MitoCeption: Transfert humain isolé MSC mitochondries à glioblastome cellules souches

L’objectif global de cette procédure est de transférer des mitochondries précédemment isolées de cellules donneuses telles que les cellules souches mésenchymateuses vers des cellules cibles telles que les cellules souches de glioblastome. Cette procédure peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du métabolisme, telles que les effets métaboliques et biologiques des mitochondries qui sont transférées spontanément entre les cellules par des processus tels que l’effet tunnel des nanotubes ou des microvésicules. Le principal avantage de cette technique est que les effets des mitochondries peuvent être évalués indépendamment d’autres facteurs présents dans le micro-environnement tels que les cytokines ou les métabolites et aussi d’autres composés qui peuvent également être à l’origine du trafic dans les nanotubes à effet tunnel.

À des fins d’imagerie, les mitochondries MSC et GSC peuvent être marquées avec des colorants vitaux avant le transfert des mitochondries par MitoCeption. Pour commencer, après avoir pré-étiqueté les GSC avec des colorants vitaux selon le protocole de texte, collectez les neurosphères de GSC dans un tube de 50 millilitres par centrifugation à 270 fois g à 20 degrés Celsius pendant cinq minutes. Utilisez cinq millilitres de HBSS pour laver les cellules et faites tourner à nouveau le tube.

Aspirez le surnageant et, avec 100 microlitres de Trypsine-EDTA à 0,25 %, remettez doucement en suspension la pastille de GSC. Ensuite, incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de chlorure de calcium de 20 millimolaires dans deux microlitres à raison de 10 milligrammes par millilitre de DNase I dans le tube.

Dissociez les neurosphères en utilisant une pipette P200 pour pipeter doucement de haut en bas 30 à 50 fois en évitant la formation de bulles. Ajoutez 10 microlitres d’inhibiteur de trypsine à 5 % dans 10 millilitres de HBSS dans les cellules et centrifugez les GSC pendant sept minutes. Versez ensuite le surnageant et 10 millilitres de milieu basal GSC dans l’échantillon.

Maintenant, à l’aide d’une chambre de comptage Thoma, comptez les cellules avant de les faire tourner à nouveau. Ajouter le volume approprié de milieu de prolifération de la GSC pour obtenir un concentré cellulaire de 10 à la sixième GSC par millilitre. Ensuite, semez 10 à la cinquième GSC par puits d’une plaque de 96 puits.

Centrifuger la plaque pour que les GSC se déposent au fond des puits. Vérifiez les cellules au microscope. Incuber ensuite la plaque à 37 degrés Celsius.

Pour effectuer l’isolement des mitochondries MSC, commencez par ajuster la température de la microcentrifugeuse à quatre degrés Celsius. Préparez deux tubes de 1,5 millilitre étiquetés A et C contenant des réactifs pour l’extraction des mitochondries. Préparez deux tubes supplémentaires étiquetés MSC et MiTo.

Gardez les tubes sur de la glace. Préparez également des tubes pour les dilutions en série des mitochondries qui seront mises en place avec la préparation des mitochondries. Utilisez 10 millilitres de PBS préchauffé à 37 degrés Celsius pour laver les MSC.

Ensuite, avec deux millilitres de trypsine sans EDTA, lavez les cellules pendant 10 secondes et ajoutez un millilitre supplémentaire de trypsine avant d’incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant cinq à 10 minutes. L’utilisation d’EDTA doit être évitée conformément au protocole, en particulier pour la trypsinisation des CSM et pour les inhibiteurs de protéase utilisés dans la préparation des mitochondries. Récupérez les MSC en ajoutant 10 millilitres d’Alpha MEM 10 %FBS et transférez la suspension dans un tube de 50 millilitres.

Ensuite, centrifugez les cellules. Jetez le surnageant et ajoutez 10 millilitres d’Alpha MEM 10 %FBS à la pastille de cellule. Ensuite, utilisez une chambre de comptage Malassez pour compter les CSM avant de descendre quatre à cinq fois 10 jusqu’à la cinquième cellule.

Jetez le surnageant, ajoutez un millilitre d’Alpha MEM 10 % FBS glacé à la pastille cellulaire et transférez les cellules dans le tube marqué MSC préalablement préparé tout en continuant à le garder sur de la glace. Ensuite, centrifugez le tube MSC à 900 fois g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes et retirez tout le fluide résiduel du tube. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de réactif d’isolement des mitochondries A avec des inhibiteurs de protéase sans EDTA aux CSM et vortex à vitesse moyenne pendant cinq secondes.

Laissez ensuite les tubes sur de la glace pendant exactement deux minutes. Ajoutez 2,5 microlitres de réactif d’isolement B des mitochondries et faites tourbillonner les cellules à vitesse maximale pendant 10 secondes avant de remettre les tubes sur la glace. Répétez le vortex toutes les 30 secondes pendant cinq minutes.

Maintenant, ajoutez 200 microlitres de réactif d’isolement des mitochondries C avec des inhibiteurs de protéase sans EDTA dans le tube et mélangez le contenu en inclinant le tube environ 30 fois. Centrifugez les tubes à 700 fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Transférez le surnageant contenant les mitochondries MSC dans le tube MiTo préalablement préparé.

Centrifugez l’échantillon à 3 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Après avoir jeté le surnageant, utilisez 200 microlitres de réactif C pour rincer la pastille mitochondriale. Ensuite, faites tourner la suspension à 12 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour granuler les organites.

Pour transférer des mitochondries MSC isolées vers des GSC, ajoutez 200 microlitres de milieu de prolifération GSC pré-refroidi à la pastille mitochondriale. Diluer la préparation mitochondriale dans un milieu de prolifération de GSC pour permettre l’ajout constant de 20 microlitres de suspension mitochondriale aux GSC. Ensuite, ajoutez lentement les mitochondries près du fond du puits.

Pour contrôler les fuites de colorant vital des mitochondries MSC, ajoutez la même quantité de préparation mitochondriale dans les puits d’une plaque de 96 puits contenant uniquement un milieu de prolifération de GSC. Centrifugez les plaques à 1 500 fois g à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, placez immédiatement les cultures à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, pour analyser les puits de contrôle à la recherche de fuites de colorant vital, ensemencez les cellules GSC comme décrit précédemment, centrifugez la plaque, puis incubez les cultures à 37 degrés Celsius pendant une heure. Centrifugez la plaque à 96 puits contenant uniquement des mitochondries. Ensuite, aspirez le milieu de la plaque à puits GSC 96 et remplacez-le par le surnageant mitochondrial.

Incuber les CSG avec le surnageant mitochondrial, à 37 degrés Celsius, pendant deux heures. Enfin, effectuez l’analyse du transfert de mitochondries, l’analyse FACS et l’imagerie confocale selon le protocole texte. Les GSC sont des cellules souches cancéreuses cultivées sous forme de neurosphères pour préserver leurs propriétés de cellules souches.

Juste avant le transfert mitochondrial, ils sont ensemencés en tant que cellules uniques pour permettre une efficacité élevée du transfert des mitochondries et le lendemain, comme indiqué ici, les cellules sont à nouveau observées en train de former des neurosphères. Sur cette figure, des mitochondries MSC marquées par fluorescence peuvent être observées localisées à l’intérieur des GSCs Gb4. Les mitochondries MSC apparaissent dans toutes les GSC de la même manière que les mitochondries GSC.

Le transfert de mitochondries de CSM a pu être observé pour la plupart des CSG dans la reconstruction 3D à partir d’images confocales de CSG confirmant la localisation intercellulaire des mitochondries de CSM transférées. Le pré-marquage des CSG avec des colorants vitaux mitochondriaux bleus et rouges a permis de visualiser la localisation des mitochondries de CSM transférées en vert par rapport aux mitochondries endogènes de la CSG. Comme le montre ici, MitoCeption avec des quantités croissantes de mitochondries MSC fluorescentes a conduit à une augmentation des signaux FACS et avec plusieurs ordres de grandeur supérieurs au signal de contrôle.

Le protocole de transfert de mitochondries présenté ici, réalisé sur des GSC unicellulaires, a montré une réponse dose-dépendante et une intensité de fluorescence moyenne relative. Enfin, bien que le transfert de mitochondries des CSM ait également été réalisé sur les neurosphères des CSG, l’efficacité du transfert vers les CSG dans ces conditions était plus faible que celle des mitochondries transférées vers les CSG d’abord ensemencées en tant que cellules uniques. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures si elle est exécutée correctement.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de garder la préparation des mitochondries sur la glace à tout moment. Suite à ces procédures, d’autres méthodes telles que la FACS, la microscopie confocale, la QPCR sur l’ADN mitochondrial peuvent être réalisées afin de visualiser et de quantifier le transfert mitochondrial des CSM vers les cellules cibles. Des études fonctionnelles peuvent également être effectuées pour déterminer les effets biologiques des mitochondries transférées.

Gardez à l’esprit que ces études seront généralement réalisées avec des quantités de mitochondries inférieures à celles utilisées pour visualiser le transfert de mitochondries. Cette technique permettra d’explorer l’issue et les effets biologiques des mitochondries qui sont transférées spontanément entre les cellules dans des conditions physiologiques normales ou pathologiques, et contribuera ainsi à développer de nouveaux traitements thérapeutiques.