Reprogrammation conditionnelle de cellules Pediatric Human oesophagien épithéliales pour utilisation en génie tissulaire et recherche sur les maladies

L'objectif général de cette procédure est d'élargir les cellules épithéliales œsophagiennes dérivées de patients à partir de biopsies endoscopiques afin d'étudier les maladies œsophagiennes, ou de créer un support œsophagien tridimensionnel pour la modélisation ultérieure ou le remplacement du tissu œsophagien. Cette méthode peut être utilisée pour mieux comprendre le rôle des cellules épithéliales œsophagiennes dans les maladies œsophagiennes. Elles peuvent également servir à produire des supports tridimensionnels destinés à la modélisation ou à l'implantation.

L'avantage de cette technique est qu'elle nous permet de générer des cellules épithéliales spécifiques au patient à partir d'un très petit fragment de tissu, sans nécessiter de modifications génétiques ou permanentes. Les implications de cette technique s'étendent à la compréhension de la pathogenèse de l'œsophagite à éosinophiles, ainsi qu'au développement de traitements pour l'atrésie de l'œsophage et l'œsophagite à éosinophiles. En général, les personnes novices dans cette technique éprouvent des difficultés à éliminer complètement les cellules nourricières avant la récolte des cellules épithéliales œsophagiennes humaines, afin de préserver la pureté.

Christopher Foster, technicien de notre laboratoire, démontrera cette technique. Au moins trois jours avant l'obtention des échantillons de patients, ensemencez les cellules 3T3 dans du milieu de culture 3T3 dans des flacons T75 traités pour la culture tissulaire. Le jour de l'expérience, juste avant l'obtention des échantillons, détachez les cellules 3T3 avec 5 millilitres de trypsine-EDTA 0,25 % par flacon pendant environ cinq minutes à 37 degrés Celsius.

Lorsque la majorité des cellules sont en suspension, ajouter 5 millilitres de milieu 3T3 pour arrêter la réaction, puis transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres pour la centrifugation. Résuspendre le culot dans du milieu pour le comptage. Ensuite, transférer le nombre approprié de cellules à semer dans un tube conique de 15 millilitres.

Ensuite, ajoutez 25 millilitres de milieu 3T3 frais aux cellules pour une irradiation à 3000 rads. Puis, récupérez les cellules par centrifugation, et remettez en suspension le culot dans un milieu de programmation conditionnel à raison de cinq millilitres par plaque de 100 millimètres. Après avoir obtenu environ six biopsies œsophagiennes au moment de l'endoscopie, placez les six biopsies dans un tube conique de 15 millilitres contenant un milieu kératinocytaire complet sans sérum, supplémenté avec du Primocin, sur de la glace fondante.

Placer une biopsie dans cinq millilitres de formol tamponné sur de la glace fondante, et placer une autre biopsie dans un petit moule cryogénique contenant un milieu d'inclusion. Plonger immédiatement le moule dans un bécher contenant de la glace ou du pentane placé à l'intérieur d'un récipient d'azote liquide. Une fois le tissu congelé, placer le moule cryogénique dans un sachet étanche sur de la glace sèche, à l'intérieur d'un contenant en mousse de polystyrène.

Ensuite, placer les tubes contenant les biopsies dans un sac hermétique à l'intérieur d'une boîte d'expédition munie d'une étiquette de danger biologique et contenant de la glace fondante, puis sceller et étiqueter les deux récipients avec un autocollant de danger biologique pour le transport vers le laboratoire. Dès l'entrée au laboratoire, transférer immédiatement la biopsie congelée dans un stockage à moins 80 degrés Celsius en vue d'une sectionnement ultérieur ou d'une extraction d'ARN. Placer l'échantillon dans du formol et le réfrigérer à quatre degrés Celsius pendant la nuit pour la fixation, puis placer les biopsies restantes dans la centrifugeuse.

Remplacer le milieu dans chaque tube par 10 millilitres de solution de dispase, puis boucher les tubes et les incuber 15 minutes à 37 degrés Celsius dans un bain-marie. À la fin de l'incubation, centrifuger à nouveau les biopsies et re-suspendre les échantillons dans cinq millilitres de trypsine-EDTA à 0,25 %. Transférer les biopsies dans une seule plaque stérile de 100 millilitres et utiliser deux lames de rasoir stérilisées pour hacher les tissus le plus finement possible.

Lorsque tous les tissus ont été découpés, transférez les fragments de tissu dans un nouveau tube de 15 millilitres et rincez la plaque deux fois avec cinq millilitres de trypsine-EDTA 0,05 %. Rassemblez les lavages dans le tube et remettez les échantillons dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Après 10 minutes, centrifugez les morceaux de tissu digérés ainsi que les cellules nourricières, puis remettez en suspension les culots dans cinq millilitres de milieu de reprogrammation conditionnelle chacun.

