Reprogrammation conditionnelle de cellules Pediatric Human oesophagien épithéliales pour utilisation en génie tissulaire et recherche sur les maladies

L’objectif global de cette procédure est d’élargir les cellules épithéliales œsophagiennes dérivées de patients à partir de biopsies endoscopiques pour étudier les maladies œsophagiennes, ou de créer un échafaudage œsophagien 3D pour la modélisation en aval ou le remplacement du tissu œsophagien. Cette méthode peut être utilisée pour mieux comprendre le rôle des cellules épithéliales de l’œsophage dans la maladie de l’œsophage. Ils peuvent également être utilisés pour voir des échafaudages 3D pour la modélisation ou l’implantation.

L’avantage de cette technique est qu’elle nous permet de générer des cellules épithéliales spécifiques au patient à partir d’un très petit morceau de tissu sans avoir besoin de modifications génétiques ou permanentes. Les implications de cette technique s’étendent à la compréhension de la pathogenèse de l’œsophagite à éosinophiles, ainsi qu’à la mise au point de traitements pour l’atrésie de l’œsophage et l’œsophagite à éosinophiles. En général, les personnes qui débutent dans cette technique auront du mal à éliminer complètement les cellules nourricières avant de prélever les cellules épithéliales œsophagiennes humaines afin de maintenir la pureté.

Christopher Foster, un technicien de notre laboratoire, fera la démonstration de cette technique. Au moins trois jours avant l’obtention des échantillons du patient, plaquez les cellules 3T3 dans un milieu de culture 3T3 dans des flacons T75 traités par des tissus. Le jour de l’expérience, juste avant d’obtenir les échantillons, détachez les cellules 3T3 avec 5 millilitres de trypsine-EDTA à 0,25 % par flacon pendant environ cinq minutes à 37 degrés Celsius.

Lorsque la plupart des cellules flottent, ajoutez 5 millilitres de milieu 3T3 pour arrêter la réaction, et transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres pour la centrifugation. Remettez la pastille en suspension dans un milieu pour le comptage. Ensuite, transférez le nombre approprié de cellules pour l’ensemencement dans un tube conique de 15 millilitres.

Ensuite, ajoutez 25 millilitres de milieu frais 3T3 dans les cellules pour l’irradiation à 3000 rads. Ensuite, collectez les cellules par centrifugation et remettez la pastille en suspension dans un milieu de programmation conditionnelle à raison de cinq millilitres par plaque de 100 millimètres. Après avoir obtenu environ six biopsies de l’œsophage au moment de l’endoscopie, placez six biopsies dans un tube conique de 15 millilitres contenant un milieu kératinocytaire complet sans sérum, complété par Primocin sur de la glace humide.

Placez une biopsie dans cinq millilitres de formol tamponné sur de la glace humide, et placez une biopsie dans un petit cryomoule de biopsie contenant un milieu d’enrobage. Plongez immédiatement le moule dans un bécher de glace ou de pentane à l’intérieur d’un récipient d’azote liquide. Une fois le tissu congelé, placez le cryomoule dans un sac à échantillons sur de la glace sèche, dans un récipient en mousse de polystyrène.

Ensuite, placez les tubes de biopsies dans un sac refermable à l’intérieur d’une boîte d’expédition avec l’étiquette de danger biologique contenant de la glace humide, et scellez et étiquetez les deux contenants avec un autocollant de danger biologique pour le transport au laboratoire. À l’entrée du laboratoire, transférez immédiatement la biopsie congelée dans un entrepôt à moins 80 degrés Celsius pour une section en aval ou une extraction de l’ARN. Placez l’échantillon dans du formol dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius pour une fixation pendant la nuit et placez les biopsies restantes dans la centrifugeuse.

Remplacez le milieu de chaque tube par 10 millilitres de solution de dispase et scellez les tubes pour une incubation de 15 minutes à 37 degrés Celsius dans un bain-marie. À la fin de l’incubation, faites tourner à nouveau les biopsies et remettez les échantillons en suspension dans cinq millilitres de trypsine-EDTA à 0,25 %. Transférez les biopsies dans une seule plaque stérile de 100 millilitres et utilisez deux rasoirs stérilisés pour hacher les tissus aussi finement que possible.

Lorsque tous les tissus ont été coupés, transférez les fragments de tissu dans un nouveau tube de 15 millilitres et rincez la plaque deux fois avec cinq millilitres de trypsine-EDTA à 0,05 %. Mettez les lavages en pool dans le tube et remettez les échantillons dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Après 10 minutes, centrifugez les morceaux d’échantillon digérés et les cellules d’alimentation, puis remettez les granulés en suspension dans cinq millilitres de milieu de reprogrammation conditionnelle, chacun.

