L'agrégation magnétique de cellules souches 3D et bioréacteurs Maturation pour Cartilage régénération

L’objectif global de cette méthode d’agrégation de cellules magnétiques et de maturation dynamique est d’améliorer la chondrogenèse in vitro des cellules stromales mésenchymateuses ou CSM. L’agrégation magnétique des cellules souches au lieu de la chondrogenèse, car la condensation cellulaire est une étape clé précoce du processus de régénération du cartilage. Une fois que les cellules souches sont confinées dans des échafaudages, les échafaudages peuvent être déplacés dans un bioréacteur cellulaire pour évaluer la maturation dynamique des cellules.

Une méthode dynamique importante peut être appliquée à d’autres bio-systèmes tels que la réparation musculaire, cardiaque ou vasculaire. Mais comme vous le verrez, il est très bien adapté à la régénération du cartilage. La démonstration visuelle de l’ensemencement magnétique des cellules et de la maturation dynamique des cellules à l’aide du bioréacteur réel est essentielle car ces deux techniques sont difficiles à apprendre à partir d’instructions textuelles uniquement.

Pour construire le dispositif de microaimant pour la formation d’agrégats, insérez d’abord une pointe magnétique de 750 micromètres de diamètre dans chaque trou de trois centimètres d’une plaque d’aluminium de six millimètres d’épaisseur et placez la plaque sur un aimant permanent en néodyme. Pour construire un dispositif d’ensemencement d’échafaudage, coupez d’abord le polystyrène dur en carrés de 2,4 centimètres carrés et insérez des aimants de trois millimètres de diamètre et de six millimètres de long à une distance égale sur une surface de 1,6 centimètre carré. Placez ensuite l’appareil sur un aimant permanent en néodyme.

Pour marquer les CSM humaines, cultivez d’abord les cellules souches dans un milieu de croissance complet à 37 degrés Celsius à 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 90 %. Aspirez puis rincez les cellules avec le sérum trois RPMI milieu sans glutamine, et ajoutez 10 millilitres de solution de nanoparticules d’oxyde de fer par flacon de culture de 150 centimètres carrés pour une incubation de 30 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire. À la fin de l’incubation, rincez les cellules pendant cinq minutes avec du sérum trois RPMI milieu sans glutamine pour internaliser les nanoparticules encore attachées à la membrane plasmique.

Remplacez ensuite le RPMI dans chaque flacon par 25 millilitres de milieu de croissance MSC complet et remettez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant la nuit. Le lendemain matin, détachez les cellules magnétiques avec huit millilitres de Trypsine-EDTA à 05 % par fiole. Et collecter les cellules dissociées par centrifugation.

Nous suspendons les pastilles pour le comptage et plaçons une boîte de Pétri de culture cellulaire de 35 millimètres à fond de verre sur chaque dispositif magnétique. Pour former magnétiquement les agrégats, ajoutez trois millilitres de milieu chondrogénique dans chaque boîte de Pétri et déposez doucement pas plus de huit microlitres de 2,5 fois 10 à la 5e cellule marquée par agrégat. Il est essentiel que les cellules ne se déposent ni trop lentement ni trop rapidement.

Et ni trop près, ni trop loin du magnétisme. Lorsque tous les agrégats ont été placés, laissez les sphéroïdes se former pendant 20 à 30 minutes sans être dérangés. Transférez ensuite les agrégats dans l’incubateur de culture cellulaire.

Le même jour, formez des agrégats en centrifugeant 2,5 fois 10 à la 5ème cellules souches marquées dans des tubes coniques de 15 millilitres avec 1,5 millilitres de milieu chondrogénique. Pour ensemencer magnétiquement les échafaudages, placez un échafaudage poreux polysaccharidique pullulan/dextran séché par boîte de Pétri et diluez 2 fois 10 à la 6ème cellules marquées dans 350 microlitres de milieu chondrogène sans TGFbeta3. Pipetez soigneusement les cellules sur les échafaudages et incubez les structures à 37 degrés Celsius pour permettre une pénétration complète des cellules.

