Name: Lagrégation magnétique de cellules souches 3D et bioréacteurs Maturation pour Cartilage régénération (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Découvrez l'agrégation magnétique 3D de cellules souches MSC et la maturation en bioréacteur pour améliorer la chondrogenèse in vitro. Cette méthode optimise la régénération cartilagineuse par stimulation mécanique dynamique.

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Les auteurs tiennent à remercier QuinXell Technologies et CellD, en particulier Lothar Grannemann et Dominique Ghozlan pour leur aide dans le bioréacteur. Nous remercions Catherine Le Visage, qui nous a fourni les échafauds de polysaccharide pullulane / dextran. Ce travail a été soutenu par l&#39;Union européenne (projet ERC-2014-cog MATISSE 648779) et par le AgenceNationalede la Recherche (ANR), France (projet ANR-11 MagStem SVSE5).

1. La construction des dispositifs magnétiques REMARQUE: Les dispositifs utilisés pour l&#39; ensemencement des cellules varient en fonction de l&#39;application (Figure 1). Pour former des agrégats, le nombre de cellules est limité à 2,5 x 10 5 / agrégat, de sorte que les pointes magnétiques doivent être très minces (750 um de diamètre). Pour les semences 1,8 cm 2/7 échafauds mm d&#39;épaisseur, les aimants doivent être plus grands (3 mm de diamètre) et assureront la migration des cellules à travers les pores de l&#39;échafaudage. <ol><li> Construction d&#39;un dispositif à micro-aimants pour la formation d&#39; agrégats (figure 1A) <ol><li> Faire des micro-trous avec un foret de 0,8 mm à travers des plaques d&#39;aluminium (3 cm de diamètre et de 6 mm d&#39;épaisseur). </li><li> Insérer une pointe magnétique (750 um de diamètre) dans chaque trou de la plaque. </li><li> Placez ce disque sur un aimant néodyme permanent, qui assure l&#39;aimantation à saturation. </li></ol></li><li> La construction d&#39;un dispositif d&#39;ensemencement d&#39;échafaudage ( <strong&gt; Figure 1B) <ol><li> Couper le polystyrène dur en 2,4 cm 2 carrés. </li><li> Insérez 9 petits aimants (3 mm de diamètre, 6 mm de long) à une distance égale sur une zone de surface de 1,6 cm 2. </li><li> Placez cet appareil sur un aimant néodyme permanent. </li></ol></li></ol> 2. Tige marquage des cellules NOTE: Les cellules souches ont été marquées avec 0,1 mM de nanoparticules magnétiques pendant 30 min (2,6 ± 0,2 pg fer / cellule) pour former des agrégats, alors qu&#39;ils ont été marquées avec 0,2 mM de nanoparticules magnétiques pendant 30 min (5 ± 0,4 pg fer / cellule) aux plants échafauds. Ces concentrations de nanoparticules et des temps d&#39;incubation ont été utilisés précédemment et publié pour les cellules MSC et d&#39; autres 18, 19, et il a été déterminé que les nanoparticules touchées ni la viabilité cellulaire , ni la capacité de différenciation MSC. La masse de fer incorporée par les cellules souches a été mesurée par simple-cell magnétophorèse 19, 20. <ol><li> Culture de cellules souches mésenchymateuses humaines (MSC) dans un milieu de croissance de cellules souches mésenchymateuses intégral (MSCGM) à 37 ° C et 5% de CO 2 , jusqu&#39;à proximité de la confluence (~ 90%). </li><li> Préparer la solution magnétique de marquage en mélangeant 0,1 ou 0,2 mM d&#39; oxyde de fer revêtu de citrate-maghémite (γFe 2 O 3; core: 8 nm de diamètre) dans du milieu de 5A de McCoy sans sérum modifié au Roswell Park Memorial Institute (RPMI) sans glutamine et contenant 5 mM de citrate de sodium. </li><li> Jeter le milieu, laver les cellules avec du milieu RPMI exempt de sérum sans glutamine, et ajouter 10 ml de solution de nanoparticules d&#39;oxyde de fer par 150 cm 2 flacon de culture, le volume minimum nécessaire pour couvrir toutes les cellules. </li><li> Incuber pendant 30 min à 37 ° C et 5% de CO 2, puis jeter la solution de nanoparticules. Rincer pendant 5 min avec du milieu RPMI exempt de sérum sans glutamine à internaliser le nanoparticles encore attachés à la membrane plasmatique. </li><li> Jeter le milieu RPMI et ajouter 25 ml de milieu complet MSCGM par flacon. Incuber pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> 3. Ensemencement cellulaire magnétique <ol><li> préparer fraîchement le moyen chondrogénique utilisant Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) de glucose élevé avec de la L-glutamine par addition de 50 uM d&#39;acide L-ascorbique-2-phosphate, 