Ensuite, combinez les échantillons de biopsie de l’œsophage et de l’alimentation dans un seul tube, et ajoutez de la rho kinase, ou inhibiteur de ROCK, aux cellules pour leur co-culture sur une boîte de culture de tissus recouverte de gélatine. Après environ cinq jours, retirez le milieu et les morceaux de biopsie hachés par aspiration, et rincez la boîte deux à trois fois avec cinq millilitres de PBS stérile. Après le dernier lavage, ajoutez 10 millilitres de milieu frais complété par un inhibiteur de ROCK dans la plaque et retournez la co-culture dans l’incubateur jusqu’à ce que les cellules atteignent 70 % de confluence.

Pour dilater les cellules, retirez les mangeoires avec cinq millilitres de trypsine-EDTA à 0,05 % à 37 degrés Celsius pendant pas plus de deux minutes et demie. Rincez la plaque avec cinq millilitres de PBS frais pour éliminer les cellules nourricières flottantes, et ajoutez cinq millilitres de 0,25 % de trypsine-EDTA pour une incubation de cinq à 10 minutes jusqu’à ce que les cellules de l’échantillon de biopsie soient détachées du fond de la plaque. Ensuite, arrêtez la réaction avec 10 millilitres de milieu frais et transférez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres pour la centrifugation.

Remettez la pastille en suspension dans un nouveau milieu de reprogrammation conditionnelle pour le comptage, et, maintenant, comptez une fois 10 à la sixième cellules œsophagiennes humaines dans un nouveau tube conique. Ajoutez 1,2 fois 10 à la sixième cellules 3T3 irradiées aux cellules œsophagiennes et portez le volume total dans le tube à 15 millilitres avec un nouveau milieu de reprogrammation conditionnelle. Ensuite, ajoutez un inhibiteur de ROCK frais aux cellules et placez la co-culture sur une boîte de 150 millimètres recouverte de gélatine.

Pour congeler les cellules œsophagiennes pour un stockage à moins 80 degrés Celsius, retirez les mangeoires et détachez les cellules œsophagiennes comme nous venons de le démontrer. Ensuite, transférez les cellules dans un nouveau tube conique de 50 millilitres pour la centrifugation, et remettez la pastille en suspension à une fois 10 à six cellules par deux millilitres de concentration de fluide de congélation. Ensuite, transférez deux millilitres de cellules dans chaque cryoflacon pré-étiqueté et stockez les échantillons à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 24 heures avant de les déplacer vers un stockage à long terme d’azote liquide.

Les colonies de cellules épithéliales se formeront en quatre à cinq jours environ et seront entourées de cellules nourricières de fibroblastes. Au fur et à mesure que ces colonies s’étendent, elles fusionnent avec d’autres colonies pour former de plus grandes colonies. Une fois que la culture est devenue confluente à 70 %, il faut les étendre.

Une fois que les cellules nourricières ont été retirées, les cellules épithéliales adhérentes peuvent être trypsonisées et reconditionnées sur de nouvelles cellules nourricières irradiées. La caractérisation phénotypique de ces cellules via qRT-PCR révèle une régulation à la hausse de P63, un marqueur de cellule progénitrice à la fin du premier passage, par rapport à l’échantillon initial de bioespionnage, indiquant que les cellules ont été reprogrammées à un état plus proche de celui de la tige progénitrice. Lorsque ces cellules sont transférées sur des plaques de culture tissulaire normales, l’expression de P63 diminue et les expressions de la protéine de jonction serrée un, ou TJP1, et de l’E-cadhérine augmentent, démontrant un changement de phénotype de la cellule progénitrice à une cellule épithéliale plus différenciée.

L’analyse cytométrique en flux des cellules après le passage indique que plus de 90 % des cellules sont également positives pour l’EpCAM. La coloration par immunofluorescence démontre que les cellules conservent leur marqueur épithélial, leur marqueur progéniteur, leur marqueur de prolifération et l’expression de la protéine de jonction épithéliale serrée. Le temps de doublement des cellules œsophagiennes d’un patient non malade a été calculé à environ 36 à 40 heures, bien qu’il soit probable que le temps de doublement des cellules malades sera plus lent.

Une fois maîtrisée, cette technique devrait être terminée en environ une heure. Lorsque vous tentez cette procédure, assurez-vous d’utiliser une technique stérile pour éviter la contamination et assurez-vous de travailler rapidement pour maintenir la viabilité cellulaire. À la suite de cette procédure, d’autres tests, tels que la culture transwell, peuvent être effectués afin d’évaluer quels antigènes sont à l’origine de l’inflammation ou de la pathogenèse de l’œsophage.

Après sa mise au point, ce test permettra aux chercheurs d’identifier les antigènes déclenchants de l’œsophagite à éosinophiles, ainsi que de nouvelles options de traitement pour traiter ces patients. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et d’étendre les cellules épithéliales de l’œsophage à partir de biopsies endoscopiques pour l’étude des maladies de l’œsophage ou la génération de modèles 3D. N’oubliez pas que travailler avec des instruments tranchants et des tissus biologiques peut être dangereux.

Assurez-vous de vous débarrasser correctement des instruments tranchants et d’utiliser de bonnes pratiques de biosécurité.