Name: Reprogrammation conditionnelle de cellules Pediatric Human oesophagien épithéliales pour utilisation en génie tissulaire et recherche sur les maladies (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Découvrez la reprogrammation conditionnelle de cellules épithéliales œsophagiennes pédiatriques pour le génie tissulaire. Cette méthode permet d'expanser des cellules patient sans modification génétique.

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Nous tenons à remercier le Connecticut Children’s Medical Center Strategic Research Funding pour son soutien à ce travail.

biopsies oesophagiennes ont été obtenus après le consentement éclairé a été obtenu à partir des parents / tuteurs des patients pédiatriques et en conformité avec comité d&#39;examen institutionnel (IRB # 13-094). 1. Instruments stérilisant et Gélatine Solution <ol><li> forceps autoclaves, lames de rasoir et des ciseaux avant tissus de manutention pour éviter la contamination. </li><li> Pour 200 ml de solution de gélatine à 0,1%, mélanger 200 ml d&#39;eau distillée avec 0,2 g de gélatine. Autoclave et refroidir avant de l&#39;utiliser. </li></ol> 2. Coating Tissue Culture Plaques <ol><li> Environ 2 h avant l&#39;isolement des cellules, ajouter suffisamment de 0,1% de gélatine pour couvrir une boîte de culture tissulaire (100 mm) et on incube à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire. REMARQUE: Ces plaques peuvent également être faits à l&#39;avance et conservées dans l&#39;incubateur avant de les utiliser. </li></ol> 3. Faire Enzyme Solution pour Dissociation <ol><li> Environ 30 minutes avant l&#39;isolement des cellules, pesez10 unités de dispase sur une balance sur la base des unités par milligramme de concentration sur le flacon. Placer la poudre dans un tube de 15 ml conique avec 10 ml de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) et placer dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li></ol> 4. Making milieu de culture cellulaire <ol><li> Pour 50 ml de milieu de reprogrammation conditionnelle, mélanger les ingrédients suivants dans un tube stérile conique: 35 ml de F12 (Ham moyenne), 11,5 ml de DMEM, 0,5 ml de L-glutamine, 0,5 mL de 100x pénicilline / streptomycine, 2,5 ml de sérum de fœtus bovin (FBS), 250 ug d&#39;insuline humaine, 500 ng de facteur de croissance épidermique humain (EGF). </li><li> Pour 500 ml de 3T3 moyen, mélanger 50 ml de FBS, 5 ml de 100x pénicilline / streptomycine et 5 ml de L-glutamine avec 500 ml de DMEM. </li><li> Pour 500 ml de milieu sans sérum kératinocytes, dégeler EGF et de l&#39;extrait d&#39;hypophyse bovine (BPE) suppléments (fournis avec les médias). Ajouter les suppléments au ml bouteille de milieu de base 500 et ajouter 5 ml de 100x pénicilline / streptomycine </li></ol> 5. la mise en culture et en irradiant cellules 3T3 comme un chargeur Source <ol><li> Préparer le milieu 3T3, comprenant en DMEM 10% de FBS, 1 x pénicilline / streptomycine et 2 mM de L-glutamine. </li><li> Culture des cellules 3T3 dans les tissus traités flacons T-75 au moins 3 jours avant l&#39;arrivée des échantillons de patients. <ol><li> Juste avant l&#39;arrivée des échantillons de patients, en utilisant des cellules 3T3 trypsiniser 5 ml de 0,25% de trypsine-EDTA par flacon et incuber à 37 ° C pendant 5 minutes ou jusqu&#39;à ce que la plupart des cellules sont flottantes </li></ol></li><li> Ajouter 5 ml de 3T3 moyen pour arrêter la réaction. Aspirer la suspension cellulaire et le transférer vers un tube de 15 ml conique. Spin pendant 5 min à 300 x g. </li><li> Aspirer le milieu et remettre en suspension les cellules dans un volume défini de bleu trypan pour le comptage des cellules. Combiner 10 pi de cellules avec 10 pi de bleu trypan pour exclure les cellules mortes. Charge 10 pi de cette solution sur un hémocytomètre pour le comptage des cellules. NOTE: Pour cette protocol, la densité d&#39;ensemencement des cellules 3T3 irradiés est de 10.900 cellules par cm2, ce qui est égal à 600.000 cellules par plaque de 100 mm. </li><li> Aliquoter le nombre de cellules nécessaires à la plaque d&#39;une plaque de 100 mm par échantillon du patient et remettre en suspension dans 25 ml de milieu 3T3 dans un tube de 50 ml conique et irradier avec 3000 rads. </li><li> irradiation Après, les cellules de spin bas pendant 5 min à 300 xg et resuspendre dans un milieu de reprogrammation conditionnelle à 5 ml par plaque de 100 mm. </li><li> Réglez le tube de côté jusqu&#39;à le placage des cellules du patient a lieu plus tard dans le protocole (voir étape 7.6). </li></ol> 6. Obtention, conservation et de transport pédiatrique oesophagiennes Biopsies <ol><li> Ajouter 5 ml de milieu sans sérum kératinocytes avec 100 pg / mL primocin 15 tubes coniques mL et l&#39;amener à l&#39;établissement médical sur la glace. REMARQUE: Ces tubes de support peuvent être stockés à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 2 mois. </li><li> Obtenir environ 8 biopsies œsophagiennes au timoi de l&#39;endoscopie et séparée comme suit: <ol><li> Placez six biopsies dans le cône 15 ml contenant du milieu sans sérum de kératinocytes avec 100 pg / mL primocin et le placer sur la glace mouillée. </li><li> Placer une biopsie dans 5 ml de formol tamponné et le placer sur la glace