Unicellulaire profil d'expression génique utilisant FACS et qPCR avec les normes internes

L’objectif global de cette procédure est de quantifier les niveaux d’ARNm dans des cellules individuelles à l’aide de la qPCR microfluidique avec des étalons internes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie unicellulaire, par exemple si les populations cellulaires de cellules réagissent à un stimulus de différentes manières. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut mesurer l’expression de plus de gènes que l’ARN FISH à un coût inférieur à celui de l’ARN-Seq dans des cellules uniques.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous explorions des protocoles permettant de mesurer l’expression génique dans des cellules uniques par qPCR microfluidique. Nous voulions modifier les méthodes existantes pour estimer plus précisément le nombre absolu de transcrits différents dans des cellules uniques. William Telford, le directeur de l’installation de cytométrie en flux utilisée par mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure de tri cellulaire.

Après avoir généré et purifié des amplicons à partir de gènes d’intérêt selon le protocole de texte, combinez 18 microlitres de chaque amplicon purifié dans un tube de microcentrifugation à faible liaison de 2,0 millilitres, puis ajoutez un tampon de suspension d’ADN jusqu’à 1 800 microlitres de sorte que la concentration de chaque amplicon soit de cinq fois 10 à la sixième molécule par microlitre. Manipulez soigneusement la norme 5e6 et divisez-la en aliquotes de 20 microlitres dans des tubes PCR à faible liaison. Après avoir plaqué les cellules MCF7 p53-Venus selon le protocole de texte, ajoutez 400 nanogrammes par millilitre de néocarzinostatine aux cellules et traitez-les pendant trois, 8,5, 14 ou 24 heures.

Pour fabriquer un tampon de lyse, combinez les réactifs répertoriés dans ce tableau. Transférez 92,4 microlitres de tampon dans un tube séparé pour servir de tampon de lyse pour les étalons d’amplicon. Le tampon de lyse restant sera pour les cellules.

Préparez et ajoutez de l’ADN d’E. coli au tampon de lyse pour les cellules, conformément au protocole de texte. Pour préparer des normes, étiquetez six tubes à centrifuger à faible liaison. Ajoutez 90 microlitres de tampon de suspension d’ADN dans le tube 5e5.

Ajoutez 90 microlitres de tampon contenant 6,2 picogrammes par microlitre d’ADN E.coli dans chacun des cinq autres tubes et gardez tous les tubes sur de la glace. Après avoir retiré une aliquote de l’étalon 5e6 du stockage, agitez brièvement le tube, puis faites-le tourner pour vous assurer que le liquide se trouve au fond du tube, puis à l’aide d’une pointe de pipette à faible liaison, ajoutez 10 microlitres de l’étalon 5e6 dans le tube 5e5. Vortex, tournez et remettez le tube sur la glace.

Ensuite, pipetez 10 microlitres du tube 5e5 dans le tube 5e4, puis faites brièvement tourner le tube, faites-le tourner et remettez le tube sur de la glace. Répétez les dilutions en série avec chaque tube, en recevant 10 microlitres du tube précédent jusqu’à ce que tous les tubes aient une dilution de standard. Après avoir préparé des tubes PCR avec tampon de lyse, à l’aide d’une pipette à 12 canaux, distribuez neuf microlitres de tampon de lyse cellulaire de la rangée de tubes PCR dans chaque puits des sept premières rangées d’une plaque PCR.

Répartissez sept microlitres de tampon de lyse standard dans chaque puits de la dernière rangée de la plaque, puis à l’aide d’embouts de pipette à faible liaison, ajoutez deux microlitres de standard dans chaque puits de la rangée inférieure selon la carte de la plaque. Ajoutez deux microlitres de 3,1 picogrammes par microlitre d’ADN d’E.coli dans les puits de 10 cellules et de 100 cellules, puis ajoutez deux microlitres de 6,2 picogrammes par microlitre d’ADN d’E. coli dans les puits sans cellule. Après avoir programmé le trieur de cellules activées par fluorescence pour trier dans une plaque de 96 puits selon la carte de plaque, visez la machine, scellez une plaque PCR vide et utilisez le flux de test pour trier les gouttelettes et le PBS sur le joint de la plaque vide.

Si les gouttelettes n’atterrissent pas dans la bonne position, essuyez-les de la surface du sceau, recalibrez le trieur de cellules selon les instructions du fabricant de la machine et répétez l’opération jusqu’à ce que les gouttelettes dans le flux de tri soient correctement déposées. Récoltez les cellules par trypsinisation et mettez-les en suspension dans 0,5 millilitre de PBS avec 2 % FBS, puis transférez-les dans un tube de cytométrie en flux. Pour trier les cellules, insérez le tube avec la suspension cellulaire dans le trieur de cellules, ouvrez le joint sur la plaque de tampon de lyse et triez soigneusement les cellules d’intérêt dans la plaque selon la carte de plaque.