Ensuite, combiner les échantillons de biopsie du tissu nourricier et de l’œsophage dans un même tube, puis ajouter l’inhibiteur de la rho-kinase, ou inhibiteur ROCK, aux cellules pour leur co-culture sur une boîte de culture tissulaire revêtue de gélatine. Après environ cinq jours, éliminer le milieu et les fragments de biopsie hachés par aspiration, puis rincer la boîte deux à trois fois avec cinq millilitres de PBS stérile. Après le dernier lavage, ajouter 10 millilitres de milieu frais supplémenté en inhibiteur ROCK dans la boîte, puis replacer la co-culture dans l’incubateur jusqu’à ce que les cellules atteignent une confluence de 70 %.

Pour amplifier les cellules, éliminer les cellules nourricières à l’aide de cinq millilitres de trypsine-EDTA 0,05 % à 37 degrés Celsius pendant pas plus de deux minutes et demie. Rincer la plaque avec cinq millilitres de PBS frais pour éliminer les cellules nourricières en suspension, puis ajouter cinq millilitres de trypsine-EDTA 0,25 % et incuber de cinq à dix minutes jusqu’à ce que les cellules de l’échantillon biopsique se détachent du fond de la plaque. Ensuite, arrêter la réaction avec 10 millilitres de milieu frais et transférer les cellules dans un tube conique de 50 millilitres pour une centrifugation.

Resuspendre le culot dans un milieu de reprogrammation conditionnelle frais pour le comptage, puis introduire un million de cellules œsophagiennes humaines dans un nouveau tube conique. Ajouter 1,2 million de cellules 3T3 irradiées aux cellules œsophagiennes, et compléter le volume total du tube à 15 millilitres avec du milieu de reprogrammation conditionnelle frais. Ensuite, ajouter un inhibiteur frais de ROCK aux cellules, et ensemencer la co-culture dans une boîte de 150 millimètres revêtue de gélatine.

Pour congeler les cellules œsophagiennes en vue d’un stockage à moins 80 degrés Celsius, retirez les cellules nourricières et détachez les cellules œsophagiennes comme vient de l’être démontré. Ensuite, transférez les cellules dans un nouveau tube conique de 50 millilitres pour la centrifugation, puis remettez en suspension le culot à une concentration de un fois 10 à la puissance six cellules par deux millilitres de milieu de congélation. Puis, transférez deux millilitres de cellules dans chaque cryotube préalablement étiqueté, et stockez les échantillons à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 24 heures avant de les transférer vers un stockage prolongé en azote liquide.

Des colonies de cellules épithéliales se formeront en environ quatre à cinq jours et seront entourées de cellules nourricières fibroblastes. Au fur et à mesure que ces colonies s'étendent, elles fusionneront avec d'autres colonies pour former des colonies plus grandes. Une fois que la culture aura atteint une confluence de 70 %, elles devront être agrandies.

Après élimination des cellules nourricières, les cellules épithéliales adhérentes peuvent être traitées à la trypsine et replaquées sur de nouvelles cellules nourricières irradiées. La caractérisation phénotypique de ces cellules par qRT-PCR révèle une surexpression de P63, un marqueur des cellules progénitrices, à la fin du premier passage par rapport à l'échantillon initial de biopsie, indiquant que les cellules ont été reprogrammées vers un état plus proche de celui d'une cellule souche progénitrice. Lorsque ces cellules sont transférées sur des plaques de culture tissulaire normales, l'expression de P63 diminue tandis que les expressions de la protéine de jonction serrée 1 (TJP1) et de l'E-cadhérine augmentent, démontrant un changement phénotypique allant de la cellule progénitrice vers un état plus différencié de cellule épithéliale.

L'analyse cytométrique en flux des cellules après le premier passage indique qu'au moins 90 % des cellules sont également positives pour EpCAM. La coloration en immunofluorescence démontre que les cellules conservent l'expression de leurs marqueurs épithéliaux, de leurs marqueurs de progéniteurs, de leurs marqueurs de prolifération ainsi que de leurs protéines des jonctions serrées épithéliales. Le temps de doublement des cellules œsophagiennes provenant d'un patient non malade a été estimé à environ 36 à 40 heures, bien qu'il soit probable que le temps de doublement des cellules malades soit plus lent.

Une fois maîtrisée, cette technique doit être réalisée en environ une heure. Lors de l'exécution de cette procédure, veillez à utiliser une technique stérile afin d'éviter toute contamination, et assurez-vous de travailler rapidement pour maintenir la viabilité cellulaire. Après cette procédure, d'autres tests, tels que la culture en transwell, peuvent être effectués afin d'évaluer quels antigènes provoquent l'inflammation œsophagienne ou la pathogenèse.

Après son développement, ce test ouvrira la voie aux chercheurs pour identifier les antigènes déclencheurs de l'œsophagite à éosinophiles, ainsi que de nouvelles options thérapeutiques pour traiter ces patients. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler et d'agrandir les cellules épithéliales œsophagiennes à partir de biopsies endoscopiques afin de les utiliser pour l'étude des maladies œsophagiennes ou la génération de modèles tridimensionnels. N'oubliez pas que le travail avec des instruments tranchants et des tissus biologiques peut présenter des risques.

Veillez à éliminer correctement les instruments tranchants et à appliquer de bonnes pratiques de biosécurité.