0,1 uM de dexaméthasone, 1 mM de pyruvate de sodium, 0,35 mM de L-proline, 1% de culture universelle supplément contenant de l&#39;insuline, de la transferrine humaine et de l&#39;acide sélénieux (ITS-Premix), et 10 ng / ml facteur transformant-bêta de croissance 3 (TGF-β3). </li><li> Détacher les cellules magnétiques en utilisant 8 ml de 0,05% de trypsine-EDTA par 150 cm 2 flacon de culture et centrifuger les cellules dissociées à 260 x g pendant 5 min. Aspirer le moyen et compter les cellules remises en suspension. </li><li> Placer une boîte de Pétri de culture cellulaire à fond en verre (35 mm) au-dessus des deux dispositifs magnétiques. </li><li> À Mformer des agrégats agnetically, ajouter 3 ml de milieu chondrogénique à la boîte de Petri et déposer doucement le plus petit volume possible (pas plus de 8 ul) contenant 2,5 x 10 5 cellules marquées par agrégat (jusqu&#39;à 16 agrégats peuvent être déposés). Laisser la boîte de Pétri pendant 20-30 min sans le déplacer, ce qui permet de former des sphéroïdes, puis placer le dispositif complet, y compris la boîte de Petri contenant des 16 agrégats dans l&#39;incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> agrégats de contrôle de formulaire suivant le même protocole et remplacer le milieu par du milieu complet sans chondrogénique TGF-β3. <ol><li> Pour générer la construction d&#39;agrégat 3D, placer 2 agrégats en contact le jour 8 pour former 8 doublets et d&#39;initier la fusion. Le jour 11, fusion 2 doublets pour former 4 quadruplés. Enfin, les 4 quadruplés fusible le jour 15 pour obtenir la structure finale. </li><li> Dans le même temps, former des agrégats par centrifugation de 2,5 x 10 5 cellules souches marquées à 26015; g pendant 5 min dans des tubes de 15 ml avec 1,5 ml de milieu chondrogénique avec ou sans TGF-β3 (pour l&#39;échantillon et de contrôle, respectivement). </li></ol></li><li> Pour magnétiquement échafauds de semences, placer chaque échafaudage séché dans une boîte de Petri. Utilisation des échafaudages poreux de polysaccharide en pullulane / dextran 21. Pour chaque échafaudage, diluer 2 x 10 6 cellules souches marquées dans 350 ul de milieu chondrogénique sans TGF-β3 et la pipette soigneusement les cellules sur l&#39;échafaudage. <ol><li> Incuber pendant 5 min à 37 ° C pour permettre la pénétration cellulaire complète à l&#39;intérieur de l&#39;échafaudage, puis ajouter doucement 3 ml de milieu chondrogénique avec ou sans TGF-β3 (pour l&#39;échantillon ou du contrôle, respectivement) à la boîte de Petri. </li><li> Incuber l&#39;échafaudage cellularisée sur son dispositif magnétique à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 4 jours pour permettre la migration des cellules à travers les pores de l&#39; échafaudage et de confinement. </li></ol></li><li> Dans le même temps, les semences échafaudages avec 2 x 10 6 </sup&gt; cellules souches marquées suivant la même méthode et laisser incuber sans l&#39;aimant pour obtenir échafauds uniformément ensemencés comme témoins positifs. </li></ol> 4. Différenciation en chondrocytes NOTE: Après 4 jours d&#39;incubation, retirez les aimants et continuer la maturation chondrogénique soit dans une boîte de Petri (conditions statiques) ou dans un bioréacteur (conditions dynamiques). Des échantillons de contrôle négatifs sont arrivés à échéance dans des conditions statiques avec un milieu chondrogénique sans TGF-β3. <ol><li> Dans des conditions statiques, garder les échafauds cellularisées ou d&#39;agrégats dans la même boîte de Petri. Changer le support chondrogénique deux fois par semaine pendant 21 jours. </li><li> Dans des conditions dynamiques, préparer le bioréacteur. <ol><li> Couper un tube en silicone à la longueur appropriée selon le protocole du fabricant. </li><li> Autoclave tous les matériaux: chambre de culture de 500 ml, tubes, rotateur deux voies, et des cages. </li><li> Placez les pièces dans un bioréacteur microbio stérilestation logique de sécurité. Connectez le tuyau aux rotateurs 2 voies et à la chambre de culture suivant les instructions du fabricant. </li><li> Transférer délicatement les échafauds cellularisées dans des cages stérilisées à l&#39;aide d&#39;une spatule stérile. Placez 2 par cage échafauds. Lorsque les cages sont prêts, les insérer dans les aiguilles du couvercle pour les empêcher de se déplacer pendant la rotation supplémentaire. Remplir