Après cinq minutes, ajoutez doucement trois millilitres de milieu chondrogène dans la boîte de Pétri et remettez les échafaudages dans l’incubateur de culture cellulaire pendant quatre jours pour permettre aux cellules de migrer à travers les pores de l’échafaudage. Le même jour, ensemencez également un autre ensemble d’échafaudages avec 2 fois 10 à la 6ème cellules souches marquées comme démontré et incubez les cellules sans l’aimant pour obtenir des échafaudages uniformément ensemencés comme témoins positifs. Pour la chondrogenèse en échafaudages, le cinquième jour, retirez le dispositif magnétique de tous les échafaudages et remettez les échafaudages statiques dans l’incubateur de culture cellulaire jusqu’au 25e jour, en changeant le milieu deux fois par semaine.

Pour la culture cellulaire dynamique, même le cinquième jour, coupez le tube en silicone à la longueur appropriée selon les instructions du fabricant et rythmez le tube, la chambre de culture de 500 millilitres, les rotateurs bidirectionnels et les cages dans un poste de sécurité microbiologique stérile. En suivant les instructions du fabricant, connectez le tube aux rotateurs bidirectionnels dans la chambre de culture. Ensuite, à l’aide d’une spatule stérile, transférez soigneusement deux échafaudages cellulaires dans chaque cage.

Lorsque tous les échafaudages ont été transférés, insérez les cages à travers les aiguilles du couvercle pour les empêcher de bouger pendant la rotation. Et remplissez la chambre de culture avec un milieu chondrogénique. Utilisez une technique antiseptique stérile lors de la préparation des chambres pour éviter la contamination des outils ou des échafaudages.

Ensuite, insérez les cages dans la chambre, puis fermez la chambre et allumez la pompe péristaltique pour remplir le tube de milieu chondrogène et éliminer les bulles d’air. Placez et fixez la chambre remplie à l’intérieur du moteur du bioréacteur et allumez l’ordinateur qui contrôle les rotations du bras et de la chambre. Appliquez ensuite une vitesse de rotation de cinq rotations par minute à la fois au bras et à la chambre, et ajustez la pompe péristaltique à un débit de 10 rotations par minute pour une alimentation continue des échafaudages cellulaires.

Pour générer une construction d’agrégat 3D sans échafaudage, le huitième jour, lancez la fusion en plaçant deux agrégats en contact dans un milieu chondrogénique pour huit doublats. Puis, le jour 11, fusionnez deux doublettes pour former quatre quadruplés, et formez la structure finale le jour 15 en fusionnant les quatre quadruplés. Les tissus formés par fusion magnétique présentent une augmentation significative de l’expression du collagène II par rapport aux granulés obtenus par centrifugation.

Avec une tendance accrue à l’expression agrégée. Pour les échafaudages statiques cellularisés, une augmentation de l’agrégat et du collagène II est observée lors de l’utilisation de l’ensemencement magnétique, par rapport à l’échafaudage ensemencé sans forces magnétiques. Il est intéressant de noter que l’expression du collagène II est beaucoup plus élevée lorsque l’ensemencement magnétique est combiné à une différenciation dynamique.

L’analyse histologique au bleu de toluidine révèle que la fusion magnétique séquentielle de 16 agrégats présente un dépôt abondant de glucosamineglycanes. De plus, dans les échafaudages à ensemencement magnétique, la teneur en glucosamine-glycane est plus élevée lorsque les échafaudages sont différenciés dans un bioréacteur que lorsqu’ils sont cultivés de manière statique. Une fois maîtrisée, l’agrégation de cellules magnétiques peut être terminée en deux heures si elle est effectuée correctement.

Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier de remettre en suspension les cellules marquées dans un volume aussi petit que possible pour faciliter la formation de l’agrégat. Suite à l’ensemencement magnétique des échafaudages, la maturation dynamique à l’aide du bioréacteur proprement dit peut être réalisée pour améliorer l’expression de nouveaux chondrocytes synthétisés. Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la médecine régénérative pour explorer la régénération du cartilage articulaire chez l’homme.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de construire des dispositifs magnétiques, d’étiqueter les cellules souches, de former des agrégats de cellules souches, d’ensemencer magnétiquement des échafaudages et d’utiliser un véritable bioréacteur. N’oubliez pas que travailler avec des cellules et des tissus humains peut être extrêmement dangereux et que des précautions doivent toujours être prises, comme le port de gants, de blouses de laboratoire et de lunettes de protection.