mouillée. </li><li> Placez une biopsie dans une petite biopsie cryomoule avec optimal composé de température de coupe. <ol><li> Abandonner immédiatement ce moule dans un bécher d&#39;isopentane placé dans de l&#39;azote liquide. Une fois congelé, placez le cryomoule dans un sac de spécimen et stocker sur la glace sèche dans un récipient en mousse de polystyrène. </li></ol></li></ol></li><li> Placer les tubes contenant des biopsies dans le milieu ou le formol dans un sac refermable, puis dans une boîte d&#39;expédition contenant de la glace humide. Sceller et étiqueter la boîte avec une étiquette de biohazard et le transporter au laboratoire. NOTE: Le conteneur qui contient la glace sèche et la biopsie congelée est également scellé et étiqueté avec une étiquette de biohazard. </li></ol> 7. traitementTissu du Patient pour la culture et l&#39;analyse en aval <ol><li> À l&#39;arrivée au laboratoire, transférer la biopsie congelés sur glace sèche à -80 ° C congélateur pour la coupe en aval ou l&#39;extraction d&#39;ARN. Placer l&#39;échantillon dans le formol. Conserver dans un 4 ° C réfrigérateur et permettre de fixer une nuit. </li><li> Faites tourner les biopsies restantes vers le bas à 300 xg, et aspirer le milieu. Ajouter 10 ml de dispase solution au tube conique, sceller et laisser incuber à 37 ° C dans un bain-marie pendant 15 min. </li><li> Après l&#39;incubation, tourner les biopsies vers le bas à 300 x g. Aspirer les moyennes et resuspendre biopsies dans 5 ml de 0,05% de trypsine-EDTA. </li><li> Transférer le 5 ml de trypsine-EDTA contenant les biopsies à une plaque stérile de 100 mm et émincer les biopsies à l&#39;aide de 2 lames de rasoir stérilisées aussi fine que possible. </li><li> Transférer le 5 ml de trypsine-EDTA contenant des biopsies émincées à un nouveau ml conique 15. Rincer la plaque deux fois avec un 5 ml de plus de 0,05% de trypsine-EDTA et ajouter à la partie coniquetube. Incuber le tube pendant 10 minutes dans un bain-marie à 37 °. </li><li> Après l&#39;incubation, tourner les biopsies vers le bas à 300 xg (1,4 RPM) pendant 5 min et aspirer le milieu. Ajouter 5 ml de milieu de reprogrammation conditionnelle au tube conique, ainsi que le 5 mL de milieu de reprogrammation conditionnelle contenant les cellules nourricières irradiées (voir étape 5.7). </li><li> Ajouter un inhibiteur de roche (1 pl / ml) à 10 ml de suspension cellulaire et de la plaque après l&#39;aspiration de la gélatine de la capsule de culture tissulaire. Incuber à 37 ° C. </li></ol> 8. La culture et les cellules expansibles <ol><li> Après environ 5 jours de culture, aspirez le milieu initial contenant les morceaux hachés-biopsie et rincer le plat 2-3 fois avec 5 ml de PBS stérile. Ajouter un nouveau moyen à la plaque y compris inhibiteur de ROCK à 10 uM. </li><li> Après avoir atteint 70% de confluence, développez les cellules. Ajouter 5 ml de 0,05% de trypsine-EDTA à la plaque et incuber dans un incubateur à 37 ° pas plus de 2,5 min pour éliminer les edes cellules nourricières e. À la suite de cette incubation, aspirer le trypsine-EDTA et rincer la plaque avec 5 ml de PBS. </li><li> Aspirer le PBS et ajouter 5 ml de 0,25% de trypsine-EDTA à la plaque et incuber pendant 5-10 minutes ou jusqu&#39;à ce que les cellules sont lâches de la plaque. Ajouter des quantités égales de moyenne à la plaque pour arrêter la réaction et de transférer la totalité du fluide à un tube de 50 ml conique et centrifuger à 300 xg pendant 5 min. </li><li> Resuspendre les cellules dans un volume déterminé de milieu de reprogrammation conditionnel et mélanger 10 ul de la suspension avec 10 pi de bleu trypan. Comptez sur un hémocytomètre pour déterminer le nombre total de cellules. </li><li> Pour développer des cellules, ajouter 1 million de cellules humaines de l&#39;œsophage à une plaque de 150 mm avec 1,2 million irradier des cellules 3T3 dans un volume total de 15 ml. Ajouter inhibiteur de ROCK fraîche à 10 uM et ajouter la suspension cellulaire à un 150 mm plat revêtu de gélatine. </li></ol> 9. Cellules congeler et conserver Human oesophagien épithéliales <ol><li> Pour un milieu de congélation, ajouter 10%DMSO à un milieu de reprogrammation conditionnelle. Après trypsinisation et comptage, aliquoter les cellules de geler dans un nouveau tube de 50 ml conique et centrifuger à 300 xg pendant 5 min. </li><li> Aspirer le moyen et ajouter le milieu de congélation à un volume de 2 ml par cryovial. Une fois que la suspension cellulaire est homogène, aliquote de 10 6 cellules cyrovials pré-étiquetés. Placer dans un récipient de congélation à -80 ° C pendant au moins 24 heures avant le déplacement des flacons de stockage d&#39;azote liquide à long terme. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les étapes les plus importantes dans le but d&#39;isoler et d&#39;étendre les cellules épithéliales de l&#39;œsophage à partir de biopsies de patients sont: 1) dissociant de manière adéquate le tissu biopsie à la mort cellulaire minimale; 2) assurer un inhibiteur de roche est ajouté au milieu de culture cellulaire à chaque changement de milieu; 3) Ne pas utiliser plus de cellules nourricières que recommandé; 4) maintenir une culture aseptique propre; et 5) les cellules de passage juste avant d&#39;atteindre la confluenc...

