Name: Unicellulaire profil dexpression génique utilisant FACS et qPCR avec les normes internes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Apprenez à quantifier l'expression génique dans des cellules uniques par qPCR microfluidique avec standards internes. Cette méthode permet de mesurer jusqu'à 96 gènes simultanément à moindre coût que le RNA-Seq.

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Nous tenons à remercier V. Kapoor dans le CCR ETIB cytométrie de flux de base pour son aide dans l&#39;exécution du tri cellulaire au cours du développement de ce protocole. Nous remercions également M. l&#39;Unité CCR LP Molecular Diagnostics Raffeld et et J. Zhu et le NHLBI séquençage de l&#39;ADN et la génomique de base pour leur aide dans l&#39;exécution de la qPCR lors de l&#39;élaboration de ce protocole. Cette recherche a été soutenue par le programme intra-muros des NIH.

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<li>Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+burst+frequency+and+burst+size+are+equally+modulated+across+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (43), 17454-17459 (2012).</li>
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<li>Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Pulses+Diversify+Target+Gene+Expression+Dynamics+in+an+mRNA+Half-Life-Dependent+Manner+and+Delineate+Co-regulated+Target+Gene+Subnetworks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks.</a> Cell Syst. 2 (4), 272-282 (2016).</li>
<li>Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+p53-Mdm2+feedback+loop+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells.</a> Nat. Genet. 36 (2), 147-150 (2004).</li>
<li>Levine, A. J., Oren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+30+years+of+p53%3A+growing+ever+more+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The first 30 years of p53: growing ever more complex.</a> Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 749-758 (2009).</li>
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<li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinf. 13 (1), 134(2012).</li>
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<li>Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+initiation%3A+a+mechanism+for+triggering+p53+pulses+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage.</a> Mol. Cell. 30 (3), 277-289 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Flow+Cytometry%3A+Principles+and+Applications%22">Flow Cytometry: Principles and Applications</a>. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Real-time+PCR%22">Real-time PCR</a>. , Taylor & Francis. (2006).</li>
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<li>Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARACNE%3A+An+Algorithm+for+the+Reconstruction+of+Gene+Regulatory+Networks+in+a+Mammalian+Cellular+Context%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context.</a> BMC Bioinf. 7 (Suppl 1), (2006).</li>
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<li>Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Single-cell+Gene+Transcription+by+RNA+Fluorescent++In+Situ+Hybridization+%28FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH).</a> J. Vis. Exp. (68), e4073(2012).</li>
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<li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nat. Methods. 9 (7), 743-748 (2012).</li>
<li>Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+transcriptomics+in+thousands+of+single+human+cells+at+single-molecule+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution.</a> Nat. Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons présenté un procédé pour isoler des cellules de mammifères individuels à partir d&#39;une population de cellules adhérentes cultivées en culture et pour le dosage de l&#39;expression d&#39;environ 96 gènes dans chaque cellule. Une bonne préparation préalable est essentielle pour que cette méthode fonctionne bien. En particulier, la conception et les tests paires d&#39;amorces spécifiques pour les transcriptions d&#39;intérêt (étapes 1,2-1,3) prennent du temps, mais d&#39;importantes étapes, comme les amorces ...

