Name: Unicellulaire profil dexpression génique utilisant FACS et qPCR avec les normes internes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Apprenez à quantifier l'expression génique dans des cellules uniques par qPCR microfluidique avec standards internes. Cette méthode permet de mesurer jusqu'à 96 gènes simultanément à moindre coût que le RNA-Seq.

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Nous tenons à remercier V. Kapoor dans le CCR ETIB cytométrie de flux de base pour son aide dans l&#39;exécution du tri cellulaire au cours du développement de ce protocole. Nous remercions également M. l&#39;Unité CCR LP Molecular Diagnostics Raffeld et et J. Zhu et le NHLBI séquençage de l&#39;ADN et la génomique de base pour leur aide dans l&#39;exécution de la qPCR lors de l&#39;élaboration de ce protocole. Cette recherche a été soutenue par le programme intra-muros des NIH.

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<li>Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-genetic+origins+of+cell-to-cell+variability+in+TRAIL-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis.</a> Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).</li>
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<li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li>
<li>Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Transcriptional+Bursting+in+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria.</a> Cell. 158 (2), 314-326 (2014).</li>
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<li>Senecal, A., Munsky, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+Factors+Modulate+c-Fos+Transcriptional+Bursts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li>
<li>Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+control+of+expression+mean+and+variance+by+epigenetic+features+at+different+genomic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci.</a> Mol. Syst. Biol. 11 (5), 806+(2015).</li>
<li>Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+burst+frequency+and+burst+size+are+equally+modulated+across+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (43), 17454-17459 (2012).</li>
<li>Thattai, M., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+fluctuating+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in fluctuating environments.</a> Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).</li>
<li>Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Pulses+Diversify+Target+Gene+Expression+Dynamics+in+an+mRNA+Half-Life-Dependent+Manner+and+Delineate+Co-regulated+Target+Gene+Subnetworks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks.</a> Cell Syst. 2 (4), 272-282 (2016).</li>
<li>Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+p53-Mdm2+feedback+loop+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells.</a> Nat. Genet. 36 (2), 147-150 (2004).</li>
<li>Levine, A. J., Oren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+30+years+of+p53%3A+growing+ever+more+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The first 30 years of p53: growing ever more complex.</a> Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 749-758 (2009).</li>
<li>Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+human+p53-regulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of human p53-regulated genes.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (5), 402-412 (2008).</li>
<li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinf. 13 (1), 134(2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma-Aldrich/General_Information/1/pcr-technologies-guide.pdf">PCR Technologies: A Technical Guide</a>. , Sigma-Aldrich. St. Louis, MO. (2014).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).</li>
<li>Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+initiation%3A+a+mechanism+for+triggering+p53+pulses+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage.</a> Mol. Cell. 30 (3), 277-289 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Flow+Cytometry%3A+Principles+and+Applications%22">Flow Cytometry: Principles and Applications</a>. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Real-time+PCR%22">Real-time PCR</a>. , Taylor & Francis. (2006).</li>
<li>Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+co-expression+measures%3A+mutual+information%2C+correlation%2C+and+model+based+indices%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices.</a> BMC Bioinf. 13 (1), 328(2012).</li>
<li>Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARACNE%3A+An+Algorithm+for+the+Reconstruction+of+Gene+Regulatory+Networks+in+a+Mammalian+Cellular+Context%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context.</a> BMC Bioinf. 7 (Suppl 1), (2006).</li>
<li>Haff, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+quantitative+PCR+using+nested+primers%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">Improved quantitative PCR using nested primers.</a> PCR Methods Appl. 3 (6), 332-337 (1994).</li>
<li>Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2%3A+sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biol. 17, 77(2016).</li>
<li>Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Single-cell+Gene+Transcription+by+RNA+Fluorescent++In+Situ+Hybridization+%28FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH).</a> J. Vis. Exp. (68), e4073(2012).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li>
<li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nat. Methods. 9 (7), 743-748 (2012).</li>
<li>Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+transcriptomics+in+thousands+of+single+human+cells+at+single-molecule+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution.</a> Nat. Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons présenté un procédé pour isoler des cellules de mammifères individuels à partir d&#39;une population de cellules adhérentes cultivées en culture et pour le dosage de l&#39;expression d&#39;environ 96 gènes dans chaque cellule. Une bonne préparation préalable est essentielle pour que cette méthode fonctionne bien. En particulier, la conception et les tests paires d&#39;amorces spécifiques pour les transcriptions d&#39;intérêt (étapes 1,2-1,3) prennent du temps, mais d&#39;importantes étapes, comme les amorces ...

