Quantification du comportement de toilettage de la drosophile

L'objectif général de cette méthode est de mesurer le comportement de toilette de Drosophila en quantifiant et en comparant le résidu de colorant jaune brillant sur le corps des animaux dans des conditions toilettées et non toilettées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie et de la génétique du comportement, telles que la coordination des habiletés locomotrices fines et les régulateurs moléculaires et circuits associés. Le principal avantage de cette technique réside dans sa rapidité, sa robustesse et sa facilité de mise en œuvre par de nombreux expérimentateurs et étudiants ayant différents niveaux de compétence.

Frankie Barradale, un élève de mon laboratoire, démontrera cette procédure. Pour commencer l'expérience, préparez un aspirateur afin de transférer des Drosophiles vivantes d'un flacon de culture vers la chambre de toilette. À l'aide de ciseaux, coupez 1,5 pied de tube en Tygon.

Coupez au moins un centimètre de l'extrémité d'une pipette jetable d'un millilitre et maintenez le morceau carré de treillis de un centimètre de côté au-dessus de l'ouverture de la pipette coupée. Placez fermement une pipette neuve d'un millilitre par-dessus le treillis et l'extrémité coupée afin de créer une chambre de contention pour les mouches. Coupez l'extrémité très fine de la nouvelle pipette pour élargir suffisamment l'ouverture et permettre le passage d'une seule mouche.

Le trou correspondra approximativement à l'ouverture de la chambre de toilettage. Insérez fermement les embouts emboîtés à l'extrémité du tube en Tygon. Enfoncez les embouts dans le tube afin d'assurer un ajustement étanche permettant la création d'une pression sous vide.

À l'autre extrémité du tube, coupez l'extrémité d'une pipette de 200 microlitres et insérez l'extrémité étroite coupée dans le tube afin de former le côté buccal de l'aspirateur. Pour préparer les tubes contenant des aliquotes de poudre, pesez cinq milligrammes de colorant jaune brillant sur du papier de pesée. Versez la poudre dans un tube micro-centrifuge de 8 millilitres et refermez hermétiquement le bouchon.

Ensuite, pour préparer les tubes d'éthanol, pipeter un millilitre d'éthanol à 100 % dans des tubes micro-centrifuge de 15 millilitres. Étiqueter les tubes, les boucher et conserver les tubes d'éthanol jusqu'à la fin du test de toilette. Inclure également au moins un échantillon témoin contenant uniquement un millilitre d'éthanol sans mouche, pour les contrôles négatifs.

Assembler chaque chambre de toilette en vissant la plaque supérieure coulissante munie des petits trous, tout en laissant la plaque inférieure avec les trous plus grands retirée pour permettre l'ajout de la poussière. Placer chaque chambre de toilette nécessaire à plat sur une table, la face supérieure vers le bas. Introduire cinq milligrammes d'aliquot de colorant jaune brillant dans chaque chambre en tapotant le tube contre la surface de la chambre au-dessus du puits souhaité.

Tapotez la chambre contre la table pour vous assurer que toutes les poussières tombent à travers le maillage jusqu'au sommet de la plaque. Ensuite, vissez la plaque inférieure sur chaque chambre, de sorte que les extrémités les plus larges des ouvertures coniques soient orientées vers l'extérieur et que les trous ne se trouvent pas au-dessus des puits. Fixez fermement la plaque inférieure afin qu'elle ne glisse pas et ne libère pas de colorant.

Retournez la chambre et tapez-la plusieurs fois contre la table afin que la poussière passe à travers le maillage et s'accumule sur la plaque inférieure. Faites coulisser la plaque supérieure de la chambre en position ouverte de manière à aligner les petits trous avec les 15 puits, permettant ainsi d'introduire les mouches dans les puits individuels. Aspirez une mouche dans l'aspirateur buccal en aspirant doucement par une extrémité de l'aspirateur, comme si vous utilisiez une paille.

Déposez les mouches en soufflant légèrement tout en orientant l'ouverture vers la cible. Après avoir chargé un puits, faites glisser la plaque supérieure de manière à emprisonner la mouche dans la chambre, puis placez un ruban adhésif sur l'ouverture du puits pendant le chargement de l'ensemble des chambres afin d'empêcher la mouche de s'échapper pendant le chargement des autres puits. Si plusieurs mouches sont aspirées dans un même puits, laissez cette ouverture découverte jusqu'à ce qu'une seule mouche reste.

Une fois que tous les puits nécessaires sont remplis de mouches, retournez la chambre de manière à ce que la plaque inférieure soit orientée vers le haut et que la poudre puisse recouvrir les mouches en tombant à travers la maille. Fixez solidement les plaques supérieure et inférieure en resserrant les vis et agitez la chambre au vortex pendant quatre secondes afin de poudrer les mouches. Tapez deux fois la chambre, face de la plaque supérieure vers le bas, contre la table, pour permettre au colorant de passer de l'autre côté.

Ensuite, retournez la chambre, la plaque supérieure vers le haut, et tapez deux fois sur la chambre afin de s'assurer que le colorant s'accumule au fond de la chambre inférieure, loin de la mouche maintenue dans la chambre supérieure. Pour les mouches témoins, qui ne sont pas autorisées à se toiletter, passez immédiatement à la préparation de l'échantillon. Placez la chambre à plat sur la table ou le plan de travail, la plaque supérieure orientée vers le haut, pendant 30 minutes, afin de permettre aux mouches de se toiletter.

Placer la chambre dans un espace exempt de vibrations et de bruit, afin de maintenir un environnement constant pour toutes les expériences de toiletage. En gardant la chambre à niveau avec la plaque supérieure vers le haut, dévisser délicatement la plaque inférieure et la retirer de la chambre, en prenant soin de ne pas perdre de colorant. Placer la chambre sur un coussin de CO2 avec un débit d'air faible jusqu'à ce que les mouches soient anesthésiées.

Dévissez la plaque supérieure de la chambre, utilisez soigneusement une pince pour saisir une patte et retirer une mouche saupoudrée de chaque chambre, puis déposez-la dans un tube micro-centrifuge de 1,5 millilitre contenant de l'éthanol. Une fois qu'un tube micro-centrifuge contient une mouche, fermez le bouchon et retournez les tubes trois fois pour agiter et mélanger la solution de colorant et d'éthanol. Incubez les tubes contenant l'éthanol et les mouches pendant cinq heures à température ambiante afin de garantir l'élimination complète du colorant de la mouche en solution.

Après cinq heures, vortexez brièvement chaque tube pendant deux secondes afin de garantir l'élimination complète des colorants des mouches. Prélève 50 microlitres du tube expérimental de 1,5 millilitre et répartissez-les dans une cavité d'une plaque de 96 puits, en notant soigneusement l'emplacement de chaque échantillon sur la plaque. Ajoutez 200 microlitres d'éthanol pour diluer l'échantillon cinq fois, afin d'éviter les effets d'obturation dus aux mouches fortement chargées de poudre ou à de gros défauts de toilette.

Utilisez un lecteur de plaques pour analyser chaque échantillon à 397 nanomètres. Enregistrez l'échantillon à l'aide du lecteur de plaques et enregistrez le classeur contenant les échantillons enregistrés sur la plaque. Nous avons utilisé cette méthode pour étudier DopR en comparant la performance de toilette d'un hypomorphe fort et de mutants nuls de DopR à une souche de type sauvage.

Les mutants de DopR ont conservé significativement plus de colorant que leur type sauvage ou leurs homologues récupérés, indiquant que les mutants de DopR étaient moins efficaces en matière de comportement de toilette. Dans une expérience parallèle sur des mouches Rutabaga, les mutants présentent des niveaux d'accumulation de colorant plus élevés que les mutants de DopR, suggérant un rôle important de DopR dans le comportement de toilette. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment manipuler les mouches pour des tests comportementaux et également mesurer le comportement de toilette.