Name: Extrusion hydraulique de la moelle épinière et isolement de ganglions rachidiens en Rongeurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Apprenez l'extrusion hydraulique de la moelle épinière et l'isolement des ganglions rachidiens chez les rongeurs. Cette méthode rapide minimise les dommages tissulaires et facilite les analyses neurobiologiques ultérieures.

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Nous tenons à remercier David Kiel, de l’Université d’Aarhus, pour le tournage et le montage. Le logiciel VirtualDub a été utilisé pour le traitement de séquences vidéo de microscope. Nous remercions l’Institut danois de recherche en neurosciences translationnelles (DANDRITE), le partenariat nordique de l’EMBL pour l’accès à l’équipement, ainsi que la Fondation pour la recherche de l’Université d’Aarhus, le projet PAINCAGE du 7FP de l’UE, Det Frie Forskningsrad (DFF) et la Fondation Lundbeck pour le financement.

Tous les animaux ont été traités dans le respect des normes danoises et européennes. Numéro d&#39;autorisation: 2012-15-2934. 1. Préparation de la Seringue pour hydraulique Extrusion de la moelle épinière <ol><li> Pour un rat adulte, utiliser une seringue de 10 ml. Pour une souris adulte, utiliser une seringue de 5 ml. Pour les chiots, utiliser une seringue mL 2.5. </li><li> Régler une pointe de pipette sans filtre universellement adapté pour 2-200 pipettes uL en coupant la grande extrémité de la pointe de la pipette jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit fermement à la seringue. Placez la pointe de la pipette ajustée sur la seringue. Pour les petits, utiliser un 23 G ou une aiguille semblable au lieu d&#39;une pointe de pipette ajustée. </li><li> Aspirer PBS glacé stérile et laisser la seringue sur la glace jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li></ol> 2. euthanasie <ol><li> Ne pas effectuer la dislocation cervicale, car cela va perturber la colonne vertébrale rendant impossible l&#39;extrusion. </li><li> Pour adultes rat / souris, euthanasier en utilisant du gaz comme le CO 2 ou isoflurane. Ces substances sont nuisibles. Effectuer l&#39;euthanasie dans une hotte et à manipuler les substances selon les directives de l&#39;institution. (ATTENTION: CO 2: H280, P410, P403; isoflurane: H361d, P260, P281, P280) <ol><li> Pour veiller à ce que le rongeur est mort, assurer l&#39;absence de réflexe en pinçant une patte avec des pincettes. Décapite les rongeurs en utilisant de grands ciseaux. Pour les chiots, euthanasier par décapitation. </li></ol></li></ol> 3. Isolement de la colonne vertébrale <ol><li> Saupoudrer l&#39;eau sur la fourrure pour contrôler les cheveux. </li><li> En utilisant une paire de ciseaux, ouvrir la fourrure le long de la colonne vertébrale dans une direction distale et à isoler la colonne vertébrale en découpant des deux côtés le long de la colonne vertébrale devant l&#39;os du bassin. Couper la moelle épinière de manière distale à l&#39;os du bassin avec une paire de ciseaux. REMARQUE: L&#39;axe rostral-caudal est désignée par l&#39;axe proximal-distal à travers le protocole. <ol><li> Découper la colonne vertébrale à l&#39;aide d&#39;une paire de ciseaux pour éviter proximal-plus et plus distales domaines que ceux-ci peuvent rendre la colonne vertébrale trop en forme de S pour le succès de l&#39;extrusion de la moelle épinière. Faire en sorte que la moelle épinière est visible aux deux extrémités. Si la moelle épinière est pas visible, couper la colonne vertébrale avec des ciseaux jusqu&#39;à la moelle épinière devient visible. </li></ol></li></ol> 4. hydraulique Extrusion de la moelle épinière <ol><li> Placez une boîte de Pétri (100 mm de diamètre) rempli de PBS stérile sur la glace. </li><li> Redresser la colonne vertébrale par l&#39;application d&#39;un index sur la partie coudée (extrémité la plus proximale) de la colonne vertébrale, ainsi redresser la colonne vertébrale, autant que possible. <ol><li> Pour bébés, d&#39;éviter la flexion de la colonne vertébrale, les vertèbres que sera perturbée rendant spinale extrusion du cordon impossible. </li></ol></li><li> Insérez la pointe de la pipette (23 aiguille G pour chiots, alternativement 18 aiguilles G pour les souris adultes) à l&#39;extrémité la plus distale de la colonne vertébrale. Si correctement inséré, la pointe est stabilisée dans la cavité vertébrale. </li><li> Faire en sorte que la colonne vertébrale est redressée dans la mesure du possible. Appliquer une pression constante, et extruder la moelle épinière dans la boîte de Pétri sur de la glace. Assurez-vous que la moelle épinière est maintenu humide sur la glace en le mettant dans le PBS jusqu&#39;à ce que la manipulation ultérieure. </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig1.jpg" /> Figure 1: moelles épinières représentatifs. Hydrauliquement extrudé moelles épinières. De gauche à droite: rat adulte, souris adulte, chiot de la souris. élargissements lombaires marqués par boîte. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> 5. Identification des ganglions rachidiens (DRG) <ol><li> Divisez la colonne vertébrale en deux parties longitudinales égales à l&#39;aide de ciseaux et placer la colonne vertébrale fendue sous le microscope. </li><li> Identifier le segment T13 vertèbre par<html> localiser le site de fixation de la plus distale costae sur l&#39;attention de payer de la colonne vertébrale de ne pas confondre l&#39;costae avec les nerfs intercostaux à proximité. Les plus distales costae sont fixés à la partie proximale du segment de vertèbre T13 et T13 DRG est situé de manière distale à la vertèbre T13 et proximalement à la vertèbre L1. </li><li> Identifier DRG concomitants dans la direction distale. Pour un rat adulte, DRG concomitants apparaissent en blanc avec dorsale bien visible et les racines ventrales. Pour une souris adulte, DRG concomitants apparaissent en blanc avec dorsale bien visible et les racines ventrales. Pour les chiots, les DRG concomitants apparaissent comme des sphères claires. </li></ol><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig2.jpg" /> Figure 2: Identification des DRG dans la colonne vertébrale après extrusion de la moelle épinière. La colonne vertébrale a été divisé en permettant la visualisation des DRG comme indiqué par des flèches. Exemplifié par rat adulte et chiot de la souris.