Les cellules individuelles dans une population peuvent montrer des réponses très différentes à un stimulus uniforme physiologique 1, 2, 3, 4. La variation génétique des cellules dans une population est un mécanisme pour cette série de réactions, mais il existe également plusieurs facteurs non génétiques qui peuvent augmenter la variabilité des réponses, même dans une population clonale de cellules. Par exemple, les niveaux de différentes protéines et d&#39;autres molécules de signalisation importantes peuvent varier sur une base cellule par cellule, donnant lieu à des variations dans les profils d&#39;expression des gènes en aval. En outre, l&#39; activation du gène peut se produire dans des éclats de courte durée des relevés de notes 5, 6 qui peuvent être limités à un nombre relativement faible de transcrits par rafale 7, 8, 9. Telstochasticité dans l&#39; activation de gène peut grandement contribuer à la variabilité des réponses biologiques et peut fournir un avantage sélectif sur les micro - organismes 10 dans des cellules mammifères et 1, 2 répondant à un stimulus physiologique. En raison de ces deux sources génétiques et non génétiques de la variation, le profil d&#39;expression génique d&#39;une cellule donnée en réponse à un stimulus peut être très différente du profil d&#39;expression génique moyenne obtenue à partir de la mesure de la réponse en vrac. Déterminer la mesure dans laquelle les cellules individuelles présentent une grande variabilité dans la réponse à un stimulus nécessite des techniques pour l&#39;isolement de cellules individuelles, la mesure des niveaux d&#39;expression des transcrits d&#39;intérêt, et l&#39;analyse informatique des données d&#39;expression en résultant. Il existe plusieurs approches pour le dosage de l&#39;expression des gènes dans des cellules individuelles, couvrant un large éventail de coûts, nombre de transcrits sondé, etprécision de quantification. Par exemple, une seule cellule ARN-Seq offre une grande profondeur de la couverture de la transcription et de la capacité à quantifier des milliers de transcriptions distinctes pour les gènes les plus fortement exprimé dans des cellules individuelles; Cependant, le coût associé à une telle profondeur de séquençage peut être prohibitif, même si les coûts continuent de diminuer. A l&#39; inverse, une seule molécule d&#39; ARN hybridation fluorescente in situ (smRNA FISH) propose une quantification précise des transcriptions pour encore faible expression de gènes à un coût raisonnable par gène d&#39;intérêt; Cependant, seul un petit nombre de gènes cibles peut être testée dans une cellule donnée par cette approche. tests basés sur la PCR quantitative, décrits dans le présent protocole, fournissent un juste milieu entre ces techniques. Ces tests utilisent une machine microfluidique PCR en temps réel pour quantifier jusqu&#39;à 96 transcriptions d&#39;intérêt à un moment dans un maximum de 96 cellules. Bien que chacune des méthodes mentionnées ci-dessus a des coûts matériels nécessaires, le coût de tout essai qPCR individuelle est relativementfaible. Ce protocole est adapté de celui suggéré par le fabricant d&#39;une machine microfluidique PCR en temps réel (Protocole ADP 41, Fluidigm). Pour permettre l&#39;estimation du nombre absolu de chaque transcription dans une approche basée sur la PCR, nous avons élargi le protocole à utiliser des contrôles internes de préparées amplicons de gènes cibles qui peuvent être utilisés dans de multiples expériences. A titre d&#39;exemple de cette technique, la quantification de l&#39;expression des gènes régulés par le suppresseur de tumeur p53 dans les cellules MCF-7 de carcinome du sein humain 11 est décrit. Les cellules sont contestées avec un agent chimique qui induit ADN cassures double brin. Des études antérieures ont montré que la réponse de p53 à l&#39; ADN cassures double brin présente une grande hétérogénéité dans des cellules individuelles, tant en termes de niveaux de p53 12 et dans l&#39;activation de gènes cibles distinctes 11. En outre, p53 régule l&#39;expression de plus de 100bien caractérisé des gènes cibles impliqués dans de nombreuses voies en aval, y compris l&#39; arrêt du cycle cellulaire, l&#39; apoptose et la sénescence 13, 14. Puisque la réponse médiée par p53 dans chaque cellule est à la fois complexe et variable, l&#39;analyse des avantages du système à partir d&#39;une approche dans laquelle près de 100 gènes cibles peut être sondé simultanément dans des cellules individuelles, telles que celles décrites ci-dessous. Avec de légères modifications (telles que les méthodes alternatives pour l&#39;isolement de cellules isolées et une lyse), le protocole peut être facilement adapté pour étudier un large éventail de types de cellules de mammifère, des transcriptions et des réponses cellulaires. Avec une préparation préalable appropriée, une ronde de tri cellulaire et la mesure de l&#39;expression du gène peut être réalisée selon ce protocole sur une période de trois jours. Le calendrier suivant est proposé: à l&#39;avance, sélectionner les transcriptions d&#39;intérêt, d&#39;identifier et de valider les paires d&#39;amorces qui amplifient l&#39;ADNc de ceux transcrIPTS, et de préparer les normes et mélanges d&#39;amorces en utilisant ces amorces. Le jour 1, après un traitement cellulaire, la récolte et de trier les cellules, effectuer la transcription inverse et l&#39;amplification de cible spécifique, et de traiter les échantillons avec une exonucléase pour éliminer les amorces non constituées en société. Le jour 2, effectuer un contrôle de qualité sur les cellules triées en utilisant qPCR. Enfin, le jour 3, mesurer l&#39;expression des gènes dans les cellules triées en utilisant microfluidique qPCR. La figure 1 résume les différentes étapes.

