Les modèles aigus et chroniques de l'hyperglycémie dans le poisson-zèbre: une méthode pour évaluer l'impact de l'hyperglycémie sur la neurogénèse et la biodisposition des molécules radiomarquées

L'objectif général de la procédure suivante est d'évaluer le remodelage cérébral dans des conditions d'hyperglycémie et de suivre des molécules marquées par radioactivité chez le poisson-zèbre. L'hyperglycémie se caractérise par une concentration excessive de glucose sanguin. Une hyperglycémie chronique peut résulter de troubles diabétiques et provoque diverses dysfonctions vasculaires, qui peuvent à leur tour entraîner des complications cliniques telles qu'un infarctus du myocarde, un accident vasculaire cérébral ou des ulcères du pied diabétique.

En outre, une hyperglycémie aiguë due au stress peut favoriser des complications hémorragiques lors d'un accident cérébrovasculaire ischémique. Le poisson zèbre constitue un modèle intéressant pour comprendre les maladies humaines et leurs effets sur le système nerveux central. Cela est particulièrement vrai étant donné que le cerveau du poisson adulte présente une capacité neurogénique intense ainsi qu'une remarquable aptitude aux mécanismes de réparation cérébrale, par comparaison aux mammifères ; par conséquent, le poisson zèbre représente un bon modèle pour étudier la remodélisation cérébrale suite à un stress dans des conditions aiguës et hyperglycémiques.

Il permet également d'étudier la biodistribution de molécules marquées au radionucléide et d'agents thérapeutiques potentiels. Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives françaises et européennes relatives à l'utilisation des animaux à des fins de recherche, et ont été approuvées par le comité d'éthique local pour l'expérimentation animale. Attraper un poisson délicatement à l'aide d'un filet à poisson.

Placer le poisson dans un petit volume d'anesthésique à la tricaine, dilué à une concentration finale de 0,02 % dans l'eau. Attendre jusqu'à ce que le poisson cesse de bouger. Retirer le poisson à l'aide d'une pipette coupée et le placer délicatement sur du papier absorbant afin d'éliminer un maximum d'eau.

Procéder au pesage du poisson afin de préparer une seringue de d-glucose destinée à une injection, correspondant à 50 microlitres de 2,5 grammes par kilo de poids corporel. Par exemple, un poisson de 0,6 gramme recevra 50 microlitres d'une solution de PBS contenant 3 % de d-glucose. Placer le poisson sur le dos et le maintenir avec une main.

Avec l'autre main, insérer l'aiguille de la seringue dans la cavité intrapéritonéale et injecter lentement la solution de d-glucose dans le PBS. Retirer l'aiguille et remettre le poisson dans l'eau d'élevage. Surveiller le poisson jusqu'à ce qu'il se soit complètement rétabli.

Les taux de glucose sanguin sont généralement mesurés après 1 heure et demie. Afin de simuler une hyperglycémie chronique, préparez un réservoir de deux litres de d-glucose, à une concentration finale de 111 millimolaire. Pour ce faire, pesez 40 grammes de d-glucose et placez-les dans un réservoir vide.

Remplir le réservoir avec deux litres d'eau pour poissons et y placer jusqu'à sept poissons. Changer la solution de glucose tous les deux jours afin d'éviter la croissance de bactéries ou d'autres micro-organismes. Une hyperglycémie chronique est obtenue par un traitement de 14 jours avec du d-glucose.

Capturez un poisson à l’aide d’un filet, puis placez-le sur de la glace. Recouvrez le poisson de glace afin d’assurer une euthanasie rapide. Prenez le poisson et essuyez-le pour éliminer toute goutte d’eau susceptible de diluer les échantillons de sang.

Retirez un œil à l’aide de pinces de dissection et attendez que la cavité oculaire soit remplie de sang. Placez une bandelette réactive sur le glucomètre, puis insérez la bandelette dans la cavité oculaire. Notez la valeur de la concentration de glucose sanguin.

Pour l'hyperglycémie aiguë, une injection intrapéritonéale de d-glucose induit une augmentation significative des taux de glucose sanguin, comme indiqué, 1 heure et demie après l'injection. Pour l'hyperglycémie chronique, l'immersion des poissons dans une solution de d-glucose entraîne une augmentation significative des taux de glucose sanguin, comme observé après 14 jours de traitement. À la fin de la procédure, séparez le corps de la tête à l’aide de ciseaux de dissection, puis placez la tête dans du paraformaldéhyde à 4 %, dilué dans du PBS, pour des expériences d’immunohistochimie.

Incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Alternativement, le cerveau peut être directement extrait et congelé pour d'autres expériences, telles que l'extraction d'ARNm. Le jour suivant, les têtes fixées sont rincées au PBS et maintenues à l'aide d'une aiguille sous un microscope stéréoscopique.

L'œil restant est retiré, et le sommet du crâne est doucement ouvert à l'aide de forceps. Le cerveau est ensuite soigneusement extrait et placé dans du PBS 1x. Les cerveaux fixés sont déshydratés progressivement, selon une série d'augmentation des concentrations d'éthanol, suivie de deux bains de 30 minutes de toluène.