la chambre de culture avec du milieu chondrogénique et le fermer avec le couvercle contenant les cages. </li></ol></li><li> Mettre en marche la pompe péristaltique pour remplir le tube avec le milieu chondrogénique et pour éliminer les bulles d&#39;air. </li><li> Placer et fixer la chambre remplie dans le moteur du bioréacteur et tourner sur l&#39;ordinateur, qui commande les rotations à la fois du bras et de la chambre. </li><li> Appliquer une vitesse de rotation de 5 tours par min (rpm) sur le bras et la chambre. Régler la pompe péristaltique à un débit de 10 tours par minute pour l&#39;alimentation continue des échafaudages cellularisées. </li></ol> REMARQUE: avant l&#39;extraction de l&#39;ARN, digérer les échafauds avec une solution enzymatique. <ol><li> Préparer 1 ml de solution enzymatique par addition de 100 ul de pullulanase (40 U / ml) et 50 ul de dextranase (60 mg / ml) à 850 ml de milieu DMEM exempt de sérum. </li><li> Rincer les échafauds deux fois avec du milieu DMEM exempt de sérum, éliminer le milieu et ajouter 800 ul de la solution enzymatique par échafaudage. Incuber pendant 15-30 minutes à 37 ° C sous agitation douce. </li><li> Lorsque l&#39;échafaudage est complètement dissous, le transfert de la solution contenant les cellules à un tube de 1,5 ml, centrifuger à 300 g pendant 10 min, aspirer soigneusement le milieu, rincer deux fois avec stérile 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS), centrifuger à 300 x g pendant 10 min, et remettre en suspension les cellules dans la solution d&#39;isolement d&#39;ARN. </li><li> Pour extraire l&#39;ARN à partir des agrégats, placer les sphéroïdes dans la solution d&#39;isolement d&#39;ARN etécraser complètement les utilisant un homogénéisateur avant d&#39;effectuer l&#39;extraction d&#39;ARN. </li><li> Isoler l&#39;ARN en utilisant un kit d&#39;extraction d&#39;ARN total selon les instructions du fabricant. </li><li> Synthétiser de l&#39;ADN complémentaire à partir de 400 ng d&#39;ARN total en utilisant la transcriptase inverse selon les instructions du fabricant, en utilisant des amorces aléatoires de 250 ng, 1 pi de mélange de dNTP (10 mM chacun), et 40 U / ml d&#39;inhibiteur de RNase; le volume final de la réaction est de 20 pi. A la fin de la réaction, ajouter 80 ul d&#39;eau distillée pour obtenir un volume final de 100 pi. </li><li> Pour la réaction en chaîne par polymérase quantitative (PCR), en utilisant un mélange de PCR contenant un réactif fluorescent pour quantifier l&#39;expression relative des gènes d&#39;intérêt, tels que l&#39;aggrécane (AGC) et le collagène II (Col II), avec 10 × ADNc dilué. Normaliser les niveaux d&#39;expression génique avec le gène ribosomique de référence protéine, Grand, P0 (RPLP0). Effectuer les calculs avec le 2 - formule AACtOù AACt = ACt de l&#39;état différencié - signifie ACt de condition de commande, et chaque ACt représente le CT du gène d&#39;intérêt - le CT du gène de référence (RPLP0). </li><li> Déterminer les mesures statistiques comme les valeurs moyennes ± l&#39;écart-type de la moyenne (SEM). Effectuer l&#39;analyse avec n ≥ 2 expériences indépendantes. Utilisez le test t de Student pour analyser les différences statistiques entre les granulés centrifugés et magnétiques (* fusions p &lt;0,05). Déterminer l&#39;importance avec pour analyser les différences statistiques entre les échafauds différenciés et avec l&#39;échafaudage de contrôle test de Kruskal-Wallis (une ANOVA non paramétrique) (* p &lt;0,05). </li></ol> 6. Analyse anatomopathologique <ol><li> Rincer les échafaudages cellularisées ou d&#39;agrégats avec 1 x PBS stérile, les fixer dans 10% de solution de formaline pendant 1 h à température ambiante, puis rincer avec 1 x PBS. </li><li> Retirez le PBS, intégrer les échantillons dans cuttin optimaleg composé de température (OCT), et les congeler dans un bain d&#39;isopentane immergé dans de l&#39;azote liquide. Conserver l&#39;échantillon à -20 ° C. Couper les échantillons avec un cryostat pour obtenir 8 um cryosections pour les agrégats ou de 12 pm pour les échafaudages cellularisées. </li><li> Colorer les cryosections avec une solution de bleu de toluidine à 0,5% pendant 2 minutes, rincer à l&#39;eau du robinet, déshydrater avec 100% d&#39;éthanol, en utilisant du toluène clarifier, et monter les lames avec un support de montage pour la microscopie optique. </li></ol>

