Isolement des mitochondries Intact du muscle squelettique par centrifugation différentielle pour respirométriques mesures haute résolution

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les mitochondries des muscles squelettiques par centrifugation différentielle et de déterminer les fréquences respiratoires des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale I, II et IV.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine bioénergétique mitochondrial telles que les maladies et les syndromes associés au dysfonctionnement mitochondrial, tels que diverses maladies neurologiques, la septicémie et les troubles liés à l’âge. Le principal avantage de cette technique est l’absence de la plupart des facteurs cytologiques dans la préparation mitochondriale isolée, ce qui peut interférer avec l’analyse des fonctions mitochondriales. Sandra Nansoz, la technicienne de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Pour commencer cette procédure, procurez-vous un bécher d’échantillons de muscles squelettiques comme indiqué dans le protocole de texte. Placez le bécher sur un seau à glace. À l’aide de ciseaux fins, coupez le muscle en morceaux d’un à deux millimètres.

Ensuite, rincez le mouchoir haché deux fois avec un tampon d’isolation glacé en utilisant 20 millilitres pour chaque lavage. Suspendez le tissu lavé dans 10 millilitres de tampon d’isolement par gramme de tissu, puis ajoutez cinq milligrammes de tissu protéase-G. Placez ensuite le bécher dans un bain de glace à l’aide d’un agitateur magnétique et remuez pendant 10 minutes.

Après cela, diluez la suspension avec 10 millilitres supplémentaires de tampon d’isolement complété par 0,2 % de BSA dégraissé par gramme de tissu. Ensuite, décantez tout le tampon d’isolement du bécher. Lavez le mouchoir deux fois avec un tampon d’isolation glacé complété par 0,2 % de BSA en utilisant 20 millilitres pour chaque lavage.

Ensuite, mettez à nouveau le tissu en suspension dans 10 millilitres de tampon d’isolement supplémenté en BSA par gramme de tissu. Utilisez un homogénéisateur de verre semi-automatique avec un pilon mal ajusté pour homogénéiser le tissu. Ensuite, transférez l’homogénat dans un tube de centrifugation et centrifugez-le à 10 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

À l’aide d’une pipette sérologique, jeter le surnageant. Remettez la pastille en suspension avec 10 millilitres de milieu d’isolement glacé supplémenté en BSA par gramme de tissu. Centrifugez la suspension à 350 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Après cela, utilisez une pipette sérologique pour réserver le surnageant, en jetant la pastille. Filtrez le surnageant dans un bécher maintenu sur de la glace à travers deux couches de gaze. Transférez la suspension filtrée dans un tube à centrifuger et centrifugez 7 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Jetez ensuite le surnageant. Remettez en suspension la pastille mitochondriale brute dans cinq millilitres de tampon d’isolement supplémenté en BSA par gramme de tissu. Centrifugez cette suspension 7 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 20 millilitres de tampon de lavage. Centrifugeuse à 7 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Répétez cette procédure de remise en suspension et de centrifugation une fois de plus.

Après cela, jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de tampon de lavage. Déterminez la concentration en protéines à l’aide de n’importe quelle méthode standard. Ensuite, conservez la suspension mitochondriale concentrée sur de la glace jusqu’à ce qu’elle soit prête à effectuer des tests de respirométrie.

Pour commencer, mettez à nouveau le concentré mitochondrial en suspension dans le tampon respiratoire jusqu’à une concentration finale de 0,4 milligramme par millilitre de protéine mitochondriale. Ensuite, aspirez le milieu respiratoire de la chambre d’oxygraphe calibrée à l’air. Ajouter 2,1 millilitres de suspension mitochondriale isolée.

Insérez un bouchon pour fermer la chambre d’oxygraphe. Ensuite, agitez la suspension mitochondriale en continu à 700 tr/min à 37 degrés Celsius. Enregistrez la respiration cellulaire au départ pendant trois à cinq minutes jusqu’à ce qu’un signal de flux d’oxygène stable soit atteint.

Pour commencer une respiration complexe dépendante de l’I, injectez 12,5 microlitres de malate 0,8 molaire dans une chambre d’oxygraphe préparée avec la suspension mitochondriale isolée à travers l’orifice d’injection de titane du bouchon. Ensuite, injectez 10 microlitres de glutamate à deux molaires. Enregistrez la respiration cellulaire pendant trois à cinq minutes jusqu’à ce qu’un signal de flux d’oxygène stable soit atteint.

