Name: Isolement des mitochondries Intact du muscle squelettique par centrifugation différentielle pour respirométriques mesures haute résolution (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Découvrez l'isolement de mitochondries intactes du muscle squelettique par centrifugation différentielle pour mesurer les taux respiratoires des complexes I, II et IV par respirométrie haute résolution.

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Cette étude a été soutenue par le Fonds national suisse (Subvention 32003B_127619).

La biopsie du muscle quadriceps est prélevé à partir d&#39;un porc anesthésié, à partir de laquelle les mitochondries sont isolées par centrifugation différentielle. Le cochon est utilisé par la suite pour une autre expérience. L&#39;étude est réalisée en conformité avec les National Institutes of Health des lignes directrices pour les soins et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire et avec l&#39;approbation du Comité du canton de Berne, Suisse Animal Care. 1. Skeletal Homogénéisation musculaire et mitochondrial Isolation <ol><li> Accise 5-10 échantillon g quadriceps musculaires à partir d&#39; un porc anesthésié. Dans le présent essai, utilisez le muscle squelettique porcin. Ce protocole peut également être utilisé pour isoler les mitochondries à partir d&#39; autres espèces (par exemple, le rat, la souris, l&#39; homme, etc.). REMARQUE: Cette étape est effectuée par un médecin spécialiste avec une expertise en chirurgie. <ol><li> porcs rassis avec de la kétamine par voie intramusculaire (20 mg / kg) et de xylazine (2 mg / kg), avant l&#39;anesthésie est induite par intra-midazolam veineuse (0,5 mg / kg, plus atropine 0,02 mg / kg). Maintenir une anesthésie par perfusion continue par voie intraveineuse de propofol (4-8 mg / kg par h) et de fentanyl (30 ug / kg et par heure) pendant une intervention chirurgicale. </li></ol></li><li> Immerger immédiatement l&#39;échantillon de tissu dans un bêcher contenant 20 ml de tampon d&#39;isolement mitochondriale glacé (tableau 1). NOTE: Tampons utilisés pendant l&#39;homogénéisation et centrifugations devraient être de la glace froide et ont un pH physiologique pertinent avec une force ionique et osmotique compatible avec cytosol. </li><li> Peser l&#39;échantillon de tissu dans le bécher sur un équilibre taré analytique. Tarer la balance avec le bêcher contenant 20 ml de tampon d&#39;isolement. </li><li> Placer le bécher sur un seau à glace. REMARQUE: Effectuer toutes les prochaines étapes de la procédure d&#39;homogénéisation à la température de seau à glace et de garder tous les tampons sur le seau à glace. </li><li> Émincer le muscle squelettique dans le bécher (garder sur la glace) dans 1-2 mm de petits morceaux de 3-4 min en utilisant bien Scisseurs. </li><li> Rincer le tissu haché dans le bécher deux fois avec un tampon d&#39;isolement de la glace froide (20 ml de chaque étape de lavage). </li><li> Suspendre le tissu dans 10 volumes de tampon d&#39;isolement par rapport au poids du tissu (g) ​​contenant 5 mg de protéase / g de tissu. </li><li> Placer le bécher dans un bain de glace sur l&#39;agitateur magnétique et agiter pendant 10 min. </li><li> Diluer la suspension dans le bêcher avec 10 volumes supplémentaires du tampon d&#39;isolement par rapport au poids du tissu (g) ​​additionné de 0,2% (poids / volume) d&#39;albumine sérique délipidée bovine (BSA). </li><li> Transvaser la totalité du tampon d&#39;isolement supplémenté avec 0,2% de BSA et rinçage du tissu dans le récipient deux fois avec du tampon d&#39;isolement froid complémenté avec 0,2% de SAB (20 ml à chaque étape de lavage). </li><li> Remettre en suspension le tissu dans 10 volumes de tampon d&#39;isolement par rapport au poids du tissu (g) ​​additionné de 0,2% de BSA dégraissée. </li><li> Homogénéiser le tissu avec un homogénéisateur en verre semi-automatique (conservés sur la glace) avec un pilon ample (10 coups). NOTE: Homogenize le tissu toujours de la même manière (le même nombre de traits, par exemple 10 coups). Un nombre plus élevé de coups peut endommager et découpler les mitochondries. De préférence, l&#39;homogénéisation du tissu à l&#39;aide d&#39;un homogénéiseur automatisé. Manuellement (et subjectivement) les échantillons de tissus homogénéisés dans homogénéisateurs de verre peuvent produire différentes qualités de mitochondries isolées. </li><li> Centrifuger le tissu homogénéisé à 4 ° C pendant 10 min à 10 000 x g. REMARQUE: Toutes