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<li>Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-axial+mechanical+stimulation+of+tissue+engineered+cartilage%3A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review.</a> Eur Cell Mater. 13, 66-74 (2007).</li>
<li>Takahashi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compressive+force+promotes+sox9%2C+type+II+collagen+and+aggrecan+and+inhibits+IL-1beta+expression+resulting+in+chondrogenesis+in+mouse+embryonic+limb+bud+mesenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Compressive force promotes sox9, type II collagen and aggrecan and inhibits IL-1beta expression resulting in chondrogenesis in mouse embryonic limb bud mesenchymal cells.</a> J Cell Sci. 111 (14), 2067-2076 (1998).</li>
<li>Campbell, J. J., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+compressive+strain+influences+chondrogenic+gene+expression+in+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Dynamic compressive strain influences chondrogenic gene expression in human mesenchymal stem cells.</a> Biorheology. 43, 455-470 (2006).</li>
<li>Vunjak-Novakovic, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor+cultivation+conditions+modulate+the+composition+and+mechanical+properties+of+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage.</a> J Orthop Res. 17 (1), 130-138 (1999).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Tout d&#39;abord, parce que les techniques présentées ici reposent sur l&#39;intériorisation de nanoparticules magnétiques, une question importante est le résultat des nanoparticules une fois qu&#39;ils se localisent dans les cellules. Il est vrai que les nanoparticules de fer peuvent déclencher une toxicité potentielle ou la capacité de différenciation réduite en fonction de leur taille, le revêtement et le temps d&#39;exposition 19, 22. Cependant, plusieurs ét...