Après cela, injectez 10 microlitres d’ADP de 0,05 molaire dans la chambre par l’orifice d’injection. Enregistrez la respiration cellulaire jusqu’à ce que le signal de flux d’oxygène augmente, puis diminue et se stabilise. Pour la respiration dépendante du complexe II, injectez deux microlitres de roténone millimolaire de 0,2 millimolaire dans une chambre d’oxygraphe préparée avec une suspension mitochondriale isolée.

Enregistrez la respiration cellulaire jusqu’à ce qu’un signal de flux d’oxygène stable soit obtenu. Ensuite, injectez 20 microlitres d’une molaire de succinate. Enregistrez la respiration cellulaire jusqu’à ce qu’un signal de flux d’oxygène stable soit obtenu.

Après cela, injectez 10 microlitres d’ADP de 0,05 molaire dans la chambre par l’orifice d’injection. Enregistrez la respiration cellulaire jusqu’à ce que le signal de flux d’oxygène augmente, puis diminue et se stabilise. Pour la respiration complexe dépendante de l’IV, injectez 2,5 microlitres d’ascorbate de 0,8 millimolaire dans une chambre d’oxygraphe préparée avec une suspension mitochondriale isolée.

Ensuite, injectez immédiatement 2,5 microlitres de TMPD 0,2 molaire et 10 microlitres d’ADP 0,05 molaire. Enregistrez la respiration cellulaire jusqu’à ce qu’un signal de flux d’oxygène stable soit obtenu. Ensuite, injectez 10 microlitres d’azoture de sodium molaire.

Enregistrez la respiration cellulaire jusqu’à ce que le signal de flux d’oxygène diminue, puis se stabilise. Dans cette étude, des mitochondries intactes sont isolées du muscle squelettique. Les fréquences respiratoires complexes dépendantes de l’I sont ensuite mesurées par respirométrie à haute résolution.

Comme on peut le voir, le taux de respiration mitochondriale augmente immédiatement lors de l’ajout d’ADP. Le taux respiratoire diminue après l’épuisement de l’ADP à des niveaux similaires à ceux observés avant l’ajout d’ADP. Cela indique que le rapport entre l’état 3 et l’état 4, connu sous le nom de rapport de contrôle respiratoire, ou RCR, est élevé et que l’intégrité mitochondriale est bien préservée pendant la procédure d’isolement.

Les fréquences respiratoires dépendantes du complexe II sont ensuite observées en inhibant la respiration du complexe I avec de la roténone et en injectant le succinate de substrat du complexe II. L’ADP est ensuite ajouté, ce qui entraîne une augmentation immédiate de la respiration. Une fois que l’ADP est épuisée, la respiration diminue à des niveaux similaires à ceux observés avant l’ajout d’ADP, indiquant un RCR élevé, en ce sens que l’intégrité mitochondriale est bien préservée pendant l’isolement.

Des taux de respiration complexes dépendants de l’IV sont observés en ajoutant de l’ascorbate, du TMPD et de l’ADP. L’azoture de sodium est ensuite ajouté pour inhiber le complexe IV.La différence de consommation d’oxygène avant et après l’ajout d’azoture de sodium est interprétée comme la respiration IV complexe réelle. Le taux de respiration complexe élevé dépendant de l’IV observé dans l’état 3 indique que l’intégrité mitochondriale est préservée pendant la procédure d’isolement.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins d’une heure et demie si elle est bien exécutée. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’effectuer un étalonnage des capteurs d’oxygène à l’avance avant l’homogénéisation. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que les mesures du contenu cellulaire en ADP, du potentiel de membrane mitochondriale, de l’activité enzymatique de l’ATP synthase en tant que niveaux de substrat peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que si les changements de fréquences respiratoires sont dus à un manque de substrat mitochondrial, au potentiel membranaire ou à une activité enzymatique réduite de l’ATP synthase.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les mitochondries d’un muscle squelettique par centrifugation différentielle et de mesurer les fréquences respiratoires des complexes mitochondriaux I, II et IV à l’aide de la respirométrie à haute résolution. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du métabolisme énergétique mitochondrial pour explorer la fonction énergétique des mitochondries dans des domaines tels que les maladies mitochondriales génétiques, les myopathies, les lésions de reperfusion d’ischémie dans les mitochondries isolées. N’oubliez pas que travailler avec de l’antimycine A, de la roténone, de l’azoture de sodium et du FCCP peut être extrêmement dangereux.

Et des précautions telles que le port de gants et de blouses de laboratoire doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.