les étapes de centrifugation sont effectuées dans des centrifugeuses avec des rotors à angle fixe. </li><li> Jeter le surnageant à l&#39;aide d&#39;une pipette sérologique et resuspendre le culot dans un milieu d&#39;isolement glacé BSA supplémenté (10 ml / g de tissu). </li><li> Centrifuger la suspension à 4 ° C pendant 10 min à 350 x g. </li><li> Réserver le surnageant à l&#39;aide d&#39;une pipette sérologique et jeter le culot (débris cellulaires). </li><li> Filtrer le surnageant dans un bécher (conservé dans la glace) à travers deux couches de gaze (17 fils / cm 2) pour enlever debr cellulaireest. </li><li> Centrifuger la suspension filtrée à 4 ° C pendant 10 min à 7000 x g. </li><li> Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot de mitochondries brut dans le tampon d&#39;isolement (5 ml / g de tissu) additionné de 0,2% (poids / volume) de BSA et centrifuger la suspension à 4 ° C pendant 10 min à 7000 x g. </li><li> Jeter le surnageant et remettre le culot mitochondrial brut dans un tampon de lavage (tableau 1). Centrifuger la suspension à nouveau à 4 ° C pendant 10 min à 7000 x g. </li><li> Jeter le surnageant et remettre le culot mitochondrial brut dans un tampon de lavage et centrifuger la suspension à nouveau à 4 ° C pendant 10 min à 7000 x g. </li><li> Jeter le surnageant et remettre le culot mitochondrial brut dans 1,0 ml de tampon de lavage. </li><li> Déterminer la concentration en protéines de la suspension mitochondriale et de garder la suspension mitochondriale concentrée sur la glace. REMARQUE: La concentration en protéine peut être mesurée en utilisant une méthode standard. </li><li> Juste avantrespirométrie pour les essais, remettre en suspension la suspension mitochondriale dans le tampon de respiration à une concentration finale de 0,4 mg / ml de protéine mitochondriale. </li></ol> 2. haute résolution Respirométrie <ol><li> Pipette 2,1 ml de tampon de respiration (tableau 1) 16 dans une chambre de oxygraphe haute résolution et remuer le tampon en continu en utilisant une barre d&#39;agitation magnétique présent dans la chambre (700 rpm) à 37 ° C pendant 1 h jusqu&#39;à ce qu&#39;un signal de flux stable d&#39;oxygène le capteur d&#39;oxygène polarographique est obtenu. REMARQUE: des électrodes d&#39;oxygène polarographiques à l&#39;intérieur de chaque chambre de oxygraphe mesurer la concentration en oxygène et de calculer la consommation d&#39;oxygène (flux) à l&#39;intérieur de chaque chambre. La concentration en oxygène et le taux de consommation d&#39;oxygène (flux) sont affichés en temps réel en ligne dans un ordinateur en utilisant un logiciel d&#39;acquisition et d&#39;analyse des données. En outre, afin de garantir des résultats précis et fiables, l&#39;oxygène instrumental correction de fond doit êtreeffectuée selon les instructions du fabricant. REMARQUE: avec précision 2,1 ml de tampon respiratoire est ajouté dans la chambre pour l&#39;étalonnage d&#39;un volume de la chambre finale de 2,0 mL après la fermeture des bouchons. </li><li> Effectuer un étalonnage à l&#39;air du capteur d&#39;oxygène polarographique selon les protocoles du fabricant 17. REMARQUE: Lors de l&#39;étalonnage de l&#39;air, avec une phase gazeuse présente, la concentration en oxygène des médias sera équilibrer l&#39;ordre de 15 à 20 min. En fonction de la température, la pression barométrique, et la solubilité de la concentration des médias peut être calculée. </li><li> Après étalonnage à l&#39;air, aspirer le milieu de la respiration de la chambre de oxygraphe et ajouter 2,1 ml de la suspension mitochondriale isolée (0,4 mg / mL de protéine mitochondriale) de l&#39;étape 1.24 dans une chambre du oxygraphe. NOTE: Le volume de tampon de respiration dépend de l&#39;instrument mis en place et le fabricant. Pour la résolution haute respirométrie, 2,1 mL de bu de respirationffer est ajouté dans la chambre pour l&#39;étalonnage d&#39;un volume de la chambre finale de 2,0 mL après la fermeture des bouchons. </li><li> Fermer la chambre de oxygraphe par insertion du bouchon. </li><li> Incorporer la suspension mitochondriale en continu en utilisant une barre d&#39;agitation magnétique présent dans la chambre (700 rpm) à 37 ° C et la respiration cellulaire record à la ligne de base pendant 3-5 min jusqu&#39;à ce qu&#39;un signal de flux d&#39;oxygène stable est atteint. Remarque: la concentration en oxygène et le signal de flux d&#39;oxygène sont affichées en temps réel en ligne sur un ordinateur en