Les cellules individuelles dans une population peuvent montrer des réponses très différentes à un stimulus uniforme physiologique 1, 2, 3, 4. La variation génétique des cellules dans une population est un mécanisme pour cette série de réactions, mais il existe également plusieurs facteurs non génétiques qui peuvent augmenter la variabilité des réponses, même dans une population clonale de cellules. Par exemple, les niveaux de différentes protéines et d&#39;autres molécules de signalisation importantes peuvent varier sur une base cellule par cellule, donnant lieu à des variations dans les profils d&#39;expression des gènes en aval. En outre, l&#39; activation du gène peut se produire dans des éclats de courte durée des relevés de notes 5, 6 qui peuvent être limités à un nombre relativement faible de transcrits par rafale 7, 8, 9. Telstochasticité dans l&#39; activation de gène peut grandement contribuer à la variabilité des réponses biologiques et peut fournir un avantage sélectif sur les micro - organismes 10 dans des cellules mammifères et 1, 2 répondant à un stimulus physiologique. En raison de ces deux sources génétiques et non génétiques de la variation, le profil d&#39;expression génique d&#39;une cellule donnée en réponse à un stimulus peut être très différente du profil d&#39;expression génique moyenne obtenue à partir de la mesure de la réponse en vrac. Déterminer la mesure dans laquelle les cellules individuelles présentent une grande variabilité dans la réponse à un stimulus nécessite des techniques pour l&#39;isolement de cellules individuelles, la mesure des niveaux d&#39;expression des transcrits d&#39;intérêt, et l&#39;analyse informatique des données d&#39;expression en résultant. Il existe plusieurs approches pour le dosage de l&#39;expression des gènes dans des cellules individuelles, couvrant un large éventail de coûts, nombre de transcrits sondé, etprécision de quantification. Par exemple, une seule cellule ARN-Seq offre une grande profondeur de la couverture de la transcription et de la capacité à quantifier des milliers de transcriptions distinctes pour les gènes les plus fortement exprimé dans des cellules individuelles; Cependant, le coût associé à une telle profondeur de séquençage peut être prohibitif, même si les coûts continuent de diminuer. A l&#39; inverse, une seule molécule d&#39; ARN hybridation fluorescente in situ (smRNA FISH) propose une quantification précise des transcriptions pour encore faible expression de gènes à un coût raisonnable par gène d&#39;intérêt; Cependant, seul un petit nombre de gènes cibles peut être testée dans une cellule donnée par cette approche. tests basés sur la PCR quantitative, décrits dans le présent protocole, fournissent un juste milieu entre ces techniques. Ces tests utilisent une machine microfluidique PCR en temps réel pour quantifier jusqu&#39;à 96 transcriptions d&#39;intérêt à un moment dans un maximum de 96 cellules. Bien que chacune des méthodes mentionnées ci-dessus a des coûts matériels nécessaires, le coût de tout essai qPCR individuelle est relativementfaible. Ce protocole est adapté de celui suggéré par le fabricant d&#39;une machine microfluidique PCR en temps réel (Protocole ADP 41, Fluidigm). Pour permettre l&#39;estimation du nombre absolu de chaque transcription dans une approche basée sur la PCR, nous avons élargi le protocole à utiliser des contrôles internes de préparées amplicons de gènes cibles qui peuvent être utilisés dans de multiples expériences. A titre d&#39;exemple de cette technique, la quantification de l&#39;expression des gènes régulés par le suppresseur de tumeur p53 dans les cellules MCF-7 de carcinome du sein humain 11 est décrit. Les cellules sont contestées avec un agent chimique qui induit ADN cassures double brin. Des études antérieures ont montré que la réponse de p53 à l&#39; ADN cassures double brin présente une grande hétérogénéité dans des cellules individuelles, tant en termes de niveaux de p53 12 et dans l&#39;activation de gènes cibles distinctes 11. En outre, p53 régule l&#39;expression de plus de 100bien caractérisé des gènes cibles impliqués dans de nombreuses voies en aval, y compris l&#39; arrêt du cycle cellulaire, l&#39; apoptose et la sénescence 13, 14. Puisque la réponse médiée par p53 dans chaque cellule est à la fois complexe et variable, l&#39;analyse des avantages du système à partir d&#39;une approche dans laquelle près de 100 gènes cibles peut être sondé simultanément dans des cellules individuelles, telles que celles décrites ci-dessous. Avec de légères modifications (telles que les méthodes alternatives pour l&#39;isolement de cellules isolées et une lyse), le protocole peut être facilement adapté pour étudier un large éventail de types de cellules de mammifère, des transcriptions et des réponses cellulaires. Avec une préparation préalable appropriée, une ronde de tri cellulaire et la mesure de l&#39;expression du gène peut être réalisée selon ce protocole sur une période de trois jours. Le calendrier suivant est proposé: à l&#39;avance, sélectionner les transcriptions d&#39;intérêt, d&#39;identifier et de valider les paires d&#39;amorces qui amplifient l&#39;ADNc de ceux transcrIPTS, et de préparer les normes et mélanges d&#39;amorces en utilisant ces amorces. Le jour 1, après un traitement cellulaire, la récolte et de trier les cellules, effectuer la transcription inverse et l&#39;amplification de cible spécifique, et de traiter les échantillons avec une exonucléase pour éliminer les amorces non constituées en société. Le jour 2, effectuer un contrôle de qualité sur les cellules triées en utilisant qPCR. Enfin, le jour 3, mesurer l&#39;expression des gènes dans les cellules triées en utilisant microfluidique qPCR. La figure 1 résume les différentes étapes.

