Name: Développement dun ADN Système économique Livraison par Acufection et son application à la recherche de la peau (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Découvrez une méthode économique d'expression d'ADN plasmidique dans la peau de souris par acufection. Cette technique permet d'étudier le rôle fonctionnel des gènes immunitaires dans l'inflammation cutanée et de développer de nouvelles thérapies.

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Ce travail a été soutenu par la subvention du ministère de la Science et de la technologie (MOST 103-2633-B-002-002, 104-2320-B-002-048). Nous remercions les Drs. Betty Wu-Hsieh et Chien-Kuo Lee à NTU, Leigh Zerboni à l&#39;Université de Stanford et le Dr Peter Hoffmann à l&#39;Université de Hawaii pour lire le manuscrit, Yun Chien à NTU pour l&#39;assistance technique, et le Dr Wen-Chi Wei à la biotechnologie agricole Centre de recherche à l&#39;Academia Sinica pour des conseils techniques.

Des souris femelles à 8 - 12 semaines ont été utilisés pour cette étude. C57 / BL6 de type sauvage (WT) et l&#39; IL-15 déficiente (IL15 - / -) souris ont été achetés auprès de Centre national des animaux de laboratoire (NLAC), Taiwan et Taconic Farm, respectivement. IL-15 déficient (IL15 - / -) et de l&#39; IL-15-dominant (+/- IL15 et l&#39; IL15 + / +) ont montré un rapport 1: 3 dans la deuxième génération de la croix des hétérozygotes de IL15. Le génotype de IL15 - / - souris a été confirmée par une analyse par PCR. Les souris ont été maintenues dans l&#39;installation spécifique exempt d&#39;organismes pathogènes (SPF) au Laboratoire Animal Center (BAC), l&#39;Université nationale de Taiwan (NTU) College of Medicine. Toutes les procédures d&#39;animaux, y compris les matériaux anesthésiques et les méthodes ont été effectuées conformément au protocole animal approuvé par l&#39;Université nationale de Taiwan College of Medicine et College of Institutional Animal Care santé publique et le Comité d&#39;utilisation (IACUC) (Affidavit d&#39;approbation du Protocole des animaux 20130225). &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 1. Préparation des aiguilles d&#39;acupuncture REMARQUE: Les aiguilles d&#39;acupuncture sont des dispositifs médicaux composés d&#39;un manche et une extrémité d&#39;aiguille (Figure 1A). Les diamètres de l&#39;aiguille d&#39;acupuncture variait de 0,2 mm (36 G) à 0,35 mm (28 G). Nous choisissons le meilleur point de l&#39;aiguille pour éviter les dommages potentiels cellulaire excessive pendant la peau repiquage. Il y a 4 longueurs différentes de l&#39;aiguille de 0,2 mm dont 13 mm (0,5 in), 25 mm (1,0 in), 40 mm (1,5 in) et 50 mm (2,0 in) de longueur. Un faisceau de 10 aiguilles d&#39;une longueur de 13 mm à condition que la poignée meilleur confort pendant oscillant l&#39;aiguille sur la peau de souris C57BL / 6. Les paramètres peuvent être modifiés si la méthode est appliquée à la peau des plus grands animaux ou réalisée par des chercheurs avec de grandes mains. <ol><li> Retirer les aiguilles d&#39;acupuncture de l&#39;emballage stérile, apyrogène. Placez les aiguilles sur un champ stérile. </li><li> Utiliser du ruban d&#39;étiquetage adhésif pour lier ensemble les aiguilles 10 ina faisceau (figure 1B). REMARQUE: Les 10 aiguilles sont géométriquement agencées pour former une forme de cylindre. Pour plus de commodité, utiliser un morceau de film de paraffine pour stabiliser l&#39;agencement avant d&#39;appliquer le ruban adhésif. Assurez-vous que tous les points d&#39;aiguille sont sur le même plan. L&#39;utilisation d&#39;un faisceau au lieu d&#39;une seule aiguille facilite la perfusion d&#39;ADN maximale en augmentant la surface de contact entre les aiguilles et la peau. </li></ol> 2. Préparation d&#39;une grande quantité et d&#39;endotoxines sans ADN plasmidique <ol><li> Transformer des cellules bactériennes chimiquement compétentes avec l&#39;ADN du plasmide. </li><li> Sélectionner et inoculer une seule colonie bactérienne dans 3 ml de milieu LB contenant des antibiotiques et incuber à 37 ° C dans un agitateur pendant une nuit. </li><li> Intensifier la culture par dilution de la culture bactérienne à 1: 100 dans 250 ml de milieu LB avec des antibiotiques et agitation pendant une nuit à 37 ° C </li><li> Préparer une grande quantité d&#39;ADN en utilisant une haute quality, kit de préparation de plasmide endotoxines suivant les instructions du fabricant. REMARQUE: Le protocole de Acufection nécessite une grande pureté et une grande quantité d&#39;ADN plasmidique. Utilisation d&#39;une haute qualité, une endotoxine libre et l&#39;ADN de plasmide purifié colonne est