Pour vous assurer que les cellules individuelles sont triées avec une pureté maximale, faites fonctionner la machine en mode cellule unique et utilisez la cytométrie en flux standard basée sur la diffusion vers l’avant et sur les côtés. Après l’exécution, utilisez un nouveau joint thermique stérile pour sceller la plaque et centrifugez-la à 400 fois g pour quatre degrés Celsius pendant une minute, puis placez la plaque dans le thermocycleur et exécutez le programme RT-STA précédemment préparé. Après avoir fait tourner la plaque RT-STA terminée, utilisez une pipette à 12 canaux pour distribuer 3,6 microlitres d’exonucléase I diluée dans chaque puits de la plaque.

Scellez et faites tourner brièvement la plaque, puis placez la plaque dans le thermocycleur et exécutez le programme exo I. Pour mesurer l’expression des gènes d’entretien ménager dans chaque échantillon, préparez 900 microlitres de colorant de liaison à l’ADN qPCR pour 96 réactions à l’aide d’amorces de l’un des gènes d’entretien sélectionnés. Répartissez neuf microlitres de mélange maître dans chaque puits d’une plaque PCR de 96 puits, puis ajoutez un microlitre d’échantillon de la plaque d’échantillon au puits correspondant de la plaque PCR.

Exécutez la plaque sur une machine PCR en temps réel à l’aide d’un protocole de cyclage thermique suggéré par le fabricant du mélange maître ou en suivant un protocole standard, puis analysez les échantillons et créez une carte de plaque des mélanges d’échantillons selon le protocole texte. Étiquetez un mélange d’échantillons sur plaque, puis, à l’aide d’une pipette à huit canaux, distribuez 3,3 microlitres d’échantillon de mélange maître en chargeant le mélange de réactif dans chaque puits d’une plaque PCR à 96 puits. Pour chaque plaque de PCR d’échantillons, agitez la plaque pendant 10 secondes et faites-la tourner à 500 fois g pendant 10 secondes.

Retirez le couvercle et transférez 2,7 microlitres de chaque échantillon positif à une cellule dans le puits correspondant sur la plaque de mélange d’échantillons pour les puits à une cellule indiqués sur la carte de la plaque. Décollez l’autocollant du bas d’une nouvelle puce microfluidique qPCR, puis à l’aide d’une seringue de liquide de ligne de contrôle avec le capuchon toujours en place, poussez vers le bas chaque ressort d’accumulateur pour le desserrer et injectez chaque accumulateur avec 100 à 200 microlitres de liquide de ligne de contrôle. Insérez la puce dans la machine de chargement et exécutez le script principal, puis à l’aide d’une pipette à huit canaux, transférez 4,5 microlitres de chaque mélange de test dans le côté gauche de la puce microfluidique qPCR.

Il est essentiel d’éviter de créer des bulles d’air au fond des puits. Cela créera des problèmes de chargement. Pour éviter cela, touchez les pointes de la pipette sur le côté du puits, puis pipetez uniquement jusqu’à la première butée.

Transférez 4,5 microlitres de chaque mélange d’échantillons sur le côté droit de la puce qPCR microfluidique, puis insérez la puce dans la machine de chargement et exécutez le script de mélange de chargement. Lorsque le script de mélange de charge est terminé, vérifiez qu’il n’y a pas de lignes sur la puce, ce qui indiquerait un problème de chargement, puis utilisez du ruban adhésif pour retirer soigneusement toutes les particules de poussière de la puce, puis insérez la puce dans la machine PCR microfluidique en temps réel et exécutez le script de collecte de données. Enfin, analysez les données selon le protocole texte.

Cette figure montre les niveaux d’expression d’un gène d’entretien mesurés par qPCR pour déterminer quels puits ont reçu une seule cellule. Les échantillons qui ont reçu une cellule ont de faibles valeurs CT. Les échantillons sans cellule ont des valeurs CT beaucoup plus élevées.

Les puits de l’étalon d’amplicon doivent présenter des courbes d’amplification régulièrement espacées. Il devrait également y avoir une séparation claire dans les courbes pour les puits sans cellule, à 10 cellules et à 100 cellules. Des échantillons d’ADN de graine représentant des cellules réelles sont choisis sur plusieurs plaques de 96 puits triées et combinés dans une seule plaque pour se préparer à la qPCR microfluidique.

Cette carte thermique résume les résultats de la qPCR microfluidique. La variation de couleur dans chaque colonne montre la variabilité de l’expression de chaque gène entre différentes cellules. Les deux rangées qui sont beaucoup plus foncées que les autres représentent très probablement de mauvais échantillons.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de garder votre zone de travail exempte de RNase et d’ADN, en particulier lors de la fabrication des étalons et du tampon de lyse. Les parties pré-PCR de ce protocole sont sensibles à la contamination. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de quantifier l’expression de plusieurs gènes d’intérêt dans des cellules individuelles.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes, comme l’ARN à molécule unique FISH, peuvent être effectuées pour valider les mesures de l’abondance de l’ARNm dans les cellules uniques.