Les nanoparticules magnétiques sont déjà utilisés dans la clinique comme agents de contraste pour l&#39;imagerie par résonance magnétique (IRM), et leurs applications thérapeutiques garder en expansion. Par exemple, il a récemment été démontré que les cellules marquées peuvent être manipulées in vivo en utilisant un champ magnétique externe et peuvent être dirigées et / ou maintenues à un site défini d&#39;implantation 1, 2, 3. Dans la médecine régénérative, ils peuvent être utilisés pour concevoir des tissus organisés in vitro 4, y compris le tissu vasculaire 5, 6, 7, 8 os, cartilage et 9. Le cartilage articulaire est immergé dans un environnement aseptique, ce qui rend la réparation des composants de la matrice extracellulaire sont très limitées lorsque les dommages se produisent. Pour cette raison, recherch se concentre actuellement sur l&#39;ingénierie des remplacements de cartilage hyalin qui peuvent être implantés sur le site de défaut. Afin de produire un remplacement autologue, certains groupes de recherche étudient l&#39;utilisation de chondrocytes autologues en tant que source de cellules 10, 11, tandis que d&#39; autres mettent l&#39; accent sur la capacité des cellules souches mésenchymateuses (MSC) de se différencier en chondrocytes 12, 13. Dans des études antérieures récapitulés ici, nous avons choisi MSC, comme prélèvement de moelle osseuse est assez simple et ne nécessite pas le sacrifice de chondrocytes en bonne santé, qui risquent de perdre leur phénotype 14. Une première étape essentielle pour initier la différenciation chondrogénique des cellules souches est leur condensation. Les agrégats cellulaires sont couramment formés en utilisant soit la centrifugation ou la culture de Micromass 15; Cependant, ces procédés de condensation neither présenter le potentiel de créer des agrégats de cellules à l&#39;intérieur des échafaudages d&#39;épaisseur, ni la possibilité de contrôler la fusion des agrégats. Dans cet article, nous décrivons une approche novatrice de condensation des cellules souches en utilisant un marquage magnétique MSC et attraction magnétique. Cette technique a été prouvée pour former des constructions 3D sans échafaudage par l&#39; intermédiaire de la fusion des agrégats avec l&#39;autre pour obtenir un tissu cartilagineux échelle millimétrique 9. ensemencement magnétique de échafauds épais et grand a également permis la possibilité d&#39;augmenter la taille du tissu d&#39;ingénierie, la conception d&#39;une forme plus facilement utile pour l&#39;implantation et la diversification du potentiel pour les applications cliniques de réparation du cartilage. Ici, nous détaillons le protocole pour l&#39;ensemencement magnétique du MSC en supports poreux constitués de polysaccharides naturels, le pullulane et le dextrane, les échafaudages précédemment utilisé pour confiner des cellules souches 16, 17. la différenciation chondrogénique était finally effectuée dans un bioréacteur pour assurer la diffusion des éléments nutritifs et de gaz en continu dans le noyau de la matrice des échafaudages ensemencés avec une densité élevée de cellules. En plus de fournir des éléments nutritifs, les facteurs de croissance chondrogéniques, et le gaz aux cellules, le bioréacteur a offert la stimulation mécanique. Dans l&#39;ensemble, la technologie magnétique pour confiner les cellules souches, combinée à la maturation dynamique dans un bioréacteur, peut améliorer considérablement la différenciation chondrogénique.