<table><tbody><tr><td>Mini kit RNeasy Plus</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcription inverse de l’ADNc haute capacité avec inhibiteur de RNase</td><td>ThermoFisher</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>Phusion ADN polymérase haute fidélité</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT Kit de dosage d’ADNdb haute sensibilité</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33120&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml tubes de microcentrifugation à faible adhérence</td><td>USA Scientific</td><td>1420-2600</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de suspension d’ADN</td><td>Teknova</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 0,2 ml Maxymum Recovery Tubes PCR à paroi mince Corning</td><td></td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Échantillon & Kit de réactifs de chargement de dosage</td><td>Fluidigm</td><td>100-3415</td><td></td></tr><tr><td>HyClone RPMI 1640 média</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal, certifié (US)</td><td>ThermoFisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Solution antibiotique-antimycosique</td><td>Corning</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>Néocarzinostatine</td><td>Sigma</td><td>N9162</td><td></td></tr><tr><td>ELIMINase</td><td>Decon Labs</td><td>1101</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-In</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>11753500</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DNA</td><td>Affymetrix</td><td>14380 10 MG</td><td></td></tr><tr><td>ThermalSeal Film d’étanchéité, stérile</td><td>Excel Scientific</td><td>STR-THER-PLT</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria IIu</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyClone Trypsin 0,05 %</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30236,01</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &micro ; m Cell Strainer</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Exonucléase I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix à faible ROX</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5210</td><td></td></tr><tr><td>96.96 Dynamic Array IFC pour l’expression génique (puce microfluidique qPCR)</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur IFC HX (machine de chargement)</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioMark ou BioMark HD (machine qPCR microfluidique)</td><td>Logiciel d’analyse</td> PCR en temps réel Fluidigm<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Logiciel Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

unicellulaire profil d&#39;expression génique utilisant facs et qpcr avec les normes internes

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Les mesures d’expression génique à partir de populations massives de cellules peuvent masquer la variation transcriptomique considérable des cellules individuelles au sein de ces populations. Les mesures de l’expression génique d’une seule cellule peuvent aider à évaluer le rôle du bruit dans l’expression des gènes, à identifier les corrélations dans l’expression de paires de gènes et à révéler des sous-populations de cellules qui répondent différemment à un stimulus. Ici, nous décrivons une procédure permettant de mesurer l’expression de jusqu’à 96 gènes dans des cellules de mammifères isolés d’une population croissante en culture tissulaire. Les cellules sont triées dans un tampon de lyse par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), et les espèces d’ARNm d’intérêt sont transcrites et amplifiées en sens inverse. L’expression des gènes est ensuite mesurée à l’aide d’une machine de PCR microfluidique en temps réel, qui effectue jusqu’à 96 tests qPCR sur un maximum de 96 échantillons à la fois. Nous décrivons également la génération et l’utilisation d’étalons d’amplicon PCR pour permettre l’estimation du nombre absolu de chaque transcrit. Comparée à d’autres méthodes de mesure de l’expression génique dans des cellules uniques, cette approche permet de quantifier des transcrits plus distincts que l’ARN FISH à un coût inférieur à celui de l’ARN-Seq.