<html> ref = cible &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg&quot; = &quot;_ blank&quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 6. Isolation des DRG <ol><li> Plats nombre de Petri (30 mm de diamètre) en fonction des DRG spécifiques qui doivent être isolés, par exemple , L3, L4, L5. Remplissez les boîtes de Pétri avec de la glace froide PBS stérile et placez-les sur la glace. </li><li> Utilisation de micro ciseaux, couper dorsale et ventrale racines au plus près des DRG que possible pour les libérer, tout en évitant d&#39;endommager les DRG. </li><li> Avec la pointe de pinces fermées, évider délicatement DRG et les transférer vers les boîtes de Pétri numérotés correspondants. </li></ol><img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig3.jpg" /> Figure 3: Représentant isolé DRG. De gauche à droite: rat adulte, souris adulte, chiot de la souris.&quot;_blank&quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 7. Traitement des tissus pour une analyse ultérieure <ol><li> transfert de western <ol><li> Isoler la zone de tissu d&#39;intérêt, par exemple , l&#39;élargissement de la moelle épinière lombaire. Si nécessaire, séparer la moelle épinière dans les côtés ipsilatéraux et controlatéraux et plus loin dans dorsale et des cornes ventrales. </li><li> Placer le tissu dans un tampon de lyse tel que le tampon TNE de lyse (10 mM Tris-base, 150 mM de NaCl, 1 mM d&#39; EDTA, 1% de NP40 dans bidistillée H 2 O) contenant des inhibiteurs d&#39;enzymes appropriées sur la glace. </li><li> Homogénéiser le tissu pendant environ 30 s sur la glace à l&#39;aide d&#39;un broyage mécanique pilon. </li><li> Centrifuger pendant 15 min à 16 000 xg à 4 ° C et utiliser le surnageant pour un traitement ultérieur selon des protocoles standards 5, 6 ou conserver le surnageant à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li></ol></li><li> L&#39;ARN-analyse <ol><li> Isoler le tissu d&#39;intérêt. </li><li> Placer immédiatement le tissu dans une solution de stabilisation de l&#39;ARN pour stabiliser l&#39;ARN pour le stockage. </li><li> Isoler l&#39; ARN selon des protocoles standards 7. </li><li> Convertir l&#39; ARN en ADNc et effectuer qPCR selon des protocoles standards 7. </li></ol></li><li> immunohistochimie <ol><li> Pour les tissus frais congelé (applicable à la moelle épinière): <ol><li> Préparer la poudre de glace sèche par pulvérisation cubes de glace sèche à un montant correspondant à deux cuillères à soupe de poudre. Couvrir cubes de glace sèche dans un linge et pulvériser les cubes à l&#39;aide d&#39;un marteau. Placez une feuille d&#39;argent (environ 5 cm x 5 cm) sur une couche de cubes de glace sèche et couvrir la feuille d&#39;argent avec de la poudre de glace sèche. </li><li> Placez la zone de la moelle épinière sélectionnée pour d&#39;autres analyses sur la poudre de glace sèche en utilisant des pinces, laissez-le composant logiciel enfichable gel, et le transfert de la moelle épinière à un tube de cryo. Gardez-le sur la glace sèche en tout temps ou le stocker à -80 ° C jusqu&#39;à ce que nous poursuivree. </li><li> Transférer la moelle épinière à un cryostat (-20 ° C). Si nécessaire, couper la moelle épinière à l&#39;intérieur du cryostat. Placer la moelle épinière dans le matériau d&#39;enrobage à l&#39;intérieur du cryostat afin de le fixer sur le disque de spécimen. </li><li> Couper la moelle épinière dans l&#39;épaisseur désirée, par exemple 5 um, et de recueillir sur les plaques de verre. Chauffer les plaques de verre avec un doigt immédiatement avant le prélèvement de tissus pour une meilleure fixation. Gardez tout tissu restant dans des tubes cryogéniques à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li><li> Laissez les sections sur des plaques de verre à l&#39;intérieur du cryostat jusqu&#39;au moment de post-fixation. </li><li> Post fixer les sections par immersion dans 4% de PFA pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Effectuer la coloration selon des protocoles standard 8. </li></ol></li><li> tissu fixe pour cryo tronçonnage (applicable à la moelle épinière et DRG) <ol><li> Fixer la moelle épinière et DRG dans 4% PFA (2 h pour la moelle épinière, 1,5 h pour DRG de souris et 4 h pour DRG de rat) à4 ° C (lieu de la moelle épinière en position horizontale pour l&#39;empêcher de fixation dans une position courbée). </li><li> Transférer le tissu à 25% en poids / volume de saccharose pendant une nuit à 4 ° C. Le tissu peut être conservé dans 25% p / v de saccharose additionnée de quelques gouttes d&#39;azoture de sodium à 10% pour éviter une contamination microbienne à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. Si nécessaire, couper la moelle épinière pour compenser l&#39;élargissement lombaire seulement sur une planche de silicone ou similaire. </li><li> Avec la pointe d&#39;une serviette en papier, aspirez solution de saccharose en excès du tissu. </li><li> Remplir un moule à mi-chemin de cryo avec matériau d&#39;enrobage. Poussez les bulles sur les côtés du moule de cryo avec des outils tels que des pinces fermées. </li><li> Placer le tissu sur le matériau d&#39;enrobage en utilisant une pince à épiler et d&#39;assurer l&#39;orientation tissulaire souhaitée. </li><li> Remplissez le moule cryo complètement avec le matériau d&#39; enrobage et de pousser les bulles aussi loin du tissu que possible (par exemple en utilisant des pinces fermées). </li><li> Remplir une boîte de Pétri (100 mmde diamètre) avec le 2-méthylbutane. Cette substance est nocive. Effectuez cette étape dans une hotte et à manipuler la substance selon les directives de l&#39;institution (ATTENTION: H224, H304, H336, H411, P210, P280, P273, P301, P331, P304 / P340, P309 / P310). </li><li> Placez la boîte de Pétri sur une couche de glace sèche et ajouter deux cubes de glace sèche à la boîte de Pétri. Placer le moule cryo dans la boîte de Petri et laisser le matériau d&#39;enrobage pour congeler complètement. </li><li> Gardez le tissu embarqué sur la glace sèche à tout moment ou à -80 ° C enveloppé dans Parafilm jusqu&#39;au traitement. </li><li> Couper le tissu sur un cryostat (-20 ° C) dans l&#39;épaisseur désirée, par exemple 5 um. </li><li> Effectuer la coloration selon des protocoles standard 8. </li></ol></li><li> tissu fixe pour la paraffine-plongement (applicable à la moelle épinière et DRG) <ol><li> Fixer la moelle épinière et DRG dans 4% PFA (2 h pour la moelle épinière, 1,5 h pour DRG de souris et 4 h pour DRG de rat) à 4 ° C (lieu de la moelle épinièreen position horizontale pour l&#39;empêcher de fixation dans une position pliée). </li><li> Transférer le tissu à 25% en poids / volume de saccharose pendant une nuit à 4 ° C. Le tissu peut être conservé dans 25% p / v de saccharose additionnée de quelques gouttes d&#39;azoture de sodium à 10% pour éviter une contamination microbienne à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li><li> Isoler la zone de tissu d&#39;intérêt, par exemple , l&#39;élargissement de la moelle épinière lombaire. </li><li> Remplir un moule à mi-chemin de l&#39;intégration avec de la paraffine. </li><li> Refroidir le moule brièvement enrobage en le plaçant sur la zone de refroidissement de la machine d&#39;enrobage à durcir légèrement la paraffine. Cela permet un meilleur positionnement des tissus. </li><li> Placer le tissu dans l&#39;orientation souhaitée dans le moule d&#39;enrobage. Remplir le moule enrobage avec de la paraffine et refroidir immédiatement. </li><li> Placer le moule enrobage contenant la paraffine à 4 ° C pendant la nuit pour laisser durcir complètement et retirer le bloc de paraffine contenant le tissu du moule enrobage. </li><li> sections Cut ona microtome dans l&#39;épaisseur désirée, par exemple 5 um. </li><li> Effectuer la coloration selon des protocoles standard 8. </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Si la colonne vertébrale est perturbée, par exemple par dislocation cervicale, la moelle épinière se divisera lors de l&#39; extrusion. Si la moelle épinière ne peut être extrudé, la colonne vertébrale peut être ajustée légèrement aux deux extrémités et la tentative d&#39;extrusion peut être répétée. Dans le cas de la moelle épinière entière est nécessaire pour une analyse plus poussée, soit constitué par l&#39;élargissement du col, ainsi que l&#39;élargissement lombaire de la colonne vertébrale ne doit être coupée légèrement. Si seulement l&#39;élargissement lombaire est nécessaire pour une analyse plus poussée, la moelle épinière doit être coupée selon le protocole actuel. La colonne vertébrale doit être redressé en utilisant le bout des doigts pour faciliter l&#39;extrusion. Le protocole est applicable aux rongeurs de tous âges et est ici illustrée par une souris adulte (8 semaines), un chiot de la souris (5 jours) et un rat adulte (10 semaines). Selon le type et la souche animale, le nombre de sections thoraciques et lombaires peut varier 9, </sup&gt; 10, 11. En fonction des protéines à analyser, rongeurs adultes peuvent être perfuses avec des solutions enzymatiques d&#39;inhibition avant l&#39;euthanasie. Si l&#39;exécution d&#39;une expérience impliquant une lésion nerveuse unilatérale, la moelle épinière peut être divisée en côtés ipsilatéraux et controlatéraux à l&#39;aide des pinces ultra-fines immédiatement après extrusion. De plus, chaque côté peut être divisée en côtés dorsal et ventral. Le tissu peut ensuite être traité pour d&#39; autres analyses, par exemple Western blot. Transcardial perfusion fixation avec PFA avant l&#39;extrusion du cordon spinal doit être évité, car cela rend la moelle épinière non flexible et empêche l&#39;extrusion de la moelle épinière hydraulique. Hydraulique extrusion de la moelle épinière se déchirer les racines dorsales. Pour les expériences où les racines dorsales attachées sont nécessaires, laminectomie est recommandé. En outre, la colonne vertébrale sont perdus meninges par extrusion hydraulique, qui peut être évité par laminectomie norme extrusion hydraulique de la moelle épinière et DRG isolement peut également être effectuée en utilisant un fluide cérébrospinal artificiel oxygéné (ACSF) au lieu de PBS glacé. L&#39;utilisation de l&#39; ACSF permet la préservation du tissu isolé dans un meilleur environnement physiologique, ce qui est particulièrement important dans le cas des enregistrements ultérieurs électrophysiologiques 12, 13. Une alternative à l&#39; ACSF pourrait être PBS contenant 1 g / L de glucose pour la production des cultures primaires de DRG 14. extrusion hydraulique de la moelle épinière est une méthode nettement plus rapide que la méthode traditionnelle d&#39;isolement de la moelle épinière par laminectomie, ce qui réduit le temps de manipulation des tissus et diminue donc le risque de détérioration des protéines. Perfusion avec un fixatif avant d&#39;isoler la moelle épinière par laminectomie peut réduire le risque de lésions des tissus lors de la dissection et pendant le retrait final de lala moelle épinière de la colonne vertébrale. Toutefois, la fixation du tissu empêche son application à des analyses telles que Western blot. Hydrauliques rendements d&#39;extrusion structurellement des tissus intacts 3 adapté à une plus large gamme d&#39;analyses. identification cohérente des DRG peut être difficile. Cependant, cela est essentiel pour l&#39; analyse des tissus, par exemple suite à une lésion du nerf sciatique. En numérotant les DRG selon leur localisation par rapport à la costae, DRG peut être identifié de manière cohérente. Coloration des tissus de la moelle épinière, ainsi que des DRG peut être optimisée en effectuant les variations de traitement des tissus illustrés décrits dans le protocole étape 7.

