumez la pince à inclusion chauffante.

Mettez la cassette dans un bain de paraffine propre. A la fin des bains de paraffine, sortez la cassette. Versez un peu de paraffine liquide dans un moule.

Ouvrez la cassette et placez le cerveau dans de la paraffine fondue dans le moule. Orientez le cerveau avec la pince à inclusion chauffante. Remplissez le moule de paraffine fondue et laissez-le durcir sur la partie refroidissante de la machine d’enrobage.

Pour des raisons techniques, le cerveau doit être positionné selon un axe antéro-postérieur. Après avoir démoulé le bloc de paraffine, recadrez-le, et fixez-le sur une cassette avec de la paraffine fondue, dans la bonne orientation pour permettre un sectionnement transversal. Insérez le bloc de paraffine dans le bras d’un microtome et coupez des sections de 50 micromètres, jusqu’à ce que vous atteigniez le niveau de l’échantillon de cerveau.

Ensuite, coupez le bloc de paraffine pour obtenir un trapèze et ajustez l’épaisseur de section à sept micromètres. Récupérez les rubans de paraffine avec un pinceau fin et placez-les sur un papier noir. Coupez les rubans de paraffine toutes les trois à quatre sections.

Placez une lame sur une plaque chauffante et couvrez-la d’eau distillée. Positionnez doucement les sections sur l’eau sur le toboggan et réchauffez-vous à 40 degrés Celsius. Lorsque les rubans de paraffine sont suffisamment étalés, retirez l’eau avec un tissu absorbant.

Les dernières gouttes sont retirées mécaniquement, comme indiqué. Laissez sécher la lame au moins deux heures avant d’effectuer la procédure d’immunohistochimie décrite dans le protocole. Après l’immunohistochimie, les lames sont analysées sous un microscope à épifluorescence, ou microscope confocal, afin d’étudier l’impact de l’hyperglycémie sur la prolifération des cellules cérébrales.

La quantification des cellules cérébrales est effectuée sur au moins trois sections successives, ou une région d’intérêt. Ici, les cellules prolifératives correspondant aux cellules positives au PCNA apparaissent en vert. Comme vous pouvez le constater, l’hyperglycémie chronique induit une diminution du nombre de cellules prolifératives, marquées en vert avec des anticorps PCNA, dans le télencéphale ventral, le télencéphale dorsal et l’hypothalamus caudal, autour des cavités latérales et postérieures.

Alternativement, pour étudier les effets de l’hyperglycémie sur la neurogenèse induite par une blessure, une blessure au couteau du télencéphale peut être réalisée pendant le traitement de l’hyperglycémie chronique. Pour cela, anesthésez un poisson traité pendant sept jours et placez-le sous un microscope à dissection. Poussez une seringue de calibre 30 verticalement à travers le crâne, au centre de l’hémisphère télencéphale droit.

Après cette procédure, le poisson doit être renvoyé dans son aquarium pendant le temps requis. Ici, le poisson a été laissé survivre sept jours dans de l’eau de d-glucose, avant d’être sacrifié. La blessure par arme blanche du télencéphale régule fortement la prolifération dans l’hémisphère blessé, sept jours après la lésion.

Nos données montrent que l’hyperglycémie chronique induit une diminution significative des processus de guérison du cerveau, en diminuant la prolifération cellulaire après une blessure au couteau du télencéphale. Le poisson-zèbre peut également être utilisé pour étudier la biodistribution des molécules radiomarquées. Ici, nous avons décidé d’étudier le métabolisme du glucose dans l’organisme du poisson zèbre.

Le poisson doit d’abord être anesthésié et placé sur un tissu imbibé d’anesthésiques. Le poisson est ensuite placé derrière une fenêtre de radioprotection. La seringue contenant 50 microlitres de fluorodésoxyglucose est préparée.

Le poisson est positionné sur le dos, et injecté par voie intrapéritonéale avec 50 microlitres de FDG à 20 mégabecquerel. Le poisson est ensuite placé sur un autre tissu imbibé d’anesthésiques. Il est délicatement enveloppé et positionné sur le bras d’un imageur TEP.

Le bras est inséré dans la TEP et la procédure d’imagerie est effectuée. Ici, vous pouvez noter que le FDG n’est pas seulement détecté au site d’injection, mais aussi dans la tête du poisson, notamment, dans le cerveau, et tout le long de la moelle épinière. Dans cette étude, nous proposons deux méthodes différentes pour établir l’hyperglycémie aiguë et chronique chez le poisson zèbre, et nous montrons que l’hyperglycémie altère la prolifération des cellules cérébrales dans des conditions normales et induites par des blessures.

En conclusion, le poisson-zèbre peut être utilisé comme modèle pertinent pour étudier les effets délétères de l’hyperglycémie dans le système nerveux central. Il permet également d’évaluer la biodistribution des molécules radiomarquées par TEP.