recommandée. </li><li> Éluer l&#39;ADN dans de l&#39;eau stérile. ADN de magasin en petites portions à -20 ° C jusqu&#39;à ce prêt pour acufection. REMARQUE: Éviter le gel et le dégel répété de l&#39;ADN pour assurer l&#39;expression de l&#39;ADN plasmidique cohérent. </li><li> Diluer l&#39;ADN de plasmide à 1 mg / mL dans du PBS stérile pour acufection. </li></ol> 3. Procédure de Acufection REMARQUE: La quantité optimale de l&#39;ADN et de l&#39;aire de la surface de la peau cible peut varier pour les différents gènes et doivent être encore optimisé. La force de piquage et le nombre de fois pour détacher la couche cornée de la peau peut également varier en fonction de l&#39;épaisseur de la peau. Ces conditions doivent être soigneusement déterminées après évaluation du niveau d&#39;expression du gene transcri acufectedpts par qRT-PCR. <ol><li> Peser les souris et administrer tribromoéthanol (400 ug par g de poids corporel) par injection peritoneale. NOTE: 2,2,2-tribromoéthanol est un agent anesthésique injectable qui a été couramment utilisé chez la souris. Les solutions sont préparées par dissolution d&#39;une qualité non pharmaceutique 2,2,2-tribromoéthanol (2,5 g) dans de l&#39;eau distillée (200 ml) contenant 2,5% de 2-méthyl-2-butanol. </li><li> Appliquer une pommade vétérinaire sur ophtalmologiques yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. REMARQUE: un effet anesthésiant sera induit dans 1 - 2 min. Vérifiez le réflexe de pincement de l&#39;orteil pour assurer une profondeur suffisante de l&#39;anesthésie avant l&#39;opération. </li><li> Raser la peau du flanc dorsal et appliquer la crème épilatoire pour dissoudre les protéines de kératine dans l&#39;arbre de cheveux. REMARQUE: L&#39;utilisation de la crème épilatoire pour enlever les poils facilitera la perfusion d&#39;ADN dans la peau. </li><li> Utilisez des boules de coton imbibé d&#39;eau pour essuyer la crème épilatoire. NOTE: La crème épilatoire est soluble dans l&#39;eau. L&#39;élimination complète de la crème will empêcher une surface grasse et d&#39;assurer un meilleur résultat picotement. </li><li> Utilisez un coton-tige stérile imbibé d&#39;éthanol à 70% pour désinfecter la surface de la peau. </li><li> Marquer la zone cible (1 cm x 1 cm) sur la peau épilée avec un pochoir pré-mesuré. NOTE: Pour marquer le site cible vous aidera à appliquer le faisceau d&#39;aiguilles vers le haut et vers le bas dans une zone définie. Ceci est important pour assurer la livraison de la même quantité d&#39;ADN à une surface spécifique afin de minimiser la variation expérience à l&#39;expérience. </li><li> Placer une goutte de 10 ul d&#39;ADN de plasmide (10 pg) sur la peau sensible. REMARQUE: La quantité d&#39;ADN pour acufection varie en fonction de différents gènes et le type de vecteur d&#39;expression. La quantité d&#39;ADN utilisé doit être soigneusement avant de procéder à titrer l&#39;expérience d&#39;intérêt. Le 10 ul est une petite goutte de liquide et il se trouve bien sur la peau rasée et épilée sans rouler vers le bas en piquant. Inclure un groupe témoin de souris traitées avec 10 ul d&#39;ADN vecteur vide pour le comparer avec une souriscufected avec le gène de l&#39;étude. </li><li> Tenir le faisceau d&#39;aiguilles d&#39;acupuncture (figure 1B) et piquer la surface marquée avec un mouvement de va-et-vient à 100 fois ou jusqu&#39;à ce que l&#39;humidité de l&#39; ADN dans du PBS sur la peau disparaît. REMARQUE: une rougeur de la surface de la peau peut se produire. Évitez de faire des coupes profondes qui saignent. Le nombre de va-et-baisse des mouvements piquage sur la surface de la peau est fonctionnellement déterminée lorsque l&#39;humidité de l&#39;ADN dans du PBS (10 ul) disparaît sur la peau. Nous avons décidé 100 fois en 30 s, car il a donné les résultats les plus constants de gènes livrés acufection. Le cas échéant, les aiguilles peuvent être réutilisés jusqu&#39;à 6 de la peau aiguillons cible (1 cm x 1 cm chacun). Rincer les aiguilles dans 70% d&#39;éthanol et entre acufection PBS. Changer de nouvelles aiguilles quand ils sont ternes ou pour différents ADN plasmidique pour éviter la contamination croisée. </li><li> Placer les souris acufected sur un coussin chauffant pour maintenir la température du corps jusqu&#39;à éveillé. </li><li> Retour souris dans leur cage quand ils ontrepris conscience suffisante. Remarque: Gardez les souris acufected dans une cage séparée (moins de 5 animaux par cage) de la cage de souris un-acufected. </li><li> Mettez une bouteille d&#39;eau en place et retourner la cage au rack IVC (cage ventilée individuellement). </li></ol> 4. Les soins postopératoires <ol><li> Pour les premières 48 heures après la procédure, suivre de près les souris pour tout inconfort, y compris des changements de comportement (agitation, agitation ou trouble de l&#39;alimentation) ou apparence anormale (poil rugueux ou posture recroquevillée). </li></ol> 5. L&#39;imiquimod (IMQ) Traitement de l&#39;IL-15ΔE7-acufected peau REMARQUE: l&#39;expression transcriptionnelle et la production de protéines du gène acufected sont détectables au jour 3. Les souris acufected avec le plasmide d&#39;intérêt peut être traité avec différents types de stimulants 3 jours après la transfection. Nous illustrons ici en traitant la peau de la souris acufected IL-15ΔE7 à la crème IMQ. IMQ est un f approuvé amine imidazoquinolinou le traitement de verrues génitales externes et périnatales 13. IMQ traitement topique est représenté à induire des troubles de la peau comme le psoriasis, l&#39; homme chez la souris avec la manifestation de la peau squameuse, la prolifération de l&#39; épiderme et de l&#39; infiltration des neutrophiles dermique 12, 14, 15. NOTE: Le vecteur de plasmide contenait souris de longueur totale de l&#39;IL-15 d&#39;ADNc, sous la régulation du facteur 1 d&#39;allongement α (PEF), flanqué d&#39;un peptide signal de l&#39;IL-2 et un marqueur FLAG à l&#39;extrémité C-terminale (pEF-IL- 15, 5859 paires de bases), qui a été construit comme décrit par Bamford et al. 16. Le plasmide est utilisé comme un modèle de l&#39;IL-15 pour supprimer les 16 premiers acides aminés au niveau des résidus 33-48 dans l&#39;exon 7 de l&#39;IL-15 gène de IL-15ΔE7 (pEF-IL-15ΔE7, 5.811 paires de bases) par SOE (synthèse par extension de chevauchement) de la méthode PCR 17. Des colonies bactériennes qui ont été avec succèstransformée avec IL-15ΔE7 ont été vérifiées par digestion par enzyme de restriction et suivie d&#39; un séquençage d&#39;ADN 12, 18. Une grande quantité d&#39;ADN plasmidique exempt d&#39;endotoxine est préparé comme décrit dans l&#39;étape 2 du protocole. <ol><li> Anesthésier les souris acufected par injection intraperitoneale de tribromoéthanol (400 ug par g de poids corporel) et appliquer une pommade ophtalmologique vétérinaire sur les yeux pour empêcher sec sous anesthésie. Vérifiez le réflexe de pincement de l&#39;orteil pour assurer une profondeur suffisante de l&#39;anesthésie avant le début des procédures opératoires. NOTE: Depuis un 2 cm x 2 peau cm sera traitée pour IMQ, 2 doses de s&#39;acufected sur 2 sites cibles d&#39;ADN plasmide pIL-15ΔE7 (10 ug dans 10 ul de PBS par dose) (1 cm x 1 cm chacun). </li><li> Mark peau flanc (2 cm x 2 cm) recouvrant la zone acufected. </li><li> Utilisez applicateur Q-tip pour appliquer par voie topique de la crème IMQ sur l&#39;aire de surface marquée. Note: l&#39;étape 5.1 est effectué uniquement pour la première dose (60 mg / dose).Les doses suivantes consécutives sont appliquées à des souris non anesthésiées. </li><li> Documenter les changements de la peau dorsale traitée IMQ quotidienne avec un caméscope haute définition. Remarque: Une personne tient la souris tandis qu&#39;un autre enregistrement. Les images fixes sont prises et modifiées ultérieurement. </li><li> Euthanasier des souris par injection d&#39;une surdose de tribromoéthanol (800 ug par g de poids corporel) suivie d&#39;une dislocation cervicale au jour 4 ou 7 jours après le traitement IMQ. La peau est excisée et traitée (étapes 04.01 à 04.05). </li></ol> 6. homogénat peau de souris <ol><li> Utiliser une paire de ciseaux chirurgicaux pour faire une coupe horizontale à partir de la base de la queue. Procéder bilatérale à la base de la patte arrière et continuer à couper verticalement le long du flanc à la base de la patte antérieure. </li><li> Retirer délicatement la peau du tissu sous-jacent de postérieur à l&#39;antérieure. Utilisez les ciseaux pour couper la peau dorsale. Placez la peau sur une boîte de Pétri stérile. </li><li> Utilisez un scalpel pour exciser ciblela peau et les congeler dans de l&#39;azote liquide immédiatement. Remarque: la même taille de la peau sans acufected (1 cm x 1 cm) ou avec un traitement IMQ (2 cm x 2 cm) est fixé pour chaque souris pour minimiser les variations expérience-à-expérience. </li><li> Placez le tissu de la peau congelée au centre d&#39;une pré-refroidie de mortier à 2 compartiments avec des poignées et un pilon. Utilisez un marteau de plomb sur le mortier pour pulvériser le tissu. </li><li> placer rapidement le tissu pulvérisé dans un nouveau tube contenant 500 ul de réactif de lyse de cellules pour l&#39;extraction de l&#39;ARN ou à un tube contenant 50 ul de PBS 1x et cocktail d&#39;inhibiteurs