Name: MitoCeption: Transfert humain isolé MSC mitochondries à glioblastome cellules souches (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Découvrez le protocole MitoCeption pour transférer des mitochondries isolées de cellules souches mésenchymateuses humaines vers des cellules souches de glioblastome. Cette méthode permet d'étudier les effets métaboliques et biologiques des mitochondries transférées.

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Nous remercions Andrea Parmeggiani (L2C et DIMNP, Montpellier), Benoit Charlot (IES, Montpellier), ainsi que des membres du laboratoire pour des discussions utiles, Christophe Duperray pour l&#39;aide avec l&#39;analyse FACS, l&#39;installation d&#39;imagerie RIO Montpellier (IRM) pour fournir le environnement adéquat pour FACS et microscopie confocale. BNM a été soutenue par une bourse d&#39;études supérieures du LabEx Numev (convention ANR-10-LabX-20). AB a été soutenu par une bourse de premier cycle de l&#39;Université de Varsovie et de l&#39;Union européenne (n ° POKL.04.01.02-00-221 / 12). MLV est un scientifique du personnel du Centre national de la recherche scientifique (CNRS).

jour 1 1. Le marquage de la cellule souches mésenchymateuses (MSC) mitochondries (Facultatif) <ol><li> Deux jours avant la préparation des mitochondries, des semences MSCs humaines dans une boîte de culture de 100 mm, dans 10 ml aMEM / FBS 10%, de manière à avoir 4 x 10 5 MSCs en culture le jour 1. </li><li> Rincer avec du PBS MSCs (4 ml) et on ajoute 4 ml d&#39;aMEM / FBS à 1% (préchauffée à 37 ° C). </li><li> Ajouter la quantité requise de mitochondries colorant vital et laisser incuber les cellules pendant 30 minutes dans l&#39;incubateur à 37 ° C. </li><li> Retirer la solution mitochondries de colorant, rincer les cellules deux fois avec 4 ml préchauffée (37 ° C) aMEM / FBS 1% et rajouter 4 ml aMEM / FBS 10%. Incuber les cellules à 37 ° C. </li><li> Changer le milieu de culture (10 ml aMEM / FBS 10%) après 30 minutes et, une autre fois, 2 heures plus tard. </li></ol> jour 1 2. Étiquetage des cellules de glioblastome souches (CGC) (facultatif, voir la section Discussion) <table border="1" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot; fo: keep-with-next.within page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Milieu de culture cellulaire </td><td> Composition </td></tr><tr><td rowspan="5"> CGC milieu de base </td><td> DMEM / F-12 complété avec </td></tr><tr><td> Insuline 20 mg / ml </td></tr><tr><td> N2 1x supplément </td></tr><tr><td> Glucose 3 g / l </td></tr><tr><td> L-glutamine 2 mM, </td></tr><tr><td rowspan="9"> milieu de prolifération CGC </td><td> Ajouter au milieu de base: </td></tr><tr><td> B27 1x supplément </td></tr><tr><td> EGF 10 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF de 10 ng / ml </td></tr><tr><td> Fungine 10 mg / ml </td></tr><tr><td> Fungizone 0,25 mg / ml </td></tr><tr><td> Héparine 2 mg / ml </td></tr><tr><td> Ciprofloxacine 2 pg / ml </td></tr><tr><td> Gentamicine 2 pg / ml </td></tr><tr><td rowspan="4"> milieu de prolifération MSC </td><td> &amp; #945; MEM complété par </td></tr><tr><td> L-glutamine 2 mM, </td></tr><tr><td> 10% de FBS </td></tr><tr><td> bFGF 2 ng / ml </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Culture