ingénierie tissulaire oesophagien et éosinophiles oesophagite (EoE) ont fait l&#39;objet de la recherche dans de nombreux laboratoires au cours de la dernière décennie. Malformations congénitales, telles que atrésie de l&#39; œsophage, sont observés chez environ 1 sur 4000 naissances vivantes, ce qui se traduit dans le développement incomplet de l&#39;oesophage menant à l&#39;incapacité de manger 1. L&#39;incidence et la prévalence de EoE ont été à la hausse depuis l&#39;identification de l&#39;entité de la maladie en 1993. L&#39;incidence de EoE variait de 0,7 à 10 / 100.000 par année-personne et la prévalence variait de 0,2 à 43 / 100.000 2. Une nouvelle approche chirurgicale attrayant pour le traitement à long gap atrésie de l&#39;œsophage consiste à générer des constructions de tissu pour l&#39;implantation en utilisant les propres cellules du patient. Ces cellules en association avec des échafaudages synthétiques vont générer une construction autologues qui ne nécessite pas la suppression immunitaire. Certains groupes ont déjà commencé à enquêter sur les États-Unise des cellules souches ressemblant à oesophagien ingénierie tissulaire 3, ainsi que l&#39;utilisation de cellules épithéliales de l&#39; œsophage natifs pour repeupler la muqueuse 4-7. Les maladies qui sont présents dans l&#39;oesophage des patients pédiatriques sont souvent difficiles à diagnostiquer ou étudier sans intervention. En outre, les modèles animaux utilisant ou in vitro immortalisés modèles de lignées cellulaires pour les maladies pédiatriques comme EoE n&#39;englobent la pathogenèse de la maladie exacte ou des différences spécifiques aux patients 8. Par conséquent, la possibilité d&#39;étudier le processus de la maladie d&#39;un patient in vitro afin d&#39;identifier des antigènes de la maladie de déclenchement spécifiques, évaluer les mécanismes sous - jacents et d&#39; enquêter sur les traitements médicamenteux serait nouveau et fournir aux cliniciens des informations qui peuvent aider dans le traitement des patients. Il y a eu de nombreux types de cellules autologues ou spécifiques à un patient qui ont été proposés pour une utilisation en tissuingénierie e et étudier la pathogenèse de la maladie humaine. Toutefois, certains de ces types de cellules sont limitées dans leur capacité à générer suffisamment de cellules d&#39;un phénotype spécifique pour ensemencer un grand échafaudage ou d&#39; effectuer un débit élevé des études in vitro. L&#39;utilisation de cellules souches pluripotentes ou multipotentes a été le sujet de discussion de recherche beaucoup, cependant, les limites et les lacunes pour l&#39; utilisation de ces cellules ont été bien décrits 9. L&#39;utilisation de cellules souches embryonnaires humaines est fortement débattue et présente de nombreuses questions éthiques. Plus important encore , ces cellules forment des tératomes, qui sont semblables à une tumeur, si elles ne sont pas différenciés de leur état pluripotentes avant de les livrer dans un hôte vivant 10. En outre, l&#39;utilisation de cellules souches embryonnaires ne serait pas le patient spécifique et peut déclencher une réponse allogénique et la nécessité d&#39; une suppression immunitaire 10. Les cellules souches pluripotentes induites (CISP) sont des cellules pluripotentes qui peuventdériver à partir des cellules d&#39;un patient. des cellules somatiques telles que les cellules de la peau, peuvent être amenés à un état pluripotent en utilisant une variété de techniques d&#39;intégration et de non-intégratifs. Ces cellules servent alors comme une source de cellules spécifiques au patient pour l&#39;ingénierie tissulaire ou d&#39;une enquête de la maladie. L&#39;intégration du matériel génétique indésirable dans ces cellules est une préoccupation beaucoup ont décrit et même si les séquences sont complètement CSPi enlevés semblent conserver une &quot;mémoire&quot; épigénétique vers le type de cellule à partir de laquelle ils sont dérivés 11. Ces cellules vont également former des tératomes in vivo si non différenciée avant la transplantation 11. De nombreux protocoles de différenciation ont été étudiés en se concentrant sur les lignées épithéliales 12, 13, 14, cependant, il est très important de noter que les types cellulaires résultantes à la fin de la différenciation ne sont pas homogènes et oeul possèdent une fraction du type cellulaire d&#39;intérêt. Cela se traduit par un faible rendement et la nécessité de purifier le type cellulaire souhaité. Bien que CSPi sont une source potentielle de cellules spécifiques au patient, le processus pour obtenir un type d&#39;intérêt soit pour l&#39;ingénierie tissulaire ou d&#39;une enquête de la maladie cellulaire est très inefficace. Des cellules épithéliales humaines ont été isolées avec succès à partir d&#39; une variété de deux tissus malades et non malades dans le corps humain , y compris: 15 poumon, du sein 16, l&#39; intestin grêle 17, 18 côlon, de la vessie et de l&#39; œsophage 19 20. Il est important de noter que les cellules humaines primaires ont un nombre fini de passages dans lesquels le phénotype est maintenu 21, 22. Malheureusement, cela signifie que le nombre de cellules nécessaires pour la recherche de la maladie ou pour l&#39;ensemencement d&#39;un échafaudage d&#39;ingénieriepour l&#39;implantation ne peut pas être atteint. Par conséquent, de nouvelles techniques sont nécessaires pour étendre les cellules du patient, tout en conservant un phénotype épithélial. Reprogrammation conditionnelle des cellules épithéliales normales et cancéreuses en utilisant des cellules nourricières et inhibiteur de ROCK a été décrite en 2012 par Liu et al. 2 3. Cette technique a été utilisée pour développer des cellules épithéliales cancéreuses obtenues à partir de biopsies de la prostate et le cancer du sein en utilisant des cellules nourricières irradiées, inhibiteurs de ROCK et moyennes de reprogrammation conditionnelle. L&#39;objectif était de générer suffisamment de cellules pour des tests in vitro tels que le dépistage des drogues. Cette technique est capable de se dilater par les cellules épithéliales indéfiniment &quot;reprogrammation&quot; de ces cellules à une tige ou à l&#39;état géniteur analogue, ce qui est très proliférative. Il a été démontré que ces cellules sont non tumorigènes et ne possèdent pas la capacité de former des tératomes 23, 24. En outre, aucundes anomalies chromosomiques ou les manipulations génétiques étaient présents après repiquage ces cellules en culture en utilisant cette technique 23, 24. Plus important encore, ces cellules ne sont capables de se différencier dans le type cellulaire natif d&#39;intérêt. Par conséquent, cette technique offre un grand réservoir de cellules épithéliales spécifiques au patient pour enquête sur la maladie ou l&#39;ingénierie tissulaire, sans la nécessité d&#39;immortalisation. L&#39;obtention d&#39;un tissu épithélial d&#39;un organe spécifique afin d&#39;étudier les processus de la maladie est souvent limitée et pas toujours possible en raison du risque patient. Pour les patients souffrant d&#39;une maladie de l&#39;oesophage ou de défauts, la récupération de biopsie endoscopique est une approche mini-invasive pour l&#39;obtention d&#39;un tissu épithélial qui peut être dissocié et conditionnellement reprogrammé pour fournir une source de cellules indéfinie qui est spécifique à la muqueuse de l&#39;oesophage du patient. Ceci permet alors d&#39;études in vitrodes cellules épithéliales pour évaluer les processus de la maladie et l&#39;écran pour thérapeutiques potentiels. Un processus de la maladie qui pourrait grandement bénéficier de cette approche est éosinophile oesophagite, qui a été décrit comme une maladie allergique de l&#39;œsophage 8. Des tests d&#39;allergie ainsi que des approches thérapeutiques pourraient être évalués in vitro en utilisant les propres cellules épithéliales du patient et ces données peuvent ensuite être transférés sur le médecin traitant pour élaborer des plans de traitement individualisés. La technique de reprogrammation conditionnelle en combinaison avec l&#39;obtention de biopsies endoscopiques chez des patients pédiatriques offre la possibilité d&#39;étendre les cellules épithéliales normales de l&#39;œsophage chez un malade indéfiniment. Cette source de la cellule pourrait donc être associé avec des échafaudages naturels ou synthétiques pour fournir une option chirurgicale spécifique au patient pour des défauts, d&#39;une maladie ou d&#39;un traumatisme. Avoir un nombre de cellules indéfinie permettrait ingénieur des constructions oesophagiennes qui possèdent un tout réensemencéeslumen avec les cellules épithéliales de l&#39;œsophage, afin de contribuer à faciliter la régénération des types de cellules restantes.