de protease pour obtenir un lysat de protéine. </li></ol> 7. H &amp; E et Immunohistochimique de la Section de la peau <ol><li> Placez le tissu de la peau dans une cassette et la plonger dans 4% paraformaldéhyde du jour au lendemain. </li><li> Intégrer et section du tissu, ce qui dans notre cas a été réalisée par le laboratoire de pathologie à BAC, NTU. Remarque: La section est coupé à une épaisseur de 5 um. Placer le tissu sections sur des lames chargées positivement. </li><li> Chauffer les lames à 65 ° C pendant 15 min. </li><li> Placer les lames dans un rack de coloration. Immerger le support dans le réservoir correspondant contenant substitut du xylène pendant 5 minutes deux fois, suivie par immersion successive dans 100%, 95%, 80%, 75%, 60% et 50% d&#39;éthanol (5 min chacun) pour la réhydratation. Immergez les lames dans l&#39;eau du robinet pendant 3 min avant la coloration. </li><li> Effectuer hématoxyline et éosine. Remarque: H &amp; E tache a été réalisée sur demande au laboratoire de pathologie à BAC, NTU. </li><li> Pour colorant immunohistochimique, bloquer la section avec une solution de bloc à température ambiante pendant 5 min pour réduire la coloration de fond non spécifique. Remarque: La solution de bloc est développé dans le commerce avec des techniques d&#39;immunocoloration. Pas de sérum animal est contenue dans ce produit. </li><li> Plonger la lame dans du PBS pour rincer la solution de blocage. </li><li> Diluer la solution de bloc dans du PBS à 01:10 et ajouter 2% de sérum bovin fœtal (FBS) (solution de diluant). </li><li&gt; Pipette l&#39;anticorps primaire dilué de façon appropriée sur la section et incuber pendant 60 min à température ambiante. Remarque: Les anticorps sont dilués dans une solution de diluant. Les concentrations d&#39;anticorps de cette coloration ont été optimisées à 1: 800 et 1: 200 pour Ki67 (clone SolA15) et Ly6G (clone 1A8), respectivement. Ces concentrations se trouvent à montrer taches distinctes sans coloration de fond. <ol><li> Colorer une section en série dans le même essai avec la même solution en omettant l&#39;anticorps primaire pour contrôler la liaison non spécifique de l&#39;anticorps secondaire. </li></ol></li><li> Laver les lames trois fois dans du TBS plus 0,1% de Tween-20 (solution de TBST) pendant 5 minutes chacun. Changement solution entre les lavages. </li><li> Pipeter une goutte de polymères marqués à chaque section et incuber à température ambiante pendant 40 min. Remarque: le polymère marqué est préparé dans le commerce en combinant des polymères d&#39;acides aminés avec la peroxydase et un anticorps secondaire qui se réduit à un fragment Fab ». Le réactif est prêt à l&#39;emploila coloration immunohistochimique de coupes de tissus de souris. </li><li> Laver les lames trois fois dans TBST pendant 5 minutes chacun. Changement solution entre les lavages. </li><li> Pipette 3,3&#39;-diaminobenzindine solution tétrachlorhydrate (DAB) sur la section de tissu et laisser reposer à température ambiante jusqu&#39;à ce qu&#39;un précipité brun est visible sous un microscope en champ clair. Remarque: Le temps de DAB pour précipiter en présence de peroxydase est d&#39;environ 30 min. </li><li> Immerger les lames dans l&#39;eau pour arrêter l&#39;activité peroxydase. Tremper les lames en solution verte méthyle pour la coloration nucléaire. Laver les lames trois fois dans du PBS pendant 5 minutes à chaque fois. </li><li> Placer une lamelle couvre-objet sur la section colorée qui est recouverte d&#39;un milieu de montage permanent (8 pi par section). </li></ol> 8. Photographie et analyse des Stained Section des tissus <ol><li> Visualiser des coupes de tissus colorées H &amp; E et IHC sous un microscope à champ clair. appareil de capture d&#39;images à l&#39;aide de dispositifs à couplage de charge (CCD) fixé au microscope. pour qanalyse QUANTITATIVE, logiciel d&#39;imagerie peut être utilisé <ol><li> Numérisez l&#39;ensemble des sections colorées à l&#39;aide d&#39;un ScanScope avec un objectif 20X. </li><li> Mesurer l&#39;épaisseur de l&#39;épiderme dans un segment de 1 mm de l&#39;épiderme et de compter le nombre de cellules immunoréactives Ki67 dans le segment. NOTE: L&#39;analyse quantitative est réalisée grâce à l&#39;automatisation et le logiciel d&#39;analyse d&#39;images au microscope. épaisseur de l&#39;épiderme est définie par la distance entre la couche de base et la couche la plus externe de l&#39;épiderme. </li><li> Compter le nombre de cellules immunoréactives Ly6G dans la région du derme (230 x 270 um2 rectangle) immédiatement en dessous de la peau topique traité IMQ. </li></ol></li></ol>