<table><tbody><tr><td>Mini kit RNeasy Plus</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcription inverse de l’ADNc haute capacité avec inhibiteur de RNase</td><td>ThermoFisher</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>Phusion ADN polymérase haute fidélité</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT Kit de dosage d’ADNdb haute sensibilité</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33120&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml tubes de microcentrifugation à faible adhérence</td><td>USA Scientific</td><td>1420-2600</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de suspension d’ADN</td><td>Teknova</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 0,2 ml Maxymum Recovery Tubes PCR à paroi mince Corning</td><td></td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Échantillon & Kit de réactifs de chargement de dosage</td><td>Fluidigm</td><td>100-3415</td><td></td></tr><tr><td>HyClone RPMI 1640 média</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal, certifié (US)</td><td>ThermoFisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Solution antibiotique-antimycosique</td><td>Corning</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>Néocarzinostatine</td><td>Sigma</td><td>N9162</td><td></td></tr><tr><td>ELIMINase</td><td>Decon Labs</td><td>1101</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-In</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>11753500</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DNA</td><td>Affymetrix</td><td>14380 10 MG</td><td></td></tr><tr><td>ThermalSeal Film d’étanchéité, stérile</td><td>Excel Scientific</td><td>STR-THER-PLT</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria IIu</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyClone Trypsin 0,05 %</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30236,01</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &micro ; m Cell Strainer</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Exonucléase I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix à faible ROX</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5210</td><td></td></tr><tr><td>96.96 Dynamic Array IFC pour l’expression génique (puce microfluidique qPCR)</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur IFC HX (machine de chargement)</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioMark ou BioMark HD (machine qPCR microfluidique)</td><td>Logiciel d’analyse</td> PCR en temps réel Fluidigm<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Logiciel Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

unicellulaire profil d&#39;expression génique utilisant facs et qpcr avec les normes internes

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Les mesures d’expression génique à partir de populations massives de cellules peuvent masquer la variation transcriptomique considérable des cellules individuelles au sein de ces populations. Les mesures de l’expression génique d’une seule cellule peuvent aider à évaluer le rôle du bruit dans l’expression des gènes, à identifier les corrélations dans l’expression de paires de gènes et à révéler des sous-populations de cellules qui répondent différemment à un stimulus. Ici, nous décrivons une procédure permettant de mesurer l’expression de jusqu’à 96 gènes dans des cellules de mammifères isolés d’une population croissante en culture tissulaire. Les cellules sont triées dans un tampon de lyse par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), et les espèces d’ARNm d’intérêt sont transcrites et amplifiées en sens inverse. L’expression des gènes est ensuite mesurée à l’aide d’une machine de PCR microfluidique en temps réel, qui effectue jusqu’à 96 tests qPCR sur un maximum de 96 échantillons à la fois. Nous décrivons également la génération et l’utilisation d’étalons d’amplicon PCR pour permettre l’estimation du nombre absolu de chaque transcrit. Comparée à d’autres méthodes de mesure de l’expression génique dans des cellules uniques, cette approche permet de quantifier des transcrits plus distincts que l’ARN FISH à un coût inférieur à celui de l’ARN-Seq.

Un aperçu général du protocole est représentée sur la figure 1, comprenant des étapes pour le traitement des cellules, l&#39;isolement des cellules isolées par FACS, la génération et la pré-amplification des banques d&#39;ADNc à partir de lysats de cellule unique, la confirmation des banques d&#39;ADNc monocellulaires dans les puits triées et la mesure de l&#39;expression des gènes par PCR quantitative. En pré...

Nous décrivons une méthode pour trier des cellules de mammifères uniques et quantifier l’expression d’un maximum de 96 gènes cibles d’intérêt dans chaque cellule. Cette méthode comprend l’utilisation de normes qPCR internes pour permettre l’estimation du nombre absolu de transcrits.

Unicellulaire profil d&#39;expression génique utilisant FACS et qPCR avec les normes internes