L&#39;objectif global de cette méthode est d&#39;isoler la moelle épinière, ainsi que pour identifier et isoler les DRG 1, 2. Extrusion hydraulique de la moelle épinière est une méthode nettement plus rapide que la méthode traditionnelle d&#39;isolement de la moelle épinière par laminectomie, soit par rupture de la colonne vertébrale une à la fois, et ce procédé réduit le risque de dommages aux tissus causés par le processus de dissection 3, 4 . DRG peut être difficile à identifier. L&#39; identification correcte est très importante pour l&#39; analyse des tissus, par exemple suite à une lésion du nerf sciatique. En numérotant les DRG selon leur localisation par rapport à la costae, DRG peut être identifié de manière cohérente. Tissue isolé par les techniques démontrées ici peut être appliquée à un large éventail d&#39;analyses , y compris Western blot 5,6, 7 qPCR et la coloration immunohistochimique 8. Lors de l&#39; identification DRG, il est important de tenir compte du fait que le nombre de segments de la moelle épinière est connu pour varier avec le type et la souche 9, 10, 11 animaux. Les avantages dans l&#39;exécution de cette méthode chez la souris sont le nombre élevé de variantes génétiquement modifiées disponibles et les dépenses relativement faibles en matière de logement. Les avantages de l&#39;utilisation des rats sont le rendement relativement élevé des tissus et si les blessures impliquant nerveuses, la procédure seront assouplies avec la taille.