utilisant un logiciel pour l&#39; acquisition et l&#39; analyse 17 des données. </li><li> Par la suite, injecter des substrats et des inhibiteurs de la respiration mitochondriale par les orifices des bouchons en utilisant les protocoles standards suivants d&#39;injection de titane. </li></ol> 3. Complexe Respiration I-dépendante <ol><li> Préparer une chambre de oxygraphe contenant la suspension mitochondriale isolée (0,4 mg / ml) suivant le mode opératoire décrit dans les étapes 2,1-2,5 etattendre un signal stable. </li><li> Injecter 12,5 ul de 0,8 M malate (5 mM concentration finale) et 10 ul de 2 M de glutamate (10 mM de concentration finale) dans la chambre de oxygraphe suspension contenant des mitochondries isolées (0,4 mg / ml) à travers l&#39;orifice d&#39;injection de titane du bouchon de chambre et enregistrer la respiration cellulaire pendant 3-5 minutes jusqu&#39;à ce qu&#39;un signal de flux d&#39;oxygène stable soit atteint. NOTE: Toutes les injections dans les étapes suivantes sont effectuées par les ports de bouchons en utilisant des seringues d&#39;injection de titane. </li><li> Injecter 10 ul de 0,05 M d&#39;ADP (0,25 mM) dans la chambre de oxygraphe à travers l&#39;orifice d&#39;injection de titane du bouchon de chambre et enregistrer la respiration mitochondriale jusqu&#39;à ce que le signal de flux d&#39;oxygène augmente, puis diminue et se stabilise (3-5 minutes). NOTE: Le plateau de la respiration après addition d&#39;ADP indique que la concentration d&#39;ADP était élevée et saturante. En fonction de la quantité de mitochondries utilisées au cours de la respiration, la concentration d&#39;ADP doit être titréepour un état 3 consommation d&#39;oxygène stable (respiration maximale). L&#39;addition d&#39;ADP à la suspension mitochondriale va induire une augmentation de la consommation d&#39;oxygène et le signal de flux d&#39;oxygène augmente (état 3 respiration). Après l&#39;ADP est consommée, le signal de flux d&#39;oxygène diminue (état 4 respiration). </li></ol> 4. Complexe de la respiration II-dépendante <ol><li> Préparer une chambre d&#39;oxygraphe suspension contenant des mitochondries isolées (0,4 mg / mL) en suivant la procédure décrite dans les étapes 2.1-2.5 et d&#39;attendre un signal stable. </li><li> Injecter 2 pi de roténone 0,2 mM (0,2 uM) &quot;ATTENTION&quot; dans la chambre de oxygraphe à travers l&#39;orifice d&#39;injection de titane du bouchon de la chambre à l&#39;aide d&#39;une seringue et d&#39;enregistrer la respiration cellulaire pendant 3-5 minutes jusqu&#39;à ce qu&#39;un signal de flux d&#39;oxygène stable soit atteint. NOTE: La roténone est un poison dangereux et peut avoir un impact significatif sur la santé humaine. </li><li> Injecter 20 ul de 1 M de succinate (10 mM) dans le ch oxygrapheambre et enregistrer la respiration mitochondriale pendant 3-5 min jusqu&#39;à ce qu&#39;un signal de flux d&#39;oxygène stable est atteint. </li><li> Injecter 10 ul de 0,05 M d&#39;ADP (0,25 mM) dans la chambre de oxygraphe à travers l&#39;orifice d&#39;injection de titane du bouchon de chambre et enregistrer la respiration cellulaire jusqu&#39;à ce que le signal de flux d&#39;oxygène augmente, stabilise, puis diminue et se stabilise (3-5 minutes). NOTE: L&#39;addition d&#39;ADP à la suspension mitochondriale va induire une augmentation de la consommation d&#39;oxygène et le signal de flux d&#39;oxygène augmente (état 3 respiration). Après l&#39;ADP est consommée, le signal de flux d&#39;oxygène diminue (état 4 respiration). </li></ol> 5. Complexe IV-dépendante Respiration <ol><li> Préparer une chambre d&#39;oxygraphe suspension contenant des mitochondries isolées (0,4 mg / mL) en suivant la procédure décrite dans les étapes 2.1 à 2.5 du protocole et attendre un signal stable. </li><li> Injecter ensuite 2,5 ul de 0,8 mM d&#39;ascorbate (1 mM). Immédiatement après l&#39;injection de 2,5 ul de 0,2M TMPD (0,25 mM) et 10 pi de 0,05 M d&#39;ADP (0,25 mM) dans la chambre de respiration cellulaire et oxygraphe enregistrement jusqu&#39;à ce que le flux d&#39;oxygène signal augmente et se stabilise (3-5 minutes). </li><li> Enfin, l&#39;injection de 10 pl de 1 M d&#39;azoture de sodium (5 mM) &quot;ATTENTION&quot; dans la chambre de oxygraphe et enregistrer la respiration cellulaire jusqu&#39;à ce que le flux d&#39;oxygène diminue de signal et se stabilise. NOTE: L&#39;azoture de sodium est un poison dangereux et peut avoir un impact significatif sur la santé humaine. </li></ol> 6. Cