Isolement des mitochondries Intact du muscle squelettique par centrifugation différentielle pour respirométriques mesures haute résolution

L'objectif général de cette procédure est d'isoler les mitochondries du muscle squelettique par centrifugation différentielle et de déterminer les taux respiratoires des complexes I, II et IV de la chaîne respiratoire mitochondriale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la bioénergétique mitochondriale, notamment les maladies et syndromes associés au dysfonctionnement mitochondrial, tels que diverses maladies neurologiques, la septicémie et les troubles liés à l'âge. Le principal avantage de cette technique réside dans l'absence de la plupart des facteurs cytochimiques dans l'préparation mitochondriale isolée, qui pourraient interférer avec l'analyse des fonctions mitochondriales. La démonstration de la procédure sera assurée par Sandra Nansoz, technicienne de mon laboratoire.

Pour commencer cette procédure, procurez-vous un bécher contenant des échantillons de tissu musculaire squelettique, comme décrit dans le protocole écrit. Placez le bécher dans un seau à glace. À l’aide de ciseaux fins, hachez le muscle en morceaux d’une à deux millimètres de taille.

Ensuite, rincez le tissu haché deux fois avec 20 millilitres de tampon d'isolement glacé pour chaque lavage. Suspendez le tissu lavé dans 10 millilitres de tampon d'isolement par gramme de tissu, puis ajoutez cinq milligrammes de protéase-G tissulaire. Placez ensuite le bécher dans un bain de glace muni d'un agitateur magnétique et agitez pendant 10 minutes.

Après cela, diluez la suspension avec 10 millilitres supplémentaires de tampon d'isolement enrichi avec 0,2 % de BSA désengraissée par gramme de tissu. Ensuite, versez délicatement tout le tampon d'isolement hors du bécher. Lavez le tissu deux fois avec du tampon d'isolement froid sur glace enrichi avec 0,2 % de BSA, en utilisant 20 millilitres pour chaque lavage.

Ensuite, resuspendre le tissu dans 10 millilitres de tampon d'isolement enrichi en BSA par gramme de tissu. Utiliser un homogénéisateur en verre semi-automatique muni d'un piston à ajustement lâche pour homogénéiser le tissu. Puis, transférer l'homogénat dans un tube de centrifugation et centrifuger à 10 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

À l’aide d’une pipette serologique, éliminer le surnageant. Résuspendre le culot avec 10 millilitres de milieu d’isolement supplémenté en BSA, froid sur glace, par gramme de tissu. Centrifuger la suspension à 350 ×g pendant 10 minutes à 4 °C.

Après cela, utilisez une pipette serologique pour prélever le surnageant, en éliminant le culot. Filtrez le surnageant dans un bécher placé sur de la glace à travers deux couches de gaze. Transférez la suspension filtrée dans un tube de centrifugation et centrifugez à 7 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, jetez le surnageant. Resuspendez le culot mitochondrial brut dans cinq millilitres de tampon d'isolement enrichi en BSA par gramme de tissu. Centrifugez cette suspension à 7 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, jetez le surnageant et re-suspendez le culot dans 20 millilitres de tampon de lavage. Faites centrifuger à 7 000 ×g pendant 10 minutes à 4 °C. Répétez une fois cette étape de re-suspension et de centrifugation.

Après cela, éliminer le surnageant et re-suspendre le culot dans un millilitre de tampon de lavage. Déterminer la concentration en protéines à l’aide de toute méthode standard. Ensuite, conserver la suspension mitochondriale concentrée sur de la glace jusqu’au moment de réaliser les essais de respirométrie.

Pour commencer, re-suspendre le concentré mitochondrial dans le tampon de respiration afin d'obtenir une concentration finale de 0,4 milligramme par millilitre de protéine mitochondriale. Ensuite, aspirer le milieu de respiration de la chambre d'oxymètre calibrée à l'air. Ajouter 2,1 millilitres de suspension mitochondriale isolée.

Insérez un bouchon pour fermer la chambre de l'oxygraphe. Ensuite, agitez continuellement la suspension mitochondriale à 700 tr/min à 37 degrés Celsius. Enregistrez la respiration cellulaire au niveau de base pendant trois à cinq minutes jusqu'à l'obtention d'un signal stable de flux d'oxygène.

Pour commencer la respiration dépendante du complexe I, injecter 12,5 microlitres de malate 0,8 molaire dans une chambre d'oxymétrie préparée avec la suspension mitochondriale isolée, en passant par le port d'injection en titane du bouchon. Ensuite, injecter 10 microlitres de glutamate 2 molaire. Enregistrer la respiration cellulaire pendant trois à cinq minutes jusqu'à l'obtention d'un signal stable de flux d'oxygène.