<table><tbody><tr><td>Ciseaux de Bonn, extra fins, droits, 8,5 cm</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 14084-08</td><td>Pour ouvrir la moelle épinière avant l’isolement des DRG (souris adulte, rat adulte) ; Un autre fabricant peut être utilisé</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td># 5427 R</td><td>Pour la centrifugation de tissus homogénéisés</td></tr><tr><td>Microtome cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td># CM 3050 S</td><td>Pour couper le tissu intégré avant la coloration ; D’autres modèles et fabricants peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Forceps, Dumont, # 3</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 11231-30</td><td>Pour la manipulation de la moelle épinière après extrusion ; D’autres fabricants/types peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Forceps, Dumont, # 5</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 11252-20</td><td>Pour l’isolement des DRG (souris adulte, rat adulte, chiot) ; Un autre fabricant peut être utilisé</td></tr><tr><td>Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100 %</td> <td>Abbott</td><td># 002185</td><td>Pour l’euthanasie ; Un autre fabricant peut être utilisé ; ATTENTION :</td></tr><tr><td>toxique Iso-pentane GPR rectapur</td><td>VWR produits chimiques</td> <td># 24872.298</td><td>Pour la congélation instantanée des tissus ; Un autre fabricant peut être utilisé ; ATTENTION :</td></tr><tr><td>Microtome</td> toxique <td>Leica Biosystems</td><td># RM 2155</td><td>Pour la section des tissus inclus dans la paraffine ; D’autres modèles et fabricants peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Pastilles de cire de paraffine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 76243</td><td>Pour l’enrobage de paraffine ; Un autre fabricant peut être utilisé</td></tr><tr><td>Station d’enrobage de tissu de paraffine</td><td>Leica Biosystems</td><td># EG1160</td><td>Pour l’enrobage de paraffine de tissu pour une section ultérieure ; D’autres modèles et fabricants peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Pellet pestel, moteur sans fil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># Z359971-1EA</td><td>Pour l’homogénéisation mécanique des tissus isolés avant le Western blot ; Un autre fabricant peut être utilisé</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri, 35 mm</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td># 121V</td><td>Pour le stockage de DRG isolés ; D’autres fabricants et tailles peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri, 100 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># P7741</td><td>Pour l’extrusion de la moelle épinière ; D’autres fabricants et tailles peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Inhibiteur de phosphatase, Phosstop</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 04906845001</td><td>cocktail d’inhibiteurs de phosphatase pour l’ajout au tampon de lyse TNE si nécessaire ; Un autre fabricant peut être utilisé</td></tr><tr><td>Pointe de pipette, 1-200 &mu ; L, sans filtre</td><td>Sarstedt</td><td># 70.1189.105</td><td>Pour l’extrusion hydraulique ; Un autre fabricant peut être utilisé</td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase, Complete</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 05892791001</td><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase à ajouter au tampon de lyse TNE si nécessaire ; Un autre fabricant peut être utilisé</td></tr><tr><td>solution RNAlater</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># R0901</td><td>Pour la stabilisation de l’ARN pour le stockage ; Un autre fabricant peut être utilisé</td></tr><tr><td>Rneasy Protect Mini KiT</td><td>Qiagen</td><td># 74124</td><td>Pour l’isolement de l’ARN ; Un autre fabricant peut être utilisé</td></tr><tr><td>Scalpel ; Lame chirurgicale Swann-Morton n° 11</td><td>Swann-Morton</td><td># REF0203</td><td>Pour l’isolement de la région lombaire de la moelle épinière ; D’autres fabricants/types peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Ciseaux, droits, type 3, bord de coupe de 25 mm</td><td>Bochem</td><td># 4070</td><td>Pour l’isolation de la colonne vertébrale ; D’autres fabricants/types peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Ciseaux, tranchant de 130 mm</td><td>Hounisen</td><td># 1902.0130</td><td>Pour l’isolation de la moelle épinière (rat adulte)</td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort, droits, tranchant de 8 mm</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 15009-08</td><td>Pour ouvrir la colonne vertébrale avant l’isolement des DRG (chiot) et pour l’isolement des DRG (souris adulte, rat adulte, chiot) ; Un autre fabricant peut être utilisé</td></tr><tr><td>Seringues standard, 2,5 mL, 5 mL, 10 mL</td><td>Terumo</td> <td># SS02SE1 ; # SS05SE1 ; # SS10SE1</td><td>Pour l’extrusion hydraulique ; Un autre fabricant peut être utilisé</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope MZ12.5 avec objectif 1X et oculaire 10X</td><td>Leica</td><td># 10446370</td><td>Un autre fabricant/type peut être utilisé</td></tr><tr><td>Stérile PBS</td><td>GIBCO</td><td># 10010-015</td><td>Pour l’extrusion hydraulique ; Peut également être fabriqué selon les protocoles standard</td></tr><tr><td>Aiguille de seringue 23 G x 1", 0,6 x 25 mm</td><td>Terumo Neolus</td><td># NN-2325R</td><td>Pour l’extrusion hydraulique chez les chiots ; D’autres fabricants/types peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Aiguille de seringue 18 G x 1 1/2, 1,2 x 40 mm</td><td>Terumo Neolus</td><td># NN-1838S</td><td>Alternative à l’embout de pipette pour l’extrusion hydraulique chez les souris adultes ; Un autre fabricant peut être utilisé</td></tr><tr><td>Tissue-Tek</td><td>Sakura</td><td># 4583</td><td>Matériau d’enrobage Tssue pour la cryosection ultérieure</td></tr><tr><td>Tampon de lyse TNE</td><td>Produits chimiques VWR</td> <td># 10128-582</td><td>Pour la lyse tissulaire avant le transfert Western ; Un autre fabricant peut être utilisé ; Peut également être fabriqué selon des protocoles standard</td></tr></tbody></table>

extrusion hydraulique de la moelle épinière et isolement de ganglions rachidiens en rongeurs

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Traditionnellement, la moelle épinière est isolée par laminectomie, c’est-à-dire en brisant les vertèbres vertébrales une par une. Cela prend du temps et peut entraîner des dommages à la moelle épinière causés par le processus de dissection. Ici, nous montrons comment la moelle épinière peut être extrudée à l’aide de la pression hydraulique. Le temps de manipulation est considérablement réduit à seulement quelques minutes, ce qui diminue probablement les dommages causés aux protéines. Le faible risque de lésions du tissu de la moelle épinière améliore l’analyse immunohistochimique ultérieure. En effectuant une extrusion hydraulique de la moelle épinière au lieu de la laminectomie traditionnelle, les rongeurs peuvent être utilisés pour l’isolement des DRG, réduisant ainsi le nombre d’animaux et permettant l’analyse des tissus d’un même rongeur. Nous démontrons une méthode cohérente pour identifier et isoler les DRG en fonction de leur localisation par rapport aux côtes. Il est toutefois important d’adapter cette méthode à l’animal utilisé, car le nombre de segments de la moelle épinière, tant thoracique que lombaire, peut varier selon le type d’animal et la souche. En outre, nous illustrons d’autres exemples de traitement des tissus isolés.

Moelles épinières hydrauliquement extrudés présentent une surface lisse en bon état représenté sur la figure 1. Renflement lombaire peut être facilement identifiée comme étant la zone épaissie de la moelle épinière, encadré sur la figure 1. Les faces ventrale et dorsale de la moelle épinière peuvent être identifiés à l&#39;oeil en fonction de la morphologie. Dans la figure 1, la face ventrale est en face du spectateur, identifiable par une ligne médiane claire le long de la moelle épinière entière. Deux lignes plus larges le long de la moelle épinière permettent l&#39;identification de la face dorsale. A l&#39;extrémité la plus distale, la queue de cheval peut parfois rester attaché chez des rats adultes et des souris adultes. Les DRG individuels ne peuvent être identifiées alors qu&#39;elle se trouvait dans la colonne vertébrale, la figure 2. Après l&#39; isolement, la figure 3, les différents DRG ne peuvent être identifiés par l&#39; apparence. Si nécessaire, il est par conséquentimportant de les garder clairement séparés sur l&#39;isolement. Après isolement, la moelle épinière et les DRG peuvent être traitées et colorées comme décrit dans l&#39; étape 7.3 et représenté sur la figure 4. La figure 4a montre une coloration immunohistochimique d&#39;une section de DRG où les neurones et les cellules gliales de leurs satellites entourant sont clairement visibles. Par identification correcte de la DRG, il est possible d&#39;analyser l&#39;effet des lésions du nerf sciatique sur le soma du neurone blessé, ainsi que sur leurs cellules gliales satellite environnantes. La figure 4b montre une coloration de Nissl d&#39;une moelle épinière hydraulique extrudé où le tissu est intacte comme en témoignent les bords lisses de la section. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig4.jpg" /> Figure 4: coupes de tissus représentatifs. A. La coloration immunohistochimique de l&#39;article DRG. B. Nissl teinté section de la moelle épinière hydrauliquement extrudée. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Ici, nous présentons un protocole pour l’extrusion hydraulique de la moelle épinière ainsi que l’identification et l’isolement de ganglions spécifiques de la racine dorsale (DRG) chez le même rongeur. Par rapport aux méthodes standard d’isolement de la moelle épinière, cette méthode est nettement plus rapide et réduit le risque de lésions tissulaires.

Extrusion hydraulique de la moelle épinière et isolement de ganglions rachidiens en Rongeurs

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

L'objectif général de cette méthode est d'isoler la moelle épinière par extrusion hydraulique ainsi que d'identifier et d'isoler les ganglions rachidiens dorsaux chez la souris et le rat. Cela est réalisé en euthanasiant d'abord le rongeur, puis en procédant à la décapitation. La peau est incisée le long de la colonne vertébrale et séparée des tissus sous-jacents.Ensuite, la colonne vertébrale est séparée des tissus environnants en effectuant des incisions de chaque côté de la colonne vertébrale dans la direction distale, au-delà de l'os pelvien. Puis, la colonne vertébrale est sectionnée en dessous de l'os pelvien. Une seringue munie d'une pointe de pipette adaptée est insérée à l'extrémité la plus distale de la moelle épinière.En appliquant une pression constante, la moelle épinière est expulsée dans la boîte de Pétri placée sur de la glace à l’aide de PBS stérile glacé. À l’aide de ciseaux à ressort, la colonne vertébrale est sectionnée longitudinalement. Ensuite, les sites d’insertion de la côte la plus distale sont localisés.Cela permet d'identifier les ganglions rachidiens thoraciques les plus distaux de chaque côté, désignés T13. Les ganglions rachidiens suivants peuvent désormais être identifiés. Les ganglions rachidiens correspondant à l'épaississement médullaire lombaire sont situés de façon distale.À l’aide de ciseaux à ressort, les racines dorsales et ventrales sont coupées et les ganglions rachidiens sont délicatement prélevés de la cavité et transférés dans des boîtes de Pétri étiquetées contenant du PBS stérile sur de la glace. L’extrusion hydraulique de la moelle épinière est une méthode nettement plus rapide que la laminectomie traditionnelle, où les vertèbres sont fracturées une par une. Cette méthode réduit le risque de dommages tissulaires causés par le processus de dissection et fournit un tissu adapté à un large éventail d’analyses.Les ganglions de la racine dorsale peuvent généralement être difficiles à identifier. Toutefois, une identification correcte est très importante pour l'analyse ultérieure du tissu, par exemple après une lésion du nerf sciatique. Ainsi, en numérotant les ganglions de la racine dorsale selon leur localisation par rapport à la côte, ces ganglions peuvent être identifiés de manière cohérente.Préparez une seringue pour l'extrusion de la moelle épinière en coupant l'extrémité large d'une pointe de pipette non filtrée. La pointe s'ajustera fermement lorsqu'elle sera correctement positionnée. Aspirez du PBS stérile glacé et laissez la seringue sur de la glace jusqu'à utilisation ultérieure.Pour les rongeurs adultes, pratiquer l'euthanasie à l'aide d'un gaz tel que le CO2 ou l'isoflurane, suivie d'une décapitation. Ne pas effectuer une dislocation cervicale, car cela perturberait les vertèbres spinales et rendrait l'extraction de la moelle épinière impossible. Les jeunes animaux peuvent être euthanasiés par décapitation directe.Saupoudrez de l'eau sur le pelage pour en contrôler les poils. Ensuite, incisez le pelage le long de la colonne vertébrale en direction distale. Isolez la colonne vertébrale en effectuant des coupes de chaque côté le long de la colonne, au-delà de l'os pelvien, puis sectionnez la colonne vertébrale en position proximale par rapport au pelvis.Recoupez la colonne vertébrale afin d'éviter les régions les plus proximales et les plus distales, car celles-ci pourraient rendre la colonne vertébrale trop en forme de S, empêchant ainsi une extrusion réussie de la moelle épinière. Assurez-vous que la moelle épinière soit visible aux deux extrémités. Si la moelle épinière n'est pas visible, recoupez la colonne vertébrale jusqu'à ce que la moelle épinière devienne visible.Placer une boîte de Pétri contenant du PBS sur de la glace. Redresser la colonne vertébrale en apposant l'index sur la partie courbée à l'extrémité proximale de la colonne vertébrale. Insérer la pointe de pipette à l'extrémité distale de la moelle épinière.Appliquez une pression constante et extrudez la moelle épinière dans la boîte de Pétri. Ouvrez la colonne vertébrale. Coupez quelques vertèbres du côté ventral de la colonne, puis passez à la coupe de quelques vertèbres du côté dorsal.Continuer à alterner les côtés tout au long de la colonne vertébrale. Placer la moelle épinière découverte sous un microscope. Identifier le segment de la vertèbre T13 en localisant le site d'insertion de la côte la plus distale dans la colonne vertébrale.Veillez à ne pas confondre la côte la plus distale avec les nerfs intercostaux voisins. La côte la plus distale est attachée à la partie proximale du segment de la vertèbre T13, et les ganglions rachidiens T13 sont situés en position distale par rapport à la vertèbre T13 et en position proximale par rapport à la vertèbre L1. Identifiez les ganglions rachidiens concomitants en direction distale. Préparez des boîtes de Pétri numérotées contenant du PBS stérile glacé sur de la glace. Pour éviter d'endommager le ganglion rachidien (DRG) lors de son prélèvement, saisissez les racines dorsale et ventrale plutôt que le DRG lui-même à l'aide d'une pince n°5. À l'aide de ciseaux microchirurgicaux, sectionnez d'abord le nerf périphérique, puis les racines dorsale et ventrale. Chez les jeunes animaux, ces nerfs sont moins visibles que chez les rongeurs adultes.Afin de couper les nerfs le plus près possible du ganglion de la racine dorsale (DRG), laissez doucement la pointe des ciseaux glisser le long du DRG pour positionner correctement la pointe avant d'effectuer la coupe. À l’aide de la pointe de pinces fermées, prélevez délicatement les DRG et transférez-les dans la boîte de Pétri correspondante. Chez les rats adultes et les souris adultes, les DRG sont blancs et présentent des racines dorsale et ventrale clairement visibles, tandis que chez les jeunes animaux, les DRG apparaissent comme des sphères transparentes.Pour le transfert Western, isoler le tissu d'intérêt et placer le tissu dans un tampon de lyse. Ensuite, homogénéiser le tissu, centrifuger, récupérer le surnageant et réaliser le transfert Western selon les protocoles standards. Pour l'analyse de l'ARN, isoler le tissu d'intérêt et placer immédiatement le tissu dans une solution de stabilisation de l'ARN.Ensuite, réalisez une qPCR selon les protocoles standards. Pour l'immunohistochimie sur tissu congelé instantanément, préparez de la poudre de glace sèche sur un morceau de papier d’aluminium. Placez le tissu sur la poudre de glace sèche pour le congeler instantanément.Ensuite, transférez le tissu dans un cryostat et incluez le tissu pour la découpe. Post-fixez le tissu dans du PFA à 4 % pendant 10 minutes à température ambiante et effectuez la coloration immunohistochimique selon les protocoles standards. Pour l'immunohistochimie sur coupes congelées, fixez le tissu dans du PFA à 4 % à quatre degrés Celsius et transférez le tissu dans une solution de saccharose à 25 % poids par volume pendant la nuit à quatre degrés Celsius.Placer le tissu dans un milieu d'inclusion et congeler le tissu à l'aide de 2-méthylbutane refroidi. Couper le tissu au cryostat et réaliser une coloration immunohistochimique selon des protocoles standards. Pour l'immunohistochimie sur sections paraffinées, fixer le tissu dans du PFA 4 % à quatre degrés et transférer le tissu dans du saccharose 25 % poids par volume pendant la nuit à quatre degrés.Incorporez le tissu dans de la paraffine, sectionnez le tissu au microtome et effectuez une coloration immunohistochimique selon des protocoles standard. Selon les anticorps utilisés pour la coloration immunohistochimique, l'une ou l'autre des méthodes de traitement des tissus présentées peut s'avérer applicable. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler la moelle épinière par extrusion hydraulique et de la façon d'identifier et d'isoler les ganglions de la racine dorsale de manière reproductible.Les méthodes présentées ici s'appliquent aux souris et aux rats de tous âges, et le tissu isolé peut être utilisé pour un large éventail d'analyses, y compris des méthodes nécessitant une isolation rapide de tissu non fixé.

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Étude génétique de la régénération des axones avec cultivées adultes dorsaux neurones ganglion de la racine

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Récolte de DRG à partir de la colonne vertébrale du rat : une procédure pour extraire le ganglion de la racine dorsale de la colonne vertébrale d’un modèle de rat

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Isolement de cellules progénitrices souches neurales de la région périventriculaire de la moelle épinière d’un rat adulte

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Etablissement d’une culture cellulaire de ganglions de la racine dorsale primaire à partir d’une colonne vertébrale de rat

La moelle épinière de mammifère adulte contient des cellules souches neurales/progénitrices (NSPC) qui peuvent être isolées et développées en culture. Ce protocole décrit le prélèvement, l’isolement, la culture et le passage de NSPC générés à partir de la région périventriculaire de la moelle épinière adulte à partir de rats et de donneurs d’organes humains.

Isolement de neurones cellules souches / progénitrices de la région périventriculaire du Rat des adultes et de la moelle épinière humaine

Ce protocole décrit l’isolement des neurones du ganglion de la racine dorsale (DRG) isolés de rats et la culture de neurones DRG sur un système de culture cellulaire statique pré-étiré pour améliorer l’alignement axonal, avec co-culture ultérieure de cellules de Schwann (SC) pour favoriser la myélinisation.

Une approche pour améliorer l&#39;alignement et myélinisation de ganglion de racine dorsale Neurones

Ce protocole présente l’utilisation d’une injection de ganglion de la racine dorsale (DRG) avec un vecteur viral et d’une lésion concomitante par écrasement de la racine dorsale chez un rat adulte comme modèle pour étudier la régénération sensorielle des axones. Ce modèle convient à l’étude de l’utilisation de la thérapie génique pour favoriser la régénération sensorielle des axones.

Racine Dorsale Ganglion Injection et Racine Dorsale Crush blessures comme modèle pour la régénération sensorielle Axon

Ce protocole fournit une technique pour récolter et cultiver le ganglion de la racine dorsale (DRG) explanté de rats Sprague Dawley adultes dans un dispositif à compartiments multiples (MC).

Récolte, intégration et culture de ganglions de la racine dorsale dans des dispositifs à compartiments multiples pour étudier les caractéristiques neuronales périphériques

Les ganglions de la racine dorsale (DRG) contiennent des corps cellulaires neuronaux sensoriels primaires et transmettent des signaux sensoriels périphériques à la moelle épinière. Ce protocole décrit une méthode de dissection de la DRG chez la souris qui soutient l’isolation standardisée des ganglions structurellement intacts, l’identification segmentaire anatomique, un accompagnement intuitif pour les utilisateurs débutants et une réduction des lésions tissulaires procédurales.

Dissection et isolement des ganglions dorsals de la souris

Apprenez l'extrusion hydraulique de la moelle épinière et l'isolement des ganglions rachidiens chez les rongeurs. Cette méthode rapide minimise les dommages tissulaires et facilite les analyses neurobiologiques ultérieures.

Extrusion hydraulique de la moelle épinière et isolement de ganglions rachidiens en Rongeurs

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