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<li>Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+trafficking+of+DNA+in+keratinocytes%3A+evidence+for+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins.</a> Gene Ther. 11, 765-774 (2004).</li>
<li>Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+via+hair+follicles+by+topical+application+of+naked+DNA+to+normal+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin.</a> Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).</li>
<li>Kennedy-Crispin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes%27+response+to+injury+upregulates+CCL20+and+other+genes+linking+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity.</a> J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs ont aucun intérêt financier à divulguer.

L&#39;étape la plus critique pour assurer l&#39;expression de l&#39;ADN de plasmide est acufected à osciller de manière uniforme et desserrer la couche cornée de la peau. Tout en poussant les aiguilles doucement sans couper la peau, la force devrait être assez dur pour appuyer sur la surface. Afin de faciliter l&#39;absorption de l&#39;ADN dans une solution de 10 ul sur un 1 cm x surface de 1 cm, les aiguilles doivent osciller vers le haut et vers le bas pour environ 100 fois dans les 30 s. On peut déterminer la force q...

La peau est la première ligne de défense de l&#39;hôte. Kératinocvtes (KCS) sont le principal type de cellules dans la peau des humains et des souris. En réponse à des stimuli de l&#39; environnement (par exemple la lumière du soleil, de l&#39; oxygène, les produits chimiques et l&#39; invasion pathogène), KCs sont activés et produisent une grande variété de cytokines et de chimiokines pro - inflammatoires telles que l&#39; IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF - a α et GM-CSF 1. Ensemble, ils déclenchent le recrutement de cellules immunitaires de la peau. Aggravé l&#39; inflammation cutanée est souvent associée à de nombreuses maladies humaines , y compris la dermatite de contact extra - utérine aiguë et l&#39; inflammation T à médiation cellulaire chronique (par exemple la dermatite de contact allergique et le psoriasis) 2. La modulation des réponses pro-inflammatoires dans la peau en inhibant l&#39;activation KC est une approche plausible pour traiter l&#39;inflammation cutanée. Ce protocole décrit une nouvelle approche pour exprimer transitoirement un gène de cytokine dans l&#39;épiderme afin d&#39;étudier res immunitairesponse en conséquence un tel traitement de la peau. L&#39;épiderme compose la couche la plus superficielle de la peau. Il sert de barrière physique en gardant des substances externes, tels que des acides nucléiques et des agents pathogènes de pénétrer dans les couches profondes de la peau. Plusieurs techniques sans aiguille ont été établies pour le transfert d&#39;ADN de l&#39; épiderme 3, 4. ADN en solution ou associés à des liposomes cationiques ou des vecteurs d&#39;adénovirus a été directement appliqué sur l&#39;épiderme modifiés par des techniques telles que l&#39;élimination de la couche cornée ou le traitement avec un réactif d&#39;épilation. L&#39; élimination de l&#39;épithélium kératinisé facilite l&#39; ADN traversant la barrière épidermique et l&#39; interaction avec les kératinocytes et les cellules de Langerhans pour induire des réponses immunitaires 5. Alors qu&#39;une grande surface est disponible pour le transfert d&#39;ADN et cette approche ne comporte pas d&#39;aiguilles, il y a des inconvénients, y compris l&#39;exigencepour les grandes quantités d&#39;ADN (10 à 100 ug), le traitement dure sur la peau par décapage, et les résultats incohérents dans l&#39; induction d&#39;une réponse immunitaire chez les animaux immunisés sans assistance de délivrance d&#39;ADN 6. L&#39; administration intracellulaire à médiation microparticule d&#39;ADN nu à la peau a été montré très efficace et reproductible pour induire une réponse immunitaire 7, 8. Un canon à gènes tenu à la main a été utilisé pour bombarder le site cible de la peau avec le plasmide particules d&#39;or enrobées d&#39; ADN 2 um de diamètre en taille au moyen d&#39;écoulement d&#39;air de l&#39; hélium sous pression 9. L&#39;ADN plasmidique est probablement absorbé par les cellules dendritiques KCsand (CD) dans la peau et la protéine est exprimée localement ou transporté à ganglions lymphatiques drainants par les CD 10. Bien que le système de canon à gènes est simple et nécessite une expérience technique limitée, le coût pour la préparation et la livraison des &quot;ADN bullaisser &quot;( par exemple des poudres d&#39;or, gaz d&#39;hélium) et pour le canon de gène lui - même a limité son application générale. En outre, l&#39;exigence d&#39;un système de distribution de gaz d&#39;hélium limite la facilité du transport des armes à feu génétique lorsque les expériences sont menées à des endroits différents. Microseeding a été démontrée pour parvenir à une plus grande efficacité de transfert de gène à injection unique et un bombardement de particules 11. Microseeding utilise un pistolet de tatouage pour délivrer l&#39; ADN de la peau sans l&#39;utilisation de perles de particules 11. oscillante microaiguilles sur la peau en utilisant cette approche est susceptible de gratter directement la membrane cellulaire et ainsi transférer l&#39;ADN à plusieurs cellules en même temps. Cependant, la douleur associée au grand nombre d&#39;injections avec des aiguilles 0,254 mm de diamètre est un inconvénient. Nous fournissons ici une approche alternative à la livraison d&#39;ADN in vivo. Le « acufection » </strong&gt; protocole que nous avons décrit ici est un moyen économique et efficace pour fournir l&#39;ADN plasmidique dans la peau de la souris. En bref, dix aiguilles d&#39;acupuncture (0,2 mm de diamètre x 13 mm de longueur) ont été liés dans un faisceau par un ruban adhésif. Un volume de 10 ul de PBS avec 10 pg d&#39;ADN de plasmide contenant le transgène d&#39;intérêt a été placé sur la peau rasée, le flanc traité crème dépilatoire. En utilisant le faisceau d&#39;aiguilles d&#39;acupuncture pour faire osciller la surface (1 cm x 1 cm) de la peau, les kératines dans la couche cornée ont été desserrés et l&#39;ADN plasmidique appliquée à la surface a été absorbé dans l&#39;épiderme. Les lésions cutanées a été surveillée et jugée minime. L&#39;expression du gène transfecté dans la peau acufected a été confirmée à la fois par PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) et ELISA. Les effets modulateurs immunitaires de l&#39; IL-15ΔE7 rendu de acufection-cutanée sur l&#39; inflammation ont été démontrées en utilisant le modèle de souris traitées IMQ-12. Alors que acufection se révèle être une dema facile et moinsProcédé nding pour la délivrance d&#39;ADN in vivo, la quantité optimale d&#39;ADN de différents gènes et les temps de piquer la peau doivent être soigneusement optimisées pour obtenir des résultats reproductibles.