<table><tbody><tr><td>Nanoparticules d’oxyde de fer (maghemite) (&gamma ;-Fe2O3)</td><td>PHENIX - Université Paris 6</td><td>Fabriqué et donné par C. M&eacute ; Diamètre</td><td>moyen de 8,1 nm et charge de surface négative</td></tr><tr><td>Échafaudages polysaccharidiques Pullulan/Dextran</td><td>LIOAD - Université Nantes</td><td>Fabriqué et donné par C. Le Visage</td><td>Préparé à partir d’un mélange 75:25 de pullulan/dextran dans des conditions alcalines (10&nbsp ; M NaOH). Porosité : 185-205 et micro ; m; Épaisseur : 7&nbsp ; mm; Superficie : 1,8 cm2.</td></tr><tr><td>Système de régénération TisXell</td><td>QuinXell Technologies</td><td>QX900-002</td><td>Bioréacteur biaxial avec chambre de culture de 500 mL</td></tr><tr><td>Cage pour échafaudages : Histosette II M492&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>720-0909</td><td></td></tr><tr><td>Cellules souches mésenchymateuses (CSM)</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td> Trois <td>lots indépendants ont été utilisés</td></tr><tr><td>MSCGM BulletKit medium</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>Pour le milieu complet, ajoutez le BulletKit fourni (contenant du sérum, de la glutamine et des antibiotiques) au DMEM moyen MSCGM</td></tr><tr><td>avec Glutamax I</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td>Sans pyruvate de sodium, sans HEPES</td></tr><tr><td>RPMI medium 1640, sans Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>31870-025</td><td>Sans pyruvate de sodium, sans HEPES</td></tr><tr><td>PBS sans CaCl2 sans MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline (10,000&nbsp ; U/mL) / streptomycine (10 000 et micro ; g/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)</td><td>Corning</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate solution 100 mM</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid 2-phosphate</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td>Préparer la solution concentrée (25 mM) dans de l’eau distillée de manière extemporanée</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma</td><td>P5607</td><td>Préparez la solution mère de 175 mM diluée dans de l’eau distillée et conservez-la à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>Préparez la solution mère de 1 mM diluée dans de l’éthanol à 100 % et conservez-la à -20 °C. &deg ; C</td></tr><tr><td>TGF-bêta 3 protéine 10&nbsp ; et micro ; g</td><td>Interchim</td><td>30R-AT028</td><td></td></tr><tr><td>Citrate trisodique</td><td>VWR</td><td>33615.268</td><td>Préparez le 1&nbsp ; M solution mère diluée dans de l’eau distillée et stockée à 4&nbsp ; &deg ; C</td></tr><tr><td>Pullulanase de Bacillus acidopullulyticus</td><td>Sigma</td><td>P2986</td><td></td></tr><tr><td>Dextranase de Chaetomium erraticum</td><td>Sigma</td><td>D0443</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Kit d’extraction d’ARN</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955.5</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Transcriptase inverse</td><td>Life Technologies</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Aléatoire Apprêt - Hexamère&nbsp ;</td><td>Promega</td><td>C1181</td><td>500 & micro ; g/mL : Utiliser du 1/2 dilué et mettre 1 &micro ; L par échantillon</td></tr><tr><td>ARN recombinants dans l’inhibiteur de ribonucléase</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td>40 U/&micro ; L : mettre 1 & micro ; L par échantillon</td></tr><tr><td>de mélange de nucléotides dNTP de PCR (10&nbsp ; mM chacun)</td><td>Roche</td><td>10842321</td><td></td></tr><tr><td>SyBr Green PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4368708</td><td></td></tr><tr><td>Step One Plus Real-Time PCR System</td><td>Life Technologies</td><td>4381792</td><td></td></tr><tr><td>Formalin solution 10 % neutre tamponnée</td><td>Sigma</td><td>HT5012</td><td></td></tr><tr><td>OCT solution</td><td>VWR</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Bleu toluidine O</td><td>VWR</td><td>1.15930.0025</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol absolu</td><td>VWR</td><td>20821.310</td><td></td></tr><tr><td>Toluène</td><td>VWR</td><td>1.08323.1000</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de montage Pertex</td><td>Histolab</td><td>840</td><td></td></tr><tr><td>RPLP0 Amorce pour qPCR</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3' ; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3'Aggrecan</td></tr> <tr><td>Primer pour qPCR</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3' ; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'Collagen</td></tr> <tr><td>II Primer pour qPCR</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3' ; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5'</td></tr></tbody></table>