<table><tbody><tr><td>Primocin</td><td>InVivogen</td><td>ant-pm2</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>277258-1L</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine de peau porcine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cryomold TissueTek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>Cryomatrix OCT</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td>6769006</tr><tr><td>Tubes coniques de 15 mL</td><td>Denville Scientific</td><td>C1017-p</td><td></td></tr><tr><td>Kératinocytes complets Sans sérum Medium</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10724011</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’insuline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278-5ml</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance épidermique humain (EGF)</td>Inhibiteur de ROCK <td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>(Y-27632)</td><td>Fisher Scientific</td><td>125410</td><td></td></tr><tr><td>F-12 Moyen&nbsp ;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal de bovin</td><td>Denville Scientific</td><td>FB5001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>0.05 % Trypsine-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>0.25 % Trypsine-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Plats</td><td>Denville Scientific</td><td>T1110-20</td><td></td></tr><tr><td>Antennes paraboliques 150 mm</td><td>Denville Scientific</td><td>T1115</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Coniques</td><td>Denville Scientific</td><td>&nbsp ; C1062-9&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Pastilles salines tamponnées au phosphate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367811</td><td></td></tr><tr><td>9" Pipettes Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3 Cellules</td><td>ATCC</td><td>CRL1658</td><td></td></tr></tbody></table>