<table><tbody><tr><td>Accu Handy Needle</td><td>Accu</td><td>36Gx0.5</td><td>Dispositif médical</td></tr><tr><td>NairTM Lotion</td><td>Church & Dwight</td><td>N/A</td><td>Utilisation pour épiler</td></tr><tr><td>Shandon Xyline substitut</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6764506</td><td>Déparaffinisation</td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-Tribromethanol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4,840-2</td><td>Anesthésie</td></tr><tr><td>2-méthyl-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td><td>Solvant pour la dissolution de l’avertin</td></tr><tr><td>DifcoTM LB bouillon, Miller</td><td>BD</td><td>244620</td><td>Propagation et entretien de E. coli pour la biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Souris IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit</td><td>eBioscience</td><td>88-7215</td><td>Measure IL-15</td></tr><tr><td>protein Anti-mouse Ly6G</td><td>BioLegend</td><td>127601</td><td>Anticorps utilisé pour la coloration immunohistochimique</td></tr><tr><td>anti-souris Ki-67</td><td>eBioscience</td><td>14-5698-80</td><td>Anticorps utilisé pour coloration immunohistochimique</td></tr><tr><td>Souris à coloration simple MAXPO (Rat)</td><td>Nichirei Biosciences</td><td>414341F</td><td>Réactif pour bloquer le signal de fond dans une coloration souris sur souris</td></tr><tr><td>Kit de substrat de peroxydase DAB (HRP) Vector</td><td>Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>Substrat de peroxydse pour coloration immunohistochimique</td></tr><tr><td>Bloc Ultra V Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>TA-060-UB</td><td>Réduire la coloration de fond non spécifique</td></tr><tr><td>Vert de méthyle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8884</td><td>Coloration nucléaire</td></tr><tr><td>Vecta MountTM</td><td>Vector Laboratories</td><td>M-5000</td><td>Préservation permanente des colorants histochimiques</td></tr><tr><td>Inhibiteurs de protéase Cocktails de comprimés</td><td>Roche</td><td>04-693-116-001</td><td>Inhibition de l’activité de la protéase dans le lysat cellulaire</td></tr><tr><td>Crème Aldara</td><td>3M Parmaceuticals</td><td>N/A</td><td>5 % imiquimod</td> crème</tr><tr><td>Bessman Tissue Pulverizer</td><td>Spectrum Labs</td><td>189475</td><td>Utilisation pour pulvériser les tissus cutanés</td></tr><tr><td>ABI7900HT cycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td> Dosage <td>quantitatif par PCR en temps réel</td></tr><tr><td>Caméscope</td><td>Panasonic</td><td>HDC-SD60</td><td>Documentation d’image</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1</td><td>ZEISS</td><td>N/A</td><td>Microscopie à fond clair</td></tr></tbody></table>

développement d&#39;un adn système économique livraison par « acufection » et son application à la recherche de la peau