Les cerveaux sont ensuite placés dans une cassette d'inclusion, et le couvercle est soigneusement fermé. Placer la cassette dans de la paraffine fondue, à une température de 58 à 60 degrés Celsius. Pendant l'inclusion des cerveaux dans la paraffine, allumer la pince chauffante.

Placer la cassette dans un bain de paraffine propre. À la fin des bains de paraffine, retirer la cassette. Verser un peu de paraffine liquide dans un moule.

Ouvrez la cassette et placez le cerveau dans la paraffine fondue du moule. Orientez le cerveau à l’aide des pinces chauffantes pour inclusions. Remplissez le moule avec la paraffine fondue et laissez durcir sur la partie de refroidissement de l’incubateur d’inclusion.

Pour des raisons techniques, le cerveau doit être positionné selon un axe antéro-postérieur. Après avoir démoulé le bloc de paraffine, découpez-le et fixez-le sur une cassette à l’aide de paraffine fondue, en veillant à l’orientation correcte pour permettre la section transversale. Insérez le bloc de paraffine dans le bras d’un microtome et effectuez des coupes de 50 micromètres jusqu’à atteindre le niveau de l’échantillon cérébral.

Ensuite, tailler le bloc de paraffine pour obtenir un trapèze, puis régler l'épaisseur de coupe à sept micromètres. Ramasser les rubans de paraffine à l’aide d’un pinceau fin et les déposer sur un papier noir. Couper les rubans de paraffine tous les trois à quatre sections.

Placer une lame sur une plaque chauffante et la recouvrir d'eau distillée. Positionner délicatement les sections sur l'eau de la lame et chauffer jusqu'à 40 degrés Celsius. Lorsque les rubans de paraffine sont suffisamment étalés, retirer l'eau à l'aide d'un papier absorbant.

Les dernières gouttes sont éliminées mécaniquement, comme illustré. Laisser sécher la lame pendant au moins deux heures avant de réaliser la procédure d'immunohistochimie décrite dans le protocole. Après l'immunohistochimie, les lames sont analysées au microscope à épifluorescence ou confocal afin d'étudier l'impact de l'hyperglycémie sur la prolifération des cellules cérébrales.

La quantification des cellules cérébrales est effectuée sur au moins trois sections successives ou sur une région d'intérêt. Ici, les cellules prolifératives, correspondant aux cellules positives pour la PCNA, apparaissent en vert. Comme vous pouvez le constater, l'hyperglycémie chronique induit une diminution du nombre de cellules prolifératives, marquées en vert à l'aide d'un anticorps anti-PCNA, dans le télencéphale ventral, le télencéphale dorsal et l'hypothalamus caudal, autour du recessus latéral et postérieur.

Alternativement, pour étudier les effets de l'hyperglycémie sur la neurogenèse induite par une lésion, une blessure par piquage du télencéphale peut être réalisée pendant un traitement hyperglycémique chronique. Pour ce faire, anesthésiez un poisson traité depuis sept jours et placez-le sous un microscope stéréoscopique. Enfoncez verticalement une seringue de calibre 30 à travers le crâne, jusqu'au centre de l'hémisphère télencéphalique droit.

Après cette procédure, le poisson doit être replacé dans son aquarium pendant la durée requise. Ici, on a laissé le poisson survivre sept jours dans de l'eau contenant du d-glucose, avant de le sacrifier. Une lésion par coup de couteau dans le télencéphale induit fortement la prolifération dans l'hémisphère lésé, sept jours après la lésion.

Nos données montrent que l'hyperglycémie chronique induit une diminution significative des processus de cicatrisation cérébrale, en réduisant la prolifération cellulaire après une lésion par piqûre du télencéphale. Les zèbres peuvent également être utilisés pour étudier la biodistribution de molécules marquées au radiotraceur. Ici, nous avons décidé d'étudier le métabolisme du glucose dans l'organisme du zèbre.

Le poisson doit d'abord être anesthésié et placé sur un tissu imprégné d'anesthésique. Le poisson est ensuite placé derrière une fenêtre de protection contre les rayonnements. La seringue contenant 50 microlitres de fluorodésoxyglucose est préparée.

Le poisson est placé sur le dos et injecté par voie intrapéritonéale avec 50 microlitres de FDG à 20 mégabecquerel. Le poisson est ensuite placé sur un autre morceau de tissu imprégné d'anesthésique. Il est enveloppé délicatement et positionné sur le bras d'un imageur de tomographie par émission de positons (TEP).

Le bras est inséré dans le scanner TEP, et la procédure d'imagerie est réalisée. Ici, on peut observer que le FDG est détecté non seulement au site d'injection, mais également au niveau de la tête du poisson, notamment dans le cerveau, et tout le long de la moelle épinière. Dans cette étude, nous proposons deux méthodes différentes pour induire une hyperglycémie aiguë et chronique chez le zebrafish, et nous montrons que l'hyperglycémie altère la prolifération des cellules cérébrales dans des conditions normales ainsi que dans des conditions induites par une lésion.

En conclusion, le poisson zèbre peut être utilisé comme un modèle pertinent pour étudier les effets délétères de l'hyperglycémie sur le système nerveux central. Il permet également d'évaluer la biodistribution de molécules marquées par radioactivité à l'aide de la tomographie par émission de positons (TEP).