reprogrammation conditionnelle de cellules pediatric human oesophagien épithéliales pour utilisation en génie tissulaire et recherche sur les maladies

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

L’identification et l’extension de cellules spécifiques au patient en culture pour une utilisation dans l’ingénierie tissulaire et l’investigation des maladies peuvent être très difficiles. L’utilisation de divers types de cellules souches pour dériver les types de cellules d’intérêt est souvent coûteuse, longue et très inefficace. De plus, les types de cellules indésirables doivent être éliminés avant d’utiliser cette source de cellules, ce qui nécessite une autre étape du processus. Afin d’obtenir suffisamment de cellules épithéliales œsophagiennes pour concevoir la lumière d’une construction œsophagienne ou pour cribler des approches thérapeutiques pour traiter les maladies de l’œsophage, les cellules épithéliales œsophagiennes natives doivent être développées sans modifier leur expression génétique ou leur phénotype. La reprogrammation conditionnelle du tissu épithélial œsophagien offre une approche prometteuse pour l’expansion des cellules épithéliales œsophagiennes spécifiques au patient. De plus, ces cellules n’ont pas besoin d’être triées ou purifiées et retourneront à un état épithélial mature après les avoir retirées de la culture de reprogrammation conditionnelle. Cette technique a été décrite dans de nombreuses études de dépistage du cancer et permet une expansion indéfinie de ces cellules sur plusieurs passages. La possibilité d’effectuer des tests de dépistage de l’œsophage contribuerait à révolutionner le traitement des maladies œsophagiennes pédiatriques comme l’œsophagite à éosinophiles en identifiant le mécanisme déclencheur à l’origine des symptômes du patient. Pour les patients qui souffrent d’une malformation congénitale, d’une maladie ou d’une lésion de l’œsophage, cette source cellulaire pourrait être utilisée comme moyen d’ensemencer une construction synthétique pour l’implantation afin de réparer ou de remplacer la région affectée.

Un résumé des principales étapes de l&#39; isolement des cellules épithéliales de l&#39; œsophage de biopsies de patients est résumée à la figure 1. Les colonies de cellules épithéliales se formeront dans environ 4-5 jours et seront entourés par des cellules nourricières de fibroblastes (figure 2A). Etant donné que ces colonies élargissent leur fusion avec les autres pour former des colonies plus grandes colonies (figure 2B). Une fois qu...

Expansion des cellules épithéliales humaines oesophagiennes pédiatriques en utilisant la reprogrammation conditionnelle fournit aux enquêteurs avec une population spécifique au patient des cellules qui peuvent être utilisées pour l&#39;ingénierie des constructions oesophagiennes pour l&#39;implantation autologue pour traiter des défauts ou des blessures et servir de réservoir pour des essais de criblage thérapeutique.

Reprogrammation conditionnelle de cellules Pediatric Human oesophagien épithéliales pour utilisation en génie tissulaire et recherche sur les maladies

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

L'objectif général de cette procédure est d'élargir les cellules épithéliales œsophagiennes dérivées de patients à partir de biopsies endoscopiques afin d'étudier les maladies œsophagiennes, ou de créer un support œsophagien tridimensionnel pour la modélisation ultérieure ou le remplacement du tissu œsophagien. Cette méthode peut être utilisée pour mieux comprendre le rôle des cellules épithéliales œsophagiennes dans les maladies œsophagiennes. Elles peuvent également servir à produire des supports tridimensionnels destinés à la modélisation ou à l'implantation.L'avantage de cette technique est qu'elle nous permet de générer des cellules épithéliales spécifiques au patient à partir d'un très petit fragment de tissu, sans nécessiter de modifications génétiques ou permanentes. Les implications de cette technique s'étendent à la compréhension de la pathogenèse de l'œsophagite à éosinophiles, ainsi qu'au développement de traitements pour l'atrésie de l'œsophage et l'œsophagite à éosinophiles. En général, les personnes novices dans cette technique éprouvent des difficultés à éliminer complètement les cellules nourricières avant la récolte des cellules épithéliales œsophagiennes humaines