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Dysrégulation de la réponse immunitaire dans la peau est associée à de nombreux troubles de la peau humaine. transfert direct de gènes liées au système immunitaire dans les tissus de la peau est une approche fascinante pour étudier la modulation immunitaire de l&#39;inflammation cutanée dans les modèles de souris de maladies humaines. Nous présentons ici un protocole rentable qui a livré l&#39;ADN nu dans la peau de la souris et conduit à l&#39;expression du transgène. Le procédé est inventé « acufection », désignant l&#39; ADN trans fection acu à médiation par la perforation. Pour effectuer acufection, la peau de souris a été perfusée avec de l&#39;ADN dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et ensuite piquer légèrement avec un faisceau d&#39;aiguilles d&#39;acupuncture pour faciliter l&#39;absorption de l&#39;ADN et la transfection dans les cellules. L&#39;ADN plasmidique est sans doute repris par le kératinocyte et les cellules dendritiques (CD) dans la peau et exprimé en protéine. Piqûre mécanique avec les aiguilles en tant que tel n&#39;a pas causé de dommages à la peau ou induire l&#39; activation des kératinocytes. L&#39;expressiondes gènes transfectés a été détecté dans la peau à la fois des niveaux transcriptionnels et traductionnels suivants acufection pendant 2 jours et maintenus jusqu&#39;à 7 jours. L&#39;objectif principal pour le développement de cette méthode de acufection était d&#39;étudier une isoforme précédemment définie de l&#39;IL-15. En utilisant cette méthode, une IL-15 isoforme de l&#39;exon 7 (IL-15ΔE7) partiellement supprimé alternativement épissé a été exprimée dans la peau et ensuite traité avec un récepteur de type Toll 7 agoniste (TLR7), imiquimod (IMQ), pour induire une inflammation. IL-15ΔE7 livré Acufection en peau supprimé la prolifération des kératinocytes, l&#39;épaisseur de l&#39;épiderme et le recrutement de neutrophiles dans l&#39;inflammation cutanée induite par IMQ. Avec l&#39;intérêt croissant pour identifier les mécanismes de régulation de l&#39; inflammation cutanée, le protocole décrit ici fournit une alternative rentable et polyvalent pour le système de canon à gènes ou microseeding pour la délivrance d&#39;ADN in vivo. Il peut potentiellement permettre la découverte de la fonction d&#39;un romangène dans la peau ou pour enquêter sur un nouveau traitement pour les maladies cutanées.

Alors que quelques rougeurs était évidente dans la première heure après avec des aiguilles d&#39; une piqûre acupuncture, la peau éclaircit le jour 2 et aucune réaction cutanée indésirable jusqu&#39;au jour 7 a été observée après repiquage (figure 2A). Picotement de l&#39; aiguille induit très faible niveau de orthokératosiques épidermique et infiltration cutanée minimale par l&#39; analyse H &amp; E par rapport à la peau non traitée (fi...

Ce protocole est une alternative rentable pour exprimer l&#39;ADN plasmidique nu dans la peau de la souris. L&#39;objectif général du protocole est de délivrer des gènes liées au système immunitaire dans le tissu de la peau pour délimiter le rôle fonctionnel d&#39;un gène spécifique dans l&#39;inflammation cutanée.

Développement d&#39;un ADN Système économique Livraison par « Acufection » et son application à la recherche de la peau

