Manipulation fonctionnelle du gène maternel Produits utilisant In vitro Ovocyte Maturation en Zebrafish

L’objectif global de ce protocole est d’effectuer la maturation in vitro des ovocytes de poisson zèbre et, si nécessaire, de manipuler fonctionnellement les produits géniques maternels, avant la fécondation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement, relatives à l’importance de la contribution maternelle à l’embryon. Le principal avantage de cette technique est la culture d’ovocytes in vitro, suivie d’une fécondation et d’une production d’embryons viables.

Et, si nécessaire, permet la manipulation fonctionnelle des produits géniques maternels qui agissent dans l’embryon précoce immédiatement après la fécondation. Pour commencer, huit à 10 jours avant la manipulation de la culture in vitro, utilisez une résille pour transférer plusieurs ensembles d’un seul poisson mâle et d’un seul poisson femelle de la souche souhaitée dans un bassin d’accouplement. Laissez-les dans le réservoir d’accouplement pendant la nuit.

Après avoir laissé les poissons s’accoupler tout au long de l’après-midi suivant, utilisez un filet de pêche pour séparer les femelles qui produisent des œufs pendant l’accouplement et placez-les dans un réservoir séparé. Nourrissez ces femelles deux fois par jour avec un mélange de nourriture contenant à peu près autant de crevettes de saumure et de flocons de nourriture pour poissons. Dans des conditions stériles, ajoutez 20 millilitres de L-15 Medium de Leibovitz avec de la l-glutamine, PH 7,0, dans un tube conique de 50 millilitres.

Ensuite, utilisez 10 hydroxyde de sodium normal pour l’amener à PH 9,0. Ajoutez 9 millilitres du L-15 Medium à deux tubes coniques séparés de 50 millilitres. Ensuite, étiquetez un tube DHP et l’autre DHP.

Dans le tube DHP, ajoutez 10 microlitres de DHP, 490 microlitres de DH2O et 500 microlitres de 10 %BSA. Dans le tube DHP, ajoutez 100 microlitres de gentamicine de 10 milligrammes par millilitre, 400 microlitres de DH2O et 500 microlitres de 10 % BSA. Pour effectuer la dissection des ovocytes, commencez par préparer une solution mère de tricaïne à 0,2 % dans DH2O, tamponnée à PH 7,0 avec une molaire tris PH 9,0.

Maintenez cette solution à 4 degrés Celsius. De 0 à quatre heures avant la fin du cycle d’éclairage quotidien dans l’installation, dans un bécher de 250 millilitres, ajoutez 20 millilitres de solution mère de tricaïne à 0,2 %, PH 7,0, à 80 millilitres d’eau de poisson et mélangez. Il est essentiel de commencer la procédure dans les quatre heures suivant la fin du cycle de lumière auquel les poissons sont habitués.

Sinon, les ovocytes ne mûriront pas correctement. À l’aide d’une cuillère, récupérez le poisson euthanasié de la solution de tricaïne et rincez-le brièvement à l’eau du poisson. Ensuite, placez le poisson sur une serviette en papier pour absorber l’excès d’eau.

À l’aide d’une lame de rasoir propre, décapitez le poisson euthanasié au niveau de la nageoire pectorale. Ensuite, à l’aide de ciseaux de dissection, faites une incision longitudinale sur la face ventrale du poisson, s’étendant de l’extrémité antérieure à la région anale. Placez le poisson sur une boîte de Pétri sous un microscope de dissection avec une lumière incidente.

Ensuite, à l’aide d’une paire de pinces à dissection, isolez les parties de l’ovaire et transférez le tissu dans une boîte de culture de 35 x 10 millimètres, contenant quatre millilitres de L-15 Meidum de Leibovitz, DHP. Maintenant, à l’aide d’une pince à dissection, dissociez doucement les ovocytes de la masse folliculaire. Triez les quatre ovocytes au stade précoce, qui ont une taille presque maximale et se caractérisent par un cytoplasme opaque foncé et une vésicule germinale facilement apparente, ou GV, située de manière asymétrique dans l’ovocyte.

Jetez les ovocytes aux stades précoces et les ovules translucides de stade 5 matures. À l’aide d’une pipette de pâturage en verre, transférez les quatre ovocytes au stade précoce dans une deuxième boîte de culture en plastique de 35 x 10 millimètres, contenant quatre millilitres de milieu L-15 de Leibovitz, plus du DHP. Transférez des quantités minimales de milieu moins DHP dans le plat, contenant la solution plus DHP.

Si vous injectez de l’ARNm, immédiatement avant l’injection, utilisez de l’eau d’osmose inverse de qualité ARN et du chlorure de potassium à 0,2 molaire pour diluer l’ARNm en une solution finale de chlorure de potassium à 0,1 molaire. Si vous injectez des Morpholinos, ou MO, immédiatement avant l’injection, diluez les MO à la concentration souhaitée avec de l’eau d’osmose inverse de qualité ARN et du chlorure de potassium à 0,2 molaire, pour obtenir une concentration finale de chlorure de potassium à 0,1 molaire. Ensuite, pour effectuer l’injection, tenez manuellement les ovocytes à l’aide d’une pince fine et, à l’aide d’une aiguille fabriquée avec une pipette capillaire en verre tiré, injectez environ un nanolitre dans des ovocytes de stade quatre de type sauvage.

Continuez à incuber les ovocytes immatures et injectés dans un milieu DHP à 26,5 degrés Celsius. Vérification toutes les 30 minutes environ pour s’assurer que les ovocytes restent intacts et qu’ils connaissent une bonne maturation, en devenant progressivement translucides. Utilisez une pipette de pâturage pour prélever les ovocytes en lyse.

Et jetez-les dans un bécher à déchets de laboratoire, pour maintenir la qualité du milieu. Avec environ la moitié du volume de milieu DHP frais, remplacez le milieu de culture pour maintenir une solution claire, en fonction de la quantité de lyse des ovocytes. Lorsque la majorité des ovocytes sont devenus translucides et ont une GV qui n’est plus apparente, utilisez des pinces extra-fines pour faire une déchirure dans la membrane folliculaire, dans une région où l’espace entre l’ovocyte et la membrane est accru.

Retirez une partie de la membrane et, tout en maintenant la partie pelée, roulez l’ovocyte hors de la membrane. Une autre étape critique est l’ablation de la membrane folliculaire. Si cette couche n’est pas complètement éliminée, la fécondation et l’expansion du chorion seront entravées.

Transférez les ovocytes défolliculés dans un volume minimal de milieu, dans une boîte de Pétri avec quelques gouttes de milieu de culture DHP, et procédez à la fécondation. Vers la fin de l’étape de maturation de l’ovocyte, et avant la défolliculation, préparez une solution de spermatozoïdes en utilisant les testicules de cinq mâles dans 500 microlitres de Hank’s Solution. Ajouter 10 à 50 microlitres de solution de sperme aux ovocytes défolliculés dans le milieu de culture DHP.

Ensuite, attendez 10 secondes. À l’aide d’une pipette, ajoutez quelques gouttes de milieu E3 dans les ovocytes. Attendez une minute, puis utilisez le milieu E3 pour inonder la plaque.

Après avoir laissé les embryons fécondés se développer, utilisez un microscope de dissection avec optique en lumière transmise pour observer la progression à travers les étapes de clivage afin d’assurer une fécondation réussie, comme décrit précédemment pour la fécondation et la stadification. Comme le montre l’expression de la GFP, les ovocytes issus de la culture in vitro sont capables de produire des protéines à partir d’ARNm exogène tout au long du développement de l’ovocyte en aussi peu que deux heures. Cependant, seuls les ovocytes qui initient les conditions de culture au stade quatre de l’ovogenèse peuvent se développer en ovocytes matures au stade cinq.

Dans cette expérience, l’ARNm Aurora B de type sauvage injecté sauve les effets phénotypiques d’une mutation dans son gène correspondant, l’îlot cellulaire. Les embryons d’un groupe témoin sont également autorisés à se développer pour montrer le phénotype mutant correspondant. L’injection d’un Morpholino bloquant la traduction permet de phénocopier avec succès le phénotype mutant connu, comme le montre l’injection de lrmp-MO dans les ovocytes, qui imite le phénotype mutant du cycle futile de mutation correspondant.

Le codage de l’ARNm peut également être injecté dans des ovocytes de type sauvage ou mutants pour visualiser les produits correspondants au sein de l’embryon précoce. Par exemple, comme on le voit ici, la protéine Sass6-mCherry se localise sur des foyers marqués par le marqueur centrosome Gamma tubuline. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 5 à 6 heures environ, si elle est correctement exécutée.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de ne pas précipiter la procédure et de permettre une bonne maturation des ovocytes avant la défolliculation et la fécondation. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la fixation des embryons peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires. Comme le sauvetage de votre gène d’intérêt, ou la localisation d’ARN ou de protéine.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la genèse embryonnaire précoce pour explorer la contribution des produits géniques maternels chez le poisson zèbre. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de manipuler fonctionnellement les produits géniques maternels via la maturation in vitro d’ovocytes de poisson zèbre.