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Nous décrivons une méthode pour établir des entéroïdes humains à partir de cryptes intestinales grêles et des colonoïdes à partir de cryptes du côlon prélevés à partir de tissus chirurgicaux et de biopsies. Dans cet article méthodologique, nous présentons les modalités de culture qui sont essentielles à la croissance et au maintien réussis des entéroïdes et des colonoïdes humains.

Mise en place d&#39;épithéliales humaines Enteroids et Colonoids de tout le tissu et la biopsie

Ce manuscrit décrit la production, la caractérisation et les utilisations potentielles d'une ingénierie tissulaire de construction de l'œsophage 3D préparé à partir de fibroblastes humains primaires normale de l'œsophage et les cellules épithéliales squameuses ensemencées dans un échafaudage porcine de-cellularisée. Les résultats mettent en évidence la formation d'un épithélium stratifié mûr similaire à l'oesophage humain normal.

Production, la caractérisation et utilisations potentielles d&#39;un humain de l&#39;oesophage muqueux modèle 3D de l&#39;ingénierie tissulaire

Génération de cellules souches pluripotentes induites offre des perspectives fascinantes pour la dérivation de la greffe autologue. Toutefois, la progression à travers un état pluripotent et laborieux re-différenciation entrave encore la traduction clinique. Nous décrivons ici la dérivation des fibroblastes humains adultes et leur conversion directe dans des cellules progénitrices neurales induites et la différenciation ultérieure dans les lignées neurales.

Dérivation des adultes fibroblastes humains et de leur conversion directe dans les cellules progénitrices neurales extensible

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Cette publication démontre des méthodes permettant de prélever et de cultiver avec succès la muqueuse épithéliale nasale d’enfants, et de reprogrammer ces cellules en cellules souches pluripotentes induites (iPSC).

Cultiver des cellules primaires épithéliales nasales des enfants et des Reprogrammer dans les cellules souches pluripotentes induites

La reconstruction oesophagienne est une procédure difficile, et le développement d’un oesophage tissulaire qui permet la régénération de la muqueuse et du muscle oesophagiens et qui peut être implanté comme une greffe artificielle est nécessaire. Ici, nous présentons notre protocole pour générer un oesophage artificiel, y compris la fabrication d’échafaudages, la culture de bioréacteurs, et diverses techniques chirurgicales.

Greffe tissulaire pour la reconstruction oesophagielle circonférence chez les rats

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Bioréacteur guidé par imagerie pour la génération de tissus des voies respiratoires issus de la bioingénierie

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Les co-cultures organoïdes-fibroblastes fournissent un modèle pour étudier la niche des cellules souches in vivo . Ici, un protocole pour les co-cultures organoïdes-fibroblastes œsophagiennes est décrit. De plus, l’imagerie de monture entière est utilisée pour visualiser l’interaction fibroblaste-organoïde.

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Modèles de culture cellulaire tridimensionnels pour étudier la barrière épithéliale dans l’œsophagite à éosinophiles 

Le présent protocole décrit l’établissement et l’analyse histologique de modèles d’organoïdes œsophagiens qui représentent différents stades de la progression tumorale. Cette méthode permet aux chercheurs d’étudier les changements dans la morphologie cellulaire, l’organisation spatiale et les modèles d’expression des marqueurs moléculaires pendant la transition des tissus normaux aux tissus cancéreux.

Etablissement et analyse histologique d’organoïdes œsophagiens modélisant la progression des tissus normaux aux tissus cancéreux

Découvrez la reprogrammation conditionnelle de cellules épithéliales œsophagiennes pédiatriques pour le génie tissulaire. Cette méthode permet d'expanser des cellules patient sans modification génétique.

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Reprogrammation conditionnelle de cellules Pediatric Human oesophagien épithéliales pour utilisation en génie tissulaire et recherche sur les maladies

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