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

L'objectif général de cette procédure est d'insérer des gènes liés au système immunitaire dans un tissu cutané afin de préciser le rôle fonctionnel d'un gène spécifique dans une inflammation cutanée. Cette méthode peut aider à découvrir la fonction d'un gène nouveau dans la peau, notamment pour le développement de nouvelles thérapies contre des maladies cutanées telles que le psoriasis.Le principal avantage de cette technique est qu'elle offre un moyen économique d'exprimer de l'ADN plasmidique dans la peau de la souris. Pour préparer l'ADN plasmidique, inoculer trois millilitres de milieu LB enrichi en antibiotique avec la colonie bactérienne préalablement transformée et sélectionnée. Incuber la culture toute la nuit à 37 degrés Celsius sous agitation.Après l'incubation nocturne, diluer la culture bactérienne dans 250 millilitres de milieu LB, supplémenté avec des antibiotiques, afin d'agrandir la culture. Incuber la culture toute la nuit à 37 degrés Celsius sous agitation. Utiliser un kit de préparation de plasmide de haute qualité, sans endotoxine, pour préparer une grande quantité d'ADN. Diluez l'ADN plasmidique obtenu dans du PBS stérile pour obtenir une concentration finale de un milligramme par millilitre. Après avoir anesthésié la souris, appliquez une pommade ophtalmologique vétérinaire sur ses yeux afin d'en prévenir le dessèchement. Ensuite, rasez la peau du dos de l'animal. Et appliquer une crème dépilatoire pour dissoudre les protéines kératineuses dans les tiges pileuses restantes. Après la dépilation, essuyer la crème avec un coton imbibé d'eau. À l'aide d'un coton stérile, imbibé d'éthanol à 70 %, désinfecter la surface de la peau et marquer la zone cutanée cible à l’aide du gabarit préparé précédemment. Appliquer 10 microlitres de la solution d’ADN contenant 10 microgrammes d’ADN plasmidique sur la zone cutanée souhaitée.Pour acufécter la souris, tenez l'appareil d'acupuncture perpendiculairement à la peau et piquez de façon répétée la surface désignée. Effectuez soit 100 piqûres en 30 secondes, soit jusqu'à ce que la solution appliquée sur la peau soit absorbée. Pour obtenir une expression réussie de l'ADN plasmidique dans le tissu cutané, il est important d'éviter de pénétrer profondément dans la peau et de s'assurer que la solution d'ADN est bien absorbée.Après avoir terminé la procédure, placer la souris acufectée sur un coussin chauffant afin de maintenir sa température corporelle jusqu’à son réveil de l’anesthésie. Lorsque la souris a retrouvé une conscience suffisante, la ramener à sa cage et lui fournir de l’eau et de la nourriture. Surveiller attentivement la souris pour détecter tout symptôme de gêne, notamment des changements comportementaux ou une apparence anormale, durant les 48 premières heures suivant la procédure.Marquer la peau du flanc recouvrant une zone de deux centimètres sur deux centimètres, préalablement traitée avec l'IL-15deltaE7. Ensuite, appliquer par voie topique de la crème d'Imiquimod sur la surface désignée à l’aide d’un applicateur en coton. Afin de surveiller les changements quotidiens de la peau dorsale traitée à l’Imiquimod, une personne effectue l’enregistrement tandis qu’une seconde maintient fermement la souris et expose la zone traitée à la vue de la caméra haute définition.Observer des modifications telles que des squames argentées, des plaques ou une érythème sur la peau traitée. Après avoir euthanasié la souris comme décrit, effectuer une incision horizontale à la base de la queue à l’aide d’une paire de ciseaux sérologiques et élargir la coupure bilatéralement vers la base de chaque membre postérieur. Puis procéder à des incisions verticales alignées avec les flancs et atteignant la base des quatre membres.Détacher soigneusement la peau du tissu sous-jacent en commençant par la queue vers la tête de l'animal. À l’aide de ciseaux, exciser la peau dorsale et transférer l’échantillon obtenu dans une boîte de Pétri stérile. À l’aide d’un scalpel, prélever un échantillon approprié de la peau cible.Ensuite, congeler immédiatement dans l'azote liquide. Pour pulvériser le tissu cutané, placer l'échantillon congelé au centre d'un broyeur de tissus à deux compartiments préalablement refroidi, muni de poignées et d'un pilon, et utiliser un marteau en plomb sur le mortier. Transférer immédiatement le tissu pulvérisé dans de nouveaux tubes contenant les réactifs appropriés pour toute analyse ultérieure.Commencer la procédure de coloration en chauffant les lames des sections cutanées fixées au formol et incluses dans la paraffine, préparées comme décrit dans le protocole écrit, à 65 degrés Celsius pendant 15 minutes. Plonger les lames deux fois dans le xylène pendant cinq minutes. Ensuite, réhydrater les lames à l’aide d’un gradient d’éthanol.Enfin, laver les lames à l’eau du robinet pendant trois minutes avant la coloration. Pour la coloration immunohistochimique, dessiner d’abord un cercle autour du tissu à l’aide d’un stylo imperméable, puis incuber la section avec la solution de blocage afin d’éviter une coloration de fond non spécifique. Après le blocage, laver la lame dans le PBS.Ensuite, pipeter l'anticorps primaire dilué sur la section et incuber pendant 60 minutes à température ambiante. Laver les lames trois fois dans du TBST pendant cinq minutes. Puis recouvrir la section d'une goutte de polymère marqué et incuber la lame à température ambiante pendant 40 minutes.Par la suite, laver la lame trois fois dans du TBST pendant cinq minutes, en changeant la solution entre chaque lavage. Puis ajouter 100 microlitres de solution DAB sur les sections tissulaires et laisser réagir à température ambiante, jusqu'à l'observation d'un produit brun au microscope.Ensuite, laver les lames à l'eau pour arrêter l'activité de la peroxydase. Contre-colorer la section dans une solution de vert méthyle, qui se lie spécifiquement à l'ADN pendant cinq secondes. Laver les lames trois fois dans du PBS pendant cinq minutes à chaque fois.Couvrir la section colorée avec huit microlitres de milieu de montage permanent et poser une lamelle. Enfin, acquérir les images des lames comme décrit dans le protocole écrit. On voit ici une souris témoin et une souris ayant subi une acufection pendant une heure, deux jours, cinq jours ou sept jours avant la prise de la photographie.Comme illustré ici, la procédure d'acufection n'a pas provoqué de dommages cutanés visibles. De plus, l'acufection n'a influencé ni l'épaisseur de la peau ni le nombre de cellules positives pour Ki67. Ce qui confirme davantage que la procédure n'entraîne ni perturbation tissulaire ni prolifération des cellules épidermiques.L'expression de CXCL-1 et de l'IL-6 mesurée par qRT-PCR. Confirme l'activation minimale des kératinocytes observée lors de l'acufection. En revanche, la qRT-PCR et le test ELISA ont démontré une expression marquée de l'IL-15 dans la peau de souris acufectées avec le gène IL-15.En fin de compte, la livraison médiée par acufection du gène IL-15deltaE7 vers les tissus cutanés empêche le développement d'une peau squameuse et l'infiltration de neutrophiles chez les souris traitées à l'imiquimod. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être réalisée en 12 minutes si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de préparer un nouveau faisceau d'aiguilles pour chaque acufection ainsi qu'un lot d'ADN plasmidique de haute qualité.Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes telles que l'infection virale peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la fonction d'un nouveau gène dans la modulation de la réponse immunitaire antivirale. Une fois développée, cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine de l'immunologie pour explorer la réponse immunitaire au niveau de la peau. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'induire l'expression d'ADN plasmidique dans la peau de la souris de façon économique.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

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Découvrez une méthode économique d'expression d'ADN plasmidique dans la peau de souris par acufection. Cette technique permet d'étudier le rôle fonctionnel des gènes immunitaires dans l'inflammation cutanée et de développer de nouvelles thérapies.

Développement d'un ADN Système économique Livraison par « Acufection » et son application à la recherche de la peau

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