l&#39;agrégation magnétique de cellules souches 3d et bioréacteurs maturation pour cartilage régénération

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Ingénierie Cartilage reste un défi en raison des difficultés à créer un implant fonctionnel in vitro similaire au tissu natif. Une approche récemment exploré pour le développement de substituts autologues implique la différenciation des cellules souches en chondrocytes. Pour lancer ce chondrogenèse, un degré de compactage des cellules souches est nécessaire; Par conséquent, nous avons démontré la faisabilité de cellules magnétiquement à condensation, à l&#39;intérieur des échafaudages épais et sans échafaudage, en utilisant des sources de champ magnétique miniaturisé attracteurs cellulaires. Cette approche magnétique a également été utilisé pour guider la fusion globale et de construire sans échafaudage, organisé, en trois dimensions (3D) tissus de plusieurs millimètres en taille. En plus d&#39;avoir une taille accrue, le tissu formé par fusion à entraînement magnétique a présenté une augmentation significative de l&#39;expression du collagène II, et on a observé une tendance similaire pour l&#39;expression de l&#39;aggrécane. Comme le cartilage natif a été soumis à des forces tchapeau influencé sa structure 3D, la maturation dynamique a également été réalisée. Un bioréacteur qui fournit des stimuli mécaniques a été utilisé pour la culture des échafauds magnétique ensemencés sur une période de 21 jours. maturation des bioréacteurs largement améliorée chondrogenèse dans les échafauds cellularisées; la matrice extracellulaire obtenue dans ces conditions a été riche en collagène de type II et aggrécane. Ce travail présente le potentiel d&#39;innovation de la condensation magnétique des cellules souches marquées et la maturation dynamique dans un bioréacteur pour une meilleure différenciation chondrogénique, les deux sans échafaudage et à l&#39;intérieur de polysaccharide échafauds.

Tout d&#39; abord, les agrégats peuvent être formés individuellement à l&#39; aide des micro-aimants par dépôt de 2,5 x 10 5 cellules souches marquées (Figure 2A). Ces agrégats individuels (~ 0,8 mm de diamètre) peuvent ensuite être fusionnées dans des structures plus grandes, grâce à la fusion séquentielle, induite magnétiquement. Par exemple, le jour 8 de maturation chondrogénique, les agrégats ont été placés en contact deux à deux pour former des doublets; ...

Chondrogenèse de cellules souches nécessite un réglage fin des conditions de culture. Nous présentons ici une approche magnétique pour les cellules de condensation, une étape essentielle pour initier chondrogenèse. De plus, nous montrons que la maturation dynamique dans un bioréacteur applique une stimulation mécanique aux constructions cellulaires et améliore la production de la matrice extracellulaire cartilagineuse.

L&#39;agrégation magnétique de cellules souches 3D et bioréacteurs Maturation pour Cartilage régénération

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Le but général de cette méthode d'agrégation cellulaire magnétique et de maturation dynamique est d'améliorer la chondrogenèse in vitro des cellules souches mésenchymateuses, ou MSC. L'agrégation magnétique des cellules souches, en remplacement de la condensation cellulaire traditionnelle, constitue une étape clé précoce du processus de régénération du cartilage. Une fois les cellules souches confinées dans des échafaudages, ceux-ci peuvent être transférés dans un bioréacteur cellulaire afin d'évaluer la maturation dynamique des cellules.La méthode dynamique importante peut être appliquée à d'autres biosystèmes, tels que la réparation musculaire, cardiaque ou vasculaire. Mais comme vous le verrez, elle convient particulièrement bien à la régénération du cartilage. La démonstration visuelle du semis cellulaire magnétique et de la maturation cellulaire dynamique à l'aide du bioréacteur réel est essentielle, car ces deux techniques sont difficiles à apprendre uniquement à partir d'instructions textuelles.Pour construire le dispositif à micromagnets destiné à la formation d'agrégats, insérez d'abord une pointe magnétique de 750 micromètres de diamètre dans chaque trou de trois centimèt

3d-magnetic-stem-cell-aggregation-bioreactor-maturation-for-cartilage

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Bioingénierie

Nous avons conçu un nouveau bioréacteur de chargement mécanique qui peut appliquer une contrainte mécanique uniaxiale ou biaxiale à une biocomposites du cartilage avant la transplantation dans un défaut de cartilage articulaire.