Media. <ol><li> Dissocier GSCs (Gb4 lignée cellulaire 32 (10 x 10 6 cellules) cultivées comme neurosphères sur poly-HEMA flacons de culture cellulaire revêtu (voir les étapes 3.1 à 3.12). </li><li> GSCs de semences dans une plaque de 48 puits à 10 5 cellules / puits dans du milieu de prolifération CGC (500 pi) (voir le tableau 1). </li><li> Centrifuger la plaque à 270 g pendant 5 min à 20 ° C. </li><li> Ajouter la quantité requise de la cellule colorant vital et incuber pendant 30 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter 500 pi de la CGC milieu de base (tableau 1) par puits de la plaque de 48 puits. </li><li> Centrifuger la plaque à 270 xg à 20 ° C pendant 5 min. Aspirer le surnageant. </li><li> Répétez les étapes 02.05 à 02.06. </li><li> Ajouter 500 ul de milieu de base CGC et incuber à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Centrifuger la plaque à 270 xg à 20 ° C pendant 5 min. Aspirer le surnageant. </li><li> Ajouter 500 ul de milieu de prolifération CGC par puits de la plaque de 48 puits et incuber dans le 37 ° C incubateur. Note: La quantité de GSCs indiqué (10 x 10 6 cellules) permet d&#39; effectuer les différentes expériences dose-réponse et les contrôles FACS. Une fois que les conditions expérimentales sont définies plus précisément ce montant peut être réduit. </li></ol> Jour 2 3. Ensemencement des glioblastome cellules souches <ol><li> Recueillir les neurosphères CGC (10 x 10 6 cellules) par centrifugation à 270 g pendant 5 min, à 20 ° C dans un tube de 50 ml. </li><li> Laver les cellules avec 5 ml de HBSS, et centrifuger à 270 g pendant 5 min à 20 ° C. </li><li> Aspirer le surnageant. </li><li> Resuspendre doucement le culot de la CGC dans 100 pi de trypsine-EDTA (0,25%) (par 10 x 10 <sup&gt; 6 cellules) </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 3 min. </li><li> Ajouter 10 ul de CaCl2 (20 mM) et 2 ul de DNase I (10 mg / ml). </li><li> Dissocier les neurosphères par pipetage de haut en bas (30-50x) avec une pipette P200. Éviter les bulles. Vérifiez sous le microscope que tous les CSS sont dissociées. </li><li> Ajouter 10 ul inhibiteur de trypsine (5%) et 10 ml de HBSS. </li><li> Centrifugeuse GSCs à 270 xg pendant 7 minutes à 20 ° C. </li><li> Jeter le surnageant et ajouter 10 ml CGC milieu de base (tableau 1). </li><li> Comptez GSCs avec une chambre de comptage Thoma puis centrifuger les cellules à 270 xg pendant 7 minutes à 20 ° C. </li><li> Ajouter le volume approprié de milieu de prolifération CGC (tableau 1) pour atteindre la concentration cellulaire de 10 6 AFEDC / ml. </li><li> Seed 10 5 GSCs (100 pi de la suspension cellulaire) par puits d&#39;une plaque de 96 puits. </li><li> Centrifuger les plaques à 270 xg pendant 7 minutes à 20 ° C pour obtenir GSCs au bottom de puits. </li><li> Incuber la plaque à 96 puits à 37 ° C jusqu&#39;à ce que la section 5. </li></ol> Jour 2 4. MSC mitochondries Isolation <ol><li> Réglez la température microtube de centrifugation à 4 ° C. </li><li> Préparer deux tubes de 1,5 ml &quot;A&quot; et &quot;C&quot; contenant les réactifs pour l&#39;extraction des mitochondries (200 ul de réactif A et de 400 ul de réactif C, les deux contenant les inhibiteurs de protéase exempt d&#39;EDTA). Préparer 2 autres tubes, labellisés &quot;MSC&quot; et &quot;Mito&quot;. Conservez tous les tubes sur la glace. Préparer également des tubes pour les mitochondries des dilutions en série. </li><li> Lavage avec 10 ml MSCs préchauffée (37 ° C) PBS. </li><li> Laver MSCs avec 2 ml de trypsine (pas EDTA) pendant 10 secondes et ajouter 1 ml de trypsine (pas EDTA). Incuber les cellules pendant 5-10 min à 37 ° C. </li><li> Récupérer les cellules souches mésenchymateuses en ajoutant 10 ml d&#39;aMEM / 10% FBS, transférer dans un tube de 50 ml. </li><li> Centrifuger les cellules à 270 g pendant 5 min à 20 ° C. </li><li> Jeter le surnageant et ajouter10 ml d&#39;aMEM / 10% FBS au culot cellulaire. </li><li> Compter les cellules souches mésenchymateuses avec une chambre de comptage de Malassez. </li><li> Centrifugeuse MSCs (4-5 x 10 5) à 270 g pendant 5 min à 20 ° C. </li><li> Jeter le surnageant, ajouter 1 m glacée aMEM / FBS 10% au culot cellulaire et transférer les cellules du tube &quot;MSC&quot; marqué au (préparé à l&#39;étape 4.2). Garder le tube sur la glace. </li><li> Centrifugeuse le tube contenant les cellules souches mésenchymateuses à 900 xg pendant 5 min, à 4 ° C. </li><li> Retirez tout moyen résiduel du tube. </li><li> Ajouter 200 pi de mitochondries Isolation Réactif A (contenant des inhibiteurs de la protéase du libre-EDTA). Vortex à vitesse moyenne pendant 5 sec et laisser les tubes sur la glace pendant exactement 2 minutes. </li><li> Ajouter 2,5 pi de mitochondries Isolation Réactif B. Vortex à vitesse maximale pendant 10 secondes, puis laisser les tubes sur la glace. Répéter toutes les 30 secondes pendant 5 min. </li><li> Ajouter 200 pi de mitochondries Isolation Réactif C (contenant des inhibiteurs de la protéase du libre-EDTA). Mélanger en inclinant le tube (roughly 30 fois, ne pas vortex). Centrifuger le tube à 700 g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Transférer le surnageant (contenant les mitochondries MSC) dans le tube &quot;Mito&quot; (préparé à l&#39;étape 4.2). </li><li> Centrifuger à 3000 xg, 15 min à 4 ° C, pour obtenir le culot de mitochondries. Jeter le surnageant. Le culot contient des mitochondries isolées. </li><li> Rincer le culot de mitochondries avec 200 ul du réactif C. Ensuite, centrifuger à 12 000 x g, 5 min à 4 ° C, pour obtenir le culot de mitochondries. </li></ol> 5. Transfert de Isolated MSC mitochondries à GSCs (MitoCeption) <ol><li> Ajouter 200 ul de (0 ° C) , CGC milieu de prolifération pré-refroidi au culot de mitochondries isolées à partir MSCs (4 x 10 5). </li><li> Diluer la préparation de mitochondries (en milieu de prolifération CGC) à ajouter systématiquement 20 pi de suspension mitochondriale aux CSS. </li><li> Ajouter le volume des mitochondries isolées dans les puits de la 96-well plaque contenant les CSS (étape 3.15), à la concentration désirée (0,1 à 10 ug). Ajouter lentement la mitochondrie, à proximité du fond du puits, couvrant toute la surface au moins une fois. </li><li> Pour le contrôle de MSC mitochondries colorant vital fuites, ajouter les mêmes quantités de la préparation de mitochondries (0,1 à 10 ug) aux puits d&#39;une plaque à 96 puits contenant CGC milieu de prolifération uniquement (pas de CSS) (voir la partie 6.2 pour la détection de fuite de colorant