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

L'objectif général de cette procédure est de quantifier les niveaux d'ARNm dans des cellules individuelles à l'aide de la qPCR en microfluidique avec des étalons internes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie unicellulaire, telles que savoir si des populations cellulaires réagissent à un stimulus de manière caractéristiquement différente. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de mesurer l'expression d'un plus grand nombre de gènes que l'hybridation in situ par ARN (RNA FISH), et ce à un coût inférieur à celui du RNA-Seq dans des cellules uniques.L'idée de cette méthode nous est d'abord venue lorsque nous explorions des protocoles permettant de mesurer l'expression génique dans des cellules uniques par qPCR microfluidique. Nous souhaitions modifier les méthodes existantes afin d'estimer plus précisément le nombre absolu de transcrits différents dans des cellules individuelles. William Telford, responsable de la plateforme de cytométrie en flux utilisée par mon laboratoire, démontrera la procédure de tri cellulaire.Après avoir généré et purifié des amplicons à partir des gènes d'intérêt selon le protocole décrit dans le texte, combiner 18 microlitres de chaque amplicon purifié dans un tube microcentrifuge de 2,0 millilitres à faible rétention, puis ajouter du tampon de suspension d'ADN jusqu'à un volume total de 1 800 microlitres afin que la concentration de chaque amplicon soit de cinq fois 10 à la sixième molécules par microlitre. Vortexer soigneusement l'étalon 5e6 et le répartir en aliquots de 20 microlitres dans des tubes PCR à faible rétention. Après avoir ensemencé les cellules MCF7 p53-Venus selon le protocole décrit dans le texte, ajouter 400 nanogrammes par millilitre de néocarzinostatine aux cellules et les traiter pendant 3, 8,5, 14 ou 24 heures.Pour préparer le tampon de lyse, associez les réactifs énumérés dans ce tableau. Transférez 92,4 microlitres du tampon dans un tube séparé afin qu’il serve de tampon de lyse pour les standards d’amplicons. Le tampon de lyse restant sera utilisé pour les cellules.Préparez et ajoutez l'ADN d’E.coli au tampon de lyse pour les cellules, conformément au protocole écrit. Pour préparer les étalons, étiquetez six tubes de centrifugation à faible rétention. Ajoutez 90 microlitres de tampon de suspension d’ADN au tube 5e5.Ajouter 90 microlitres de tampon contenant 6,2 picogrammes par microlitre d'ADN d'E.coli dans chacun des cinq autres tubes et maintenir tous les tubes sur glace. Après avoir prélevé un aliquot de 5e6 étalon depuis le stockage, vortexer brièvement le tube, puis le centrifuger afin de s'assurer que le liquide se trouve bien au fond du tube ; puis, à l'aide d'une pipette à faible rétention, ajouter 10 microlitres de l'étalon 5e6 dans le tube 5e5. Vortexer, centrifuger et replacer le tube sur glace.Ensuite, prélevez 10 microlitres à partir du tube 5e5 et transférez-les dans le tube 5e4, puis vortexez brièvement le tube, centrifugez-le et replacez-le sur de la glace. Répétez les dilutions sérielles pour chaque tube, en ajoutant 10 microlitres provenant du tube précédent, jusqu'à ce que tous les tubes contiennent une dilution standard. Après avoir préparé les tubes PCR contenant le tampon de lyse, utilisez une pipette à 12 canaux pour distribuer neuf microlitres de tampon de lyse cellulaire, à partir de la rangée de tubes PCR, dans chaque puits des sept premières rangées d'une plaque PCR.Distribuer sept microlitres de tampon de lyse standard dans chaque puits de la dernière rangée de la plaque, puis, à l’aide de pointes de pipette à faible rétention, ajouter deux microlitres d’étalon dans chaque puits de la rangée inférieure selon la carte de la plaque. Ajouter deux microlitres d’ADN d’E.coli à 3,1 picogrammes par microlitre dans les puits correspondant à 10 cellules et 100 cellules, puis ajouter deux microlitres d’ADN d’E.coli à 6,2 picogrammes par microlitre dans les puits sans cellules. Après avoir programmé le trieur cellulaire activé par fluorescence pour effectuer le tri dans une plaque de 96 puits selon la carte de la plaque, viser l’appareil en scellant une plaque PCR vide et en utilisant le jet d’essai pour trier des gouttelettes et du PBS sur le scellé de la plaque vide.Si les gouttelettes ne tombent pas à la position correcte, les essuyer à la surface du sceau, recalibrer le trieur cellulaire conformément aux instructions du fabricant de l'appareil, et répéter jusqu'à ce que les gouttelettes du flux de tri soient déposées correctement. Récolter les cellules par trypsination et les resuspendre dans 0,5 millilitre de PBS contenant 2 % de FBS, puis transférer dans un tube de cytométrie en flux. Pour trier les cellules, insérer le tube contenant la suspension cellulaire dans le trieur cellulaire, ouvrir le sceau sur la plaque de tampon de lyse, puis trier soigneusement les cellules d'intérêt dans la plaque selon la carte de la plaque.Pour garantir que les cellules uniques soient triées avec une pureté maximale, faites fonctionner l'appareil en mode cellule unique et utilisez un ciblage standard en cytométrie en flux basé sur la diffusion avant et latérale. À l'issue de l'analyse, scellez la plaque avec un nouveau scellé thermique stérile et centrifugez-la à 400 ×g à quatre degrés Celsius pendant une minute, puis placez la plaque dans le thermocycleur et lancez le programme RT-STA préalablement préparé. Après centrifugation de la plaque RT-STA terminée, utilisez une pipette à 12 canaux pour distribuer 3,6 microlitres d'exonucléase I diluée dans chaque puits de la plaque.Sceller la plaque et effectuer une brève centrifugation, puis placer la plaque dans le thermocycleur et lancer le programme exo I. Pour mesurer l'expression du gène de référence dans chaque échantillon, préparer 900 microlitres de mélange maître qPCR contenant le colorant de liaison à l'ADN pour 96 réactions, en utilisant des amorces provenant de l'un des gènes de référence sélectionnés. Répartir neuf microlitres de mélange maître dans chaque puits d'une plaque PCR 96 puits, puis ajouter un microlitre d'échantillon provenant de la plaque d'échantillons dans le puits correspondant de la plaque PCR.Exécutez la plaque sur une machine de PCR en temps réel en utilisant un protocole de cyclage thermique recommandé par le fabricant du mélange maître ou selon un protocole standard, puis analysez les échantillons et établissez une carte de plaque des mélanges d'échantillons conformément au protocole écrit. Étiquetez une plaque « mélanges d'échantillons », puis, à l’aide d’une pipette à huit canaux, distribuez 3,3 µL de mélange réactif de chargement du mélange maître dans chaque puits d’une plaque PCR à 96 puits. Pour chaque plaque PCR d’échantillons, vortexez la plaque pendant 10 secondes et centrifugez-la à 500 ×g pendant 10 secondes.Retirez le couvercle et transférez 2,7 microlitres de chaque échantillon positif d'une cellule vers le puits correspondant sur la plaque de mélanges d'échantillons, pour les puits d'une cellule indiqués sur la carte de la plaque. Retirez l'autocollant du fond d'une nouvelle puce qPCR microfluidique, puis, à l’aide d’une seringue remplie de fluide de la ligne de contrôle avec le capuchon encore en place, appuyez sur chaque ressort accumulateur pour le desserrer et injectez 100 à 200 microlitres de fluide de la ligne de contrôle dans chaque accumulateur. Insérez la puce dans la machine de chargement et exécutez le script d’amorçage, puis, à l’aide d’une pipette à huit canaux, transférez 4,5 microlitres de chaque mélange d’essai dans le côté gauche de la puce qPCR microfluidique.Il est essentiel d'éviter la formation de bulles d'air au fond des puits. Celles-ci provoqueraient des problèmes de chargement. Pour les prévenir, appliquez les embouts de pipette contre la paroi du puits, puis pipetez uniquement jusqu'au premier seuil d'arrêt.Transférez 4,5 microlitres de chaque mélange d'échantillon sur le côté droit de la puce qPCR microfluidique, puis insérez la puce dans la machine de chargement et exécutez le script de chargement du mélange. Une fois le script de chargement terminé, vérifiez qu'aucune ligne ne traverse la puce, ce qui indiquerait un problème de chargement, puis utilisez du ruban adhésif pour retirer soigneusement toute particule de poussière présente sur la puce. Ensuite, insérez la puce dans la machine de PCR en temps réel microfluidique et lancez le script de collecte des données. Enfin, analysez les données conformément au protocole écrit.Cette figure montre les niveaux d'expression d'un gène de référence mesurés par qPCR afin de déterminer quelles puits ont reçu une seule cellule. Les échantillons ayant reçu une cellule présentent de faibles valeurs de CT. Les échantillons sans cellule ont des valeurs de CT beaucoup plus élevées.Les puits destinés à l'étalon d'amplicon doivent présenter des courbes d'amplification régulièrement espacées. Une séparation nette entre les courbes des puits sans cellule, avec 10 cellules et avec 100 cellules doit également être observée. Les échantillons d'ADN représentant des cellules réelles sont sélectionnés un par un à partir de plusieurs plaques de 96 puits triées et regroupés dans une seule plaque en vue de la préparation de la qPCR en microfluidique.Cette carte thermique résume les résultats de la qPCR en microfluidique. La variation de couleur dans chaque colonne montre la variabilité de l'expression de chaque gène entre différentes cellules. Les deux lignes nettement plus foncées que les autres représentent très probablement des échantillons défectueux.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de maintenir votre espace de travail exempt de RNase et d'ADN, particulièrement lors de la préparation des étalons et du tampon de lyse. Les étapes pré-PCR de ce protocole sont sensibles à la contamination. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de quantifier l'expression de plusieurs gènes d'intérêt dans des cellules individuelles.Après cette procédure, d'autres méthodes, comme l'hybridation in situ par fluorescence d'ARN monocellulaire, peuvent être réalisées afin de valider les mesures de l'abondance d'ARNm dans des cellules individuelles.

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