Conception d&#39;un bioréacteur de chargement mécanique biaxial pour l&#39;ingénierie tissulaire

Dans ce travail, nous présentons une technique de fabrication rapide de tissus vasculaires vivants par culture directe de collagène, de cellules musculaires lisses et de cellules endothéliales. De plus, un nouveau protocole pour la caractérisation mécanique des tissus vasculaires modifiés est décrit.

Ingénierie 3D cellularisé collagène Gels pour la régénération tissulaire vasculaire

La réparation du cartilage représente un défi médical non relevé et les approches cellulaires pour concevoir le cartilage articulaire humain sont une solution prometteuse. Ici, nous décrivons les hydrogels biomimétiques tridimensionnels (3D) comme un outil idéal pour l’expansion et la maturation des chondrocytes articulaires humains.

3D hydrogel échafaudages pour articulaire chondrocytes Culture and Cartilage Generation

Ici, nous proposons un protocole pour la différenciation chondrogénique des cellules souches pluripotentes induites par les cellules mononucléaires du sang du cordon de l'omble.

Formation de granulés chondrogéniques à partir de cellules souches pluripotentes induites par sang de cordon

Nous présentons ici un protocole afin d’obtenir des systèmes 3D-culture en auto-assemblage peptide échafaudages pour promouvoir la différenciation des chondrocytes articulaires humains dédifférenciées en tissu cartilagineux.

Culture de cellules mammifères dans les échafaudages de Peptide en trois dimensions

Cet article présente un protocole simple et économique pour la simple isolation et la purification de cellules souches mésenchymateuses du liquide synovial de Nouvelle-Zélande lapin blanc.

Cellule magnétique activé tri des stratégies visant à isoler et purifier Synovial fluide mésenchymateuses cellules souches dérivées d’un modèle de lapin

Un système biréacteur de stimulation mécanique uniaxial en trois dimensions est un bioréacteur idéal pour la différenciation ténogénique spécifique des cellules souches dérivées du tendon et de la formation de néo-tendons.

Application d’un système biréacticien uniaxial de stimulation mécanique tridimensionnelle pour induire la différenciation tenogène des cellules souches dérivées du tendon

La thérapie osseuse par ossification endochondrale par implantation de tissu cartilagineux artificiel produit à partir de cellules souches mésenchymateuses a le potentiel de contourner les inconvénients des thérapies conventionnelles. Les hydrogels d’acide hyaluronique sont efficaces pour mettre à l’échelle des greffes de cartilage uniformément différenciées ainsi que pour créer un os intégré avec vascularisation entre les greffons fusionnés in vivo.

Formation osseuse intégrée par ossification endochondrale in vivo à l’aide de cellules souches mésenchymateuses

Cette étude décrit une méthode de production de sphéroïdes chondrocytaires en agrégeant des cellules en sphéroïdes dans des conditions de faible adhésion à l’aide de la gravité, suivie de la culture des sphéroïdes résultants dans des mini-bioréacteurs.

Génération de sphéroïdes à partir de divers chondrocytes à l’aide de conditions à faible adhérence sous gravité et de mini-bioréacteurs faits maison

Les cellules souches périvasculaires (CSP) sont une classe de cellules souches roman pour la régénération tissulaire du squelette similaire aux cellules souches mésenchymateuses (CSM). CSP peuvent être isolés par FACS (fluorescence tri cellulaire activé) à partir de tissu adipeux prélevés lors des procédures de liposuccion standard, puis combiné avec un ostéoinducteur échafaudage pour atteindre la formation...

L&#39;utilisation de cellules souches humaines périvasculaires pour la régénération osseuse

Découvrez l'agrégation magnétique 3D de cellules souches MSC et la maturation en bioréacteur pour améliorer la chondrogenèse in vitro. Cette méthode optimise la régénération cartilagineuse par stimulation mécanique dynamique.

L'agrégation magnétique de cellules souches 3D et bioréacteurs Maturation pour Cartilage régénération

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