Un aperçu général du protocole est représentée sur la figure 1, comprenant des étapes pour le traitement des cellules, l&#39;isolement des cellules isolées par FACS, la génération et la pré-amplification des banques d&#39;ADNc à partir de lysats de cellule unique, la confirmation des banques d&#39;ADNc monocellulaires dans les puits triées et la mesure de l&#39;expression des gènes par PCR quantitative. En pré...

Nous décrivons une méthode pour trier des cellules de mammifères uniques et quantifier l’expression d’un maximum de 96 gènes cibles d’intérêt dans chaque cellule. Cette méthode comprend l’utilisation de normes qPCR internes pour permettre l’estimation du nombre absolu de transcrits.

Unicellulaire profil d&#39;expression génique utilisant FACS et qPCR avec les normes internes

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

L'objectif général de cette procédure est de quantifier les niveaux d'ARNm dans des cellules individuelles à l'aide de la qPCR en microfluidique avec des étalons internes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie unicellulaire, telles que savoir si des populations cellulaires réagissent à un stimulus de manière caractéristiquement différente. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de mesurer l'expression d'un plus grand nombre de gènes que l'hybridation in situ par ARN (RNA FISH), et ce à un coût inférieur à celui du RNA-Seq dans des cellules uniques.L'idée de cette méthode nous est d'abord venue lorsque nous explorions des protocoles permettant de mesurer l'expression génique dans des cellules uniques par qPCR microfluidique. Nous souhaitions modifier les méthodes existantes afin d'estimer plus précisément le nombre absolu de transcrits différents dans des cellules individuelles. William Telford, responsable de la plateforme de cytométrie en flux utilisée par mon laboratoire, démontrera la procédure de tri cellulaire.Après avoir généré et purifié des amplicons à partir des gènes d'intérêt selon le protocole décrit

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En vrac gene expression mesures nuage cellule individuelle différences dans les populations de cellules hétérogènes. Nous décrivons ici un protocole pour analyse de l’expression génique et l’index Comment unicellulaires Tri par Florescence activé cellule Tri (FACS) peut être combiné pour délimiter l’hétérogénéité et immunophenotypically caractériser les populations cellulaires moléculairement distinctes.

Une approche combinatoire de cellule unique pour caractériser la moléculaire et immunophénotypiques hétérogénéité des souches humaines et des Populations de l’ancêtre

Cette méthode décrit les étapes pour améliorer la qualité et la quantité de données de séquence qui peuvent être obtenues à partir d’échantillons d’ARN formalin-fixes paraffin-embedded (FFPE). Nous décrivons la méthodologie pour évaluer plus précisément la qualité des échantillons FFPE-ARN, préparer des bibliothèques de séquençage et analyser les données des échantillons FFPE-ARN.

Optimisation du séquençage et de l’analyse des échantillons d’ARN FFPE dégradés

L’hybridation in situ par fluorescence d’ARN à molécule unique (smFISH) est une méthode permettant de quantifier avec précision les niveaux et la localisation d’ARN spécifiques au niveau de la cellule unique. Ici, nous rapportons nos protocoles de laboratoire validés pour le traitement au banc humide, l’imagerie et l’analyse d’images pour la quantification unicellulaire d’ARN spécifiques.

Analyse unicellulaire d’allèles transcriptionnellement actifs par molécule unique FISH

Apprenez à quantifier l'expression génique dans des cellules uniques par qPCR microfluidique avec standards internes. Cette méthode permet de mesurer jusqu'à 96 gènes simultanément à moindre coût que le RNA-Seq.

Unicellulaire profil d'expression génique utilisant FACS et qPCR avec les normes internes

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