vital). </li><li> Centrifuger la plaque à 96 puits contenant les GSCs bénéficiaires des mitochondries avec les mitochondries MSC (étape 5.3) et la plaque de commande (étape 5.4) à 1500 g pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Placez les plaques de culture à 37 ° C cellulaire incubateur immédiatement après centrifugation. Remarque: le protocole de transfert de mitochondries repose sur la centrifugation de la suspension de mitochondries dans les cellules mises en culture à la force de centrifugation convenable, avec un certain nombre de centrifugations qui peut être ajustée en fonction de la SYSTem des cellules donneur / receveur mitochondries. </li></ol> jour 3 6. Analyse du transfert mitochondries par FACS et imagerie confocale <ol><li> Préparation des échantillons de la CGC pour l&#39; analyse FACS Remarque: Si les mitochondries MSC ont été marquées avec un colorant vital préalable (section 1), l&#39;efficacité peut être contrôlée par FACS, 24 heures après le transfert de mitochondries. <ol><li> Centrifuger la plaque à 96 puits avec les GSCs MitoCepted à 270 g pendant 5 min à 20 ° C. </li><li> Jeter le surnageant. </li><li> Ajouter 100 trypsine ul (pas EDTA) dans chaque puits. Incuber à 37 ° C pendant 3 min. Pipet haut et en bas de dissocier les neurosphères formés dans la période de 24 h. </li><li> Ajouter 100 pi de la CGC milieu de base. </li><li> Centrifuger la plaque à 270 g pendant 5 min à 20 ° C et jeter le surnageant. </li><li> Resuspendre GSCs dans 300 ul CGC milieu de base et transfert à FACS adapté tubes. </li><li> Effectuez l&#39;une FACSaly. </li></ol></li><li> Contrôle des fuites mitochondries de colorant vital de la mitochondries isolées (FACS) Note: Le but de cette étape est de déterminer le signal de FACS de fond qui ne reflète pas un véritable transfert MSC mitochondries, mais plutôt la simple fuite de colorant vital de la mitochondrie MSC marqué utilisé pour MitoCeption (étape 5.3). <ol><li> Seed cellules CGC comme décrit dans les étapes 3.1 à 3.15. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C pendant 1 heure. </li><li> Centrifuger la plaque à 96 puits contenant des mitochondries seulement (de l&#39;étape 05.04 à 05.06) à 1500 g pendant 5 min à 20 ° C. </li><li> Aspirer le milieu de culture de la CGC plaque à 96 puits (étape 6.2.2) et le remplacer par le milieu incubé avec des mitochondries seulement (surnageant de l&#39;étape 6.2.3). </li><li> Incuber la plaque à 96 puits contenant les GSCs à 37 ° C pendant 2 heures. </li><li> Procédez comme dans les étapes 6.1.1 à 6.1.7 pour l&#39;analyse FACS. </li></ol></li><li> Préparation de samp CGCles pour l&#39;imagerie confocale Remarque: Si le transfert de MSC mitochondries à GSCs doit être analysé par imagerie de fluorescence, les deux MSCs et CSS doivent être préalablement marqué, respectivement avec des mitochondries (étape 1) et de la cellule (étape 2) colorants vitaux. <ol><li> Préparer GSCs comme dans les étapes 6.1.1 à 6.1.5. </li><li> Resuspendre GSCs dans 2 ml de milieu de prolifération CGC contenant 2% de FBS et de graines dans des boîtes de culture de 35 mm (à fond de verre). </li><li> Effectuer l&#39;imagerie confocale sur les CSS avec les mitochondries fluorescentes transférées MSC 24 heures plus tard. </li></ol></li></ol>

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</ol>

INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale), avec lequel CJ et ML.V. sont affiliés, a déposé une demande de brevet sur la technique de MitoCeption (de EP14306154.7).

Un nombre croissant d&#39;études montrent que les cellules peuvent échanger des mitochondries et que ces mitochondries ont des effets profonds sur le métabolisme et les fonctions de la cellule cible. Par conséquent, il est essentiel de maîtriser les outils pour transférer quantitativement dans les mitochondries des cellules du donneur à ces cellules cibles afin de permettre une étude précise de leurs effets biologiques. Le protocole décrit ici a été initialement élaboré pour transférer des m...

Les mitochondries sont des organites présents dans les cellules eucaryotes où ils jouent un rôle central dans l&#39;absorption des nutriments, ainsi que dans l&#39;énergie et métabolite production. Ces organites contiennent circulaire de l&#39; ADN mitochondrial (ADNmt), 16,6 kb, qui code pour les protéines des complexes de la chaîne de transport d&#39;électrons, ARNt et ARNr 1. La fonctionnalité de ces organites est essentielle pour l&#39; homéostasie cellulaire et de nombreuses pathologies sont associées à une dysfonction mitochondriale 1, 2, 3. L&#39;état de la mitochondrie a par exemple été liée à l&#39; inflammation, les maladies infectieuses et le cancer, dans ce dernier cas avec des conséquences sur les métastases et la résistance à la thérapie 4, 5, 6, 7. Mitochondries afficher la capacité remarquable de<html> se transférer entre «donneur» et les cellules «cibles». Cela conduit à des changements dans le métabolisme énergétique des cellules cibles, ainsi que dans d&#39; autres modifications fonctionnelles telles que la réparation tissulaire et la résistance aux agents chimiothérapeutiques, comme montré récemment par différents laboratoires 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16. Les cellules souches mésenchymateuses humaines (CSM) présentent cette aptitude à transférer les mitochondries à une grande variété de cellules cibles, y compris les cardiomyocytes, les cellules endothéliales, les cellules épithéliales alvéolaires pulmonaires, des cellules tubulaires rénales et les cellules cancéreuses, ce qui conduit à des modifications des propriétés fonctionnelles de ces cellules 8,&gt; 9, 10, 12, 17, 18. l&#39;échange de mitochondrie apparaît maintenant comme un mécanisme largement utilisé qui permet à un certain nombre de types cellulaires différents de communiquer entre eux et modifier leurs propriétés biologiques. Cet échange de mitochondries peut se produire par effet tunnel nanotubes (TNT) formation, impliquant connexine 43 contenant des jonctions lacunaires 8 ou M-Sec / TNFaip2 et exocyste complexes 19. En variante, le transfert de mitochondries a également été montré pour être médiée par arrestine microvésicules domaine contenant la protéine 1-médiation (ARMMS) 20. Fait intéressant, l&#39;efficacité du transfert de mitochondries était liée au taux d&#39;expression de la Rho GTPase 1 MIRO1 21, un facteur clé pour expliquer les différences dans les efficacités de transfert de mitochondries entre iPSC-MSCs et adulte BM-MSCs 22. En dépit de cette richesse des données relatives à l&#39;échange de mitochondries de cellule à cellule, on sait relativement peu sur le métabolisme et le résultat biologique de ce transfert de mitochondries. Par conséquent, il justifie pleinement la mise en place des outils appropriés pour évaluer pleinement les effets biologiques de ce transfert. Au fil des années, plusieurs approches techniques pour transférer les mitochondries des cellules du donneur accepteur ont été proposés. Cela comprend l&#39; injection directe de mitochondries dans des ovocytes 23, 24, 25, la fusion cellulaire pour produire transmitochondrial cybrides 26, 27 et, plus récemment, le transfert des mitochondries isolées à l&#39; aide photothermique nanoblades 28. Nous et d&#39;autres ont démontré précédemment la capacité de mitochond isoléeria à être internalisé par les cellules vivantes, comme on l&#39; observe à la fois in vitro et in vivo , 29, 30, 31, grâce à des mécanismes proposés pour impliquer macropinocytose 32. Nous avons également mis au point un procédé, appelé MitoCeption, pour transférer quantitativement mitochondries isolées ( à partir de cellules souches mésenchymateuses) à des cellules cibles, comme le montre le (adhérent) MDA-MB-231 lignée de cellules de cancer du sein 31. Ce protocole a été adapté ici pour le transfert des mitochondries isolées de MSC humaines aux cellules souches de glioblastome (CSS). Le glioblastome est une tumeur maligne agressives du cerveau qui sont rapidement devenues résistantes au traitement, principalement en raison des cellules souches de glioblastome (GSC) présents dans la tumeur 33. Ces GSCs poussent comme neurosphères in vitro et de générer des tumeurs dans des modèles de xénogreffe. Les cellules cancéreuses au sein de glioblastome ont lala capacité d&#39;établir des connexions de cellule à cellule, comme indiqué récemment pour les cellules astrocytaires de tumeurs cérébrales qui relient via microtubes élargie, à travers laquelle les mitochondries (ainsi que de calcium et de cellules noyaux) peut migrer, ce qui entraîne dans les réseaux d&#39;astrocytome radiothérapie résistant à 34. Glioblastome peut recruter de nombreuses cellules différentes au sein du microenvironnement tumoral, y compris MSCs 35, 36. Nous avons montré que MSCs peut établir des connexions entre cellules avec CSS en coculture et transférer leurs mitochondries (données non représentées), qui devrait modifier les propriétés fonctionnelles de la CGC. Le présent protocole décrit comment la technique de MitoCeption peut être utilisé pour transférer des mitochondries, préalablement isolé de cellules souches mésenchymateuses humaines, GSCs humaines dans le but de déterminer leur résultat biologique fonctionnel. Le multipotentes et la ligne Gb4 CGC hautement tumorigène 37 a été utilisé dans cette étude.

<table><tbody><tr><td>Kit d’isolement des mitochondries pour les tissus&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>10579663</tr><tr><td>N-2 Supplement (100x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11520536</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement W/O VIT A (50x)</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>11500446</tr><tr><td>HBSS sans Ca2+ sans Mg2+</td><td>. Sigma</td><td>H4385</td><td></td></tr><tr><td>poly Hême&nbsp ;</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>P3932</td><td></td></tr><tr><td>aMEM sans glutamine</td><td>Ozyme</td><td>BE12-169F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 sans glutamine</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>11540566</tr><tr><td>L-Glutamine&nbsp ;</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>25030-024&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Glucose&nbsp ;</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Insuline&nbsp ;</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>I 1882&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Humain&nbsp ; bFGF&nbsp ;</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>EGF humain&nbsp ;</td><td>Peprotech&nbsp ;</td><td>AF-100-15&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Héparine</td><td>Sigma</td><td>H3149° ;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>MERCK</td><td>2382</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la trypsine</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>SIGMA&nbsp ;</td><td></td><td></td>10104159001</tr><tr><td>Trypsine 0,25 % / EDTA 1 mM</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td></td><td></td>25200056</tr><tr><td>Trypsine</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteurs de protéase sans EDTA</td><td>Sigma</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacine&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>17850-5G-F</td><td></td></tr><tr><td>Fongique&nbsp ;</td><td>Invivogen</td><td>ant-fn-1</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone&nbsp ;</td><td>Thermofisher</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Euromedex</td><td>EU0410</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Green</td><td>FM Sondes moléculaires</td><td>M7514</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Red CMXRos</td><td>Molecular Sondes</td><td>&nbsp ; M7512</td><td></td></tr><tr><td>Sondes moléculaires FM rouge foncé MitoTracker</td><td></td><td>&nbsp ; M22426&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Sondes moléculaires</td> <td>CellTracker Green CMFDA</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>Sondes moléculaires</td><td>CellTracker Blue CMF2HC</td><td>C12881</td><td></td></tr><tr><td>RIPA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-24948</td><td></td></tr><tr><td>FluoroDish Boîte de culture stérile</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Hémacytomètre</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>Tubes FACS</td><td>Beckman Coulter</td><td>2 523 749</td><td></td></tr><tr><td>Appareil FACS</td><td>Gallios&nbsp ;</td><td>&nbsp ; 3L 10C</td><td></td></tr><tr><td>LC DÉMARRAGE RAPIDE DNA MASTER PLUS&nbsp ;</td><td>Roche</td><td>3515885001</td><td></td></tr></tbody></table>

mitoception: transfert humain isolé msc mitochondries à glioblastome cellules souches

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

Les mitochondries jouent un rôle central pour le métabolisme cellulaire, la production d&#39;énergie et le contrôle de l&#39;apoptose. la fonction mitochondriale inadéquate a été trouvé responsable de la très diverses maladies, allant de pathologies neurologiques au cancer. Fait intéressant, les mitochondries ont été récemment démontré pour afficher la capacité d&#39;être transféré entre les types de cellules, notamment de cellules souches mésenchymateuses humaines (MSC) pour des cellules cancéreuses dans des conditions de co-culture avec métaboliques et fonctionnels conséquences pour les cellules réceptrices des mitochondries, améliorant encore l&#39;intérêt actuel pour les propriétés biologiques de ces organites. L&#39;évaluation des effets des mitochondries MSC transférés dans les cellules cibles est de première importance pour comprendre le résultat biologique de ces interactions cellule-cellule. Le protocole MitoCeption décrit ici permet le transfert des mitochondries préalablement isolées à partir des cellules du donneur aux cellules cibles, en utilisant MSC mitochondrieset les cellules souches de glioblastome (CGC) en tant que système modèle. Ce protocole a été précédemment utilisé pour transférer des mitochondries, isolée de cellules souches mésenchymateuses pour adhérentes cellules cancéreuses MDA-MB-231. Ce protocole de transfert de mitochondries est adapté ici pour GSCs qui présentent la particularité spécifique de plus en plus comme neurosphères in vitro. Le transfert des mitochondries isolées peut être suivie par les cellules activées par fluorescence (FACS) et la microscopie confocale en utilisant des colorants vitaux mitochondries. L&#39;utilisation de cellules donneuses et cible mitochondries avec des haplotypes distincts (SNP) permet également la détection des mitochondries transférés en fonction de la concentration de l&#39;ADN mitochondrial circulaire (ADNmt) dans les cellules cibles. Une fois que le protocole a été validé avec ces critères, les cellules hébergeant les mitochondries transférées peuvent être analysés plus avant pour déterminer les effets des mitochondries exogènes sur les propriétés biologiques telles que le métabolisme cellulaire, la plasticité, la prolifération et la réponse au traitement.

Les étapes de la procédure décrivant l&#39;isolement des mitochondries à partir de cellules souches mésenchymateuses (MSC) et leur transfert vers les cellules souches de glioblastome ciblées (CGC) par MitoCeption sont représentés sur la figure 1. GSCs sont des cellules souches cancéreuses cultivées en neurosphères pour préserver leurs propriétés de cellules souches. Pour le protocole, les CSS sont ensemencées comme des cellules individuelles d&#39; un couple d&#39;heures...

Ici, un protocole (MitoCeption) est présenté pour transférer les mitochondries, isolées à partir de cellules souches mésenchymateuses humaines (MSC), des cellules souches de glioblastome (CGC), dans le but d&#39;étudier leurs effets biologiques sur le métabolisme et les fonctions CGC. Un protocole similaire peut être adapté pour transférer des mitochondries entre les autres types de cellules.

MitoCeption: Transfert humain isolé MSC mitochondries à glioblastome cellules souches

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...

L'objectif général de cette procédure est de transférer des mitochondries préalablement isolées à partir de cellules donneuses, telles que des cellules souches mésenchymateuses, vers des cellules cibles, telles que des cellules souches de glioblastome. Cette procédure peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du métabolisme, notamment sur les effets biologiques et métaboliques des mitochondries transférées spontanément entre cellules par des processus tels que les nanotubes de tunnelisation ou les microvésicules. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité d'évaluer les effets des mitochondries indépendamment d'autres facteurs présents dans le microenvironnement, tels que les cytokines ou les métabolites, ainsi que d'autres composés pouvant également circuler dans les nanotubes de tunnelisation.À des fins d'imagerie, les mitochondries des CSM et les CSG peuvent être marquées avec des colorants vitaux avant le transfert mitochondrial par MitoCeption. Pour commencer, après avoir préalablement marqué les CSG avec des colorants vitaux selon le protocole décrit, recueillir les neurosphères de CSG dans un tube de 50 millilitres par centrifugation

mitoception-transferring-isolated-human-msc-mitochondria-to

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ce protocole décrit l'isolement, l'enrichissement et l'entretien des cellules tumorales médulloblastome souches dérivées de souris mutantes avec ectopique Sonic activité de la voie Hedgehog.

L&#39;isolement, l&#39;enrichissement et l&#39;entretien des cellules souches Médulloblastome

Dans cette vidéo, une méthode est démontrée pour permettre le transfert de mitochondries marquées par fluorescence dans des cellules souches de glioblastome (GSC) par centrifugation. L’absorption réussie et l’intégration fonctionnelle des mitochondries du donneur sont confirmées par la détection de la fluorescence à l’aide de la microscopie confocale.

Transfert mitochondrial assisté par centrifugation vers des cellules souches de glioblastome

Recherche de tumeur thérapeutiques cellules souches mésenchymateuses (CSM) semblent prometteuses comme traitement pour le glioblastome envahissante. Optimale transplantation implique livraison de MSCs dans la cavité de résection de tumeur sur les échafaudages. Ici, précliniques techniques d’étude MSC traitement du glioblastome figurent notamment : la résection de tumeur guidée par l’image ; implantation de graines MSC échafaudages ; et suivi un traitement postopératoire.

Guidée par l’image de la résection du glioblastome et Implantation intracrânienne d’échafaudages de graines cellules souches thérapeutiques

Ici, nous présentons un protocole pour la préparation et l’administration stéréotaxique de lymphocytes humains allogéniques dans des souris immunodéficientes transportant des tumeurs primaires du cerveau humain orthotopique. Cette étude fournit une preuve de concept pour la faisabilité et l’efficacité antitumorale des immunothérapies cellulaires intrabrain-livré.

Stéréotaxique transfert adoptif de cellules immunitaires cytotoxiques dans des modèles murins de xénogreffes de glioblastome Multiforme Orthotopic homme

Cette étude rapporte une nouvelle approche pour mesurer plusieurs paramètres fonctionnels mitochondriaux basés sur la cytométrie en flux et la double coloration avec deux rapporteurs fluorescents ou anticorps pour détecter les changements dans le volume mitochondrial, le potentiel de membrane mitochondriale, le niveau d’espèces réactives de l’oxygène, la composition de la chaîne respiratoire mitochondriale et l’ADN mitochondrial.

Analyse cytométrique en flux de paramètres mitochondriaux multiples dans des cellules souches pluripotentes induites par l’homme et leurs dérivés neuronaux et gliaux

Ce protocole décrit une technique de génération de cybrides à partir de cellules cancéreuses en suspension comme outil pour étudier le rôle des mitochondries dans le processus tumorigénique.

Génération transmitochondriale de Cybrides à l’aide de lignées cellulaires cancéreuses

Ici, nous présentons un protocole comprenant le traçage mitochondrial, les procédures de co-culture directe de cellules souches mésenchymateuses (CSM) et de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (ARPE19), ainsi que les méthodes d’observation et d’analyse statistique de la formation de nanotubes à effet tunnel (TNT) et du transfert mitochondrial pour caractériser l’échange mitochondrial via les TNT entre les CSM et les cellules ARPE19.

Transfert mitochondrial via des nanotubes à effet tunnel entre les cellules souches mésenchymateuses et l’épithélium pigmentaire rétinien in vitro

Les organoïdes cérébraux servent de modèle précieux pour les études sur l’encéphalomyopathie mitochondriale, l’acidose lactique et les épisodes similaires à l’accident vasculaire cérébral (MELAS), offrant un aperçu de leur physiopathologie sous-jacente et fournissant une plate-forme pour le dépistage des médicaments. Les organoïdes dérivés de lignées cellulaires présentant des niveaux variables d’hétéroplasmie de gènes pathogènes présentent des différences phénotypiques significatives.

Modélisation des maladies mitochondriales à l’aide d’organoïdes cérébraux : un accent sur l’encéphalomyopathie mitochondriale, l’acidose lactique et les épisodes semblables à ceux d’un accident vasculaire cérébral

Les mitochondries exogènes d’origine humaine et murine peuvent être intériorisées en différenciant les préadipocytes et suivies tout au long de la différenciation adipogénique à l’aide d’outils d’imagerie et génétiques. Bien que ces mitochondries interagissent physiquement avec le réseau mitochondrial endogène, elles n’augmentent pas l’expression des marqueurs associés aux adipocytes bruns matures.

Transfert mitochondrial exogène dans les adipocytes bruns différenciés et les préadipocytes déficients en AGPAT2

Propagation des souches embryonnaires humaines (ES) Cellules

Découvrez le protocole MitoCeption pour transférer des mitochondries isolées de cellules souches mésenchymateuses humaines vers des cellules souches de glioblastome. Cette méthode permet d'étudier les effets métaboliques et biologiques des mitochondries transférées.

MitoCeption: Transfert humain isolé MSC mitochondries à glioblastome cellules souches

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