Après cela, injecter 10 microlitres de 0,05 molaire de ADP dans la chambre par le port d'injection. Enregistrer la respiration cellulaire jusqu'à ce que le signal de flux d'oxygène augmente, diminue, puis se stabilise. Pour la respiration dépendante du complexe II, injecter deux microlitres de rotenone à 0,2 millimolaire dans une chambre d'oxymétrie préparée avec une suspension de mitochondries isolées.

Enregistrez la respiration cellulaire jusqu'à l'obtention d'un signal stable de flux d'oxygène. Ensuite, injectez 20 microlitres de succinate à une concentration d'un molaire. Enregistrez la respiration cellulaire jusqu'à l'obtention d'un signal stable de flux d'oxygène.

Après cela, injectez 10 microlitres de 0,05 molaire de ADP dans la chambre par le port d'injection. Enregistrez la respiration cellulaire jusqu'à ce que le signal du flux d'oxygène augmente, diminue, puis se stabilise. Pour la respiration dépendante du complexe IV, injectez 2,5 microlitres de 0,8 millimolaire d'ascorbate dans une chambre oxygraphique préparée avec une suspension mitochondriale isolée.

Ensuite, injectez immédiatement 2,5 microlitres de TMPD 0,2 molaire et 10 microlitres de DPA 0,05 molaire. Enregistrez la respiration cellulaire jusqu'à l'obtention d'un signal stable de flux d'oxygène. Puis, injectez 10 microlitres d'azoture de sodium 1 molaire.

Enregistrez la respiration cellulaire jusqu'à ce que le signal de flux d'oxygène diminue, puis se stabilise. Dans cette étude, des mitochondries intactes sont isolées à partir de muscle squelettique. Les taux respiratoires dépendants du complexe I sont ensuite mesurés par respirométrie à haute résolution.

Comme on peut le constater, le taux de respiration mitochondriale augmente immédiatement après l'ajout d'ADP. Le taux de respiration diminue après l'épuisement de l'ADP jusqu'à des niveaux similaires à ceux observés avant l'ajout d'ADP. Cela indique que le rapport entre l'état 3 et l'état 4, appelé rapport de contrôle respiratoire ou RCR, est élevé et que l'intégrité mitochondriale est bien préservée au cours de la procédure d'isolement.

Les taux respiratoires dépendants du complexe II sont ensuite observés en inhibant la respiration du complexe I à l’aide de roténone et en ajoutant le substrat du complexe II, le succinate. L’ADP est ensuite introduite, provoquant une augmentation immédiate de la respiration. Une fois l’ADP épuisée, la respiration diminue jusqu’à des niveaux comparables à ceux observés avant l’ajout d’ADP, indiquant un taux de contrôle respiratoire (RCR) élevé, ce qui signifie que l’intégrité mitochondriale est bien préservée durant l’isolement.

Les taux de respiration dépendants du complexe IV sont observés en ajoutant de l'ascorbate, du TMPD et de l'ADP. De l'azoture de sodium est ensuite ajouté pour inhiber le complexe IV. La différence de consommation d'oxygène avant et après l'ajout d'azoture de sodium est interprétée comme la respiration réelle du complexe IV. Le taux élevé de respiration dépendante du complexe IV observé en état 3 indique que l'intégrité mitochondriale est bien préservée au cours de la procédure d'isolement.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins d'une heure et demie si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'étalonner les capteurs d'oxygène à l'avance, avant l'homogénéisation. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la mesure de la teneur cellulaire en ADP, du potentiel membranaire mitochondrial, de l'activité enzymatique de l'ATP synthase ou des niveaux de substrats peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme savoir si les variations des taux respiratoires sont dues à un manque de substrat mitochondrial, de potentiel membranaire ou à une activité enzymatique réduite de l'ATP synthase.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler des mitochondries à partir d’un muscle squelettique par centrifugation différentielle et comment mesurer les taux respiratoires des complexes mitochondriaux I, II et IV à l’aide d’une respirométrie à haute résolution. Depuis son développement, cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine du métabolisme énergétique mitochondrial d’étudier la fonction énergétique des mitochondries dans des domaines tels que les maladies mitochondriales génétiques, les myopathies et les lésions dues à l’ischémie-reperfusion, sur des mitochondries isolées. N’oubliez pas que manipuler l’antimycine A, la roténone, l’azoture de sodium et le FCCP peut être extrêmement dangereux.

Et des précautions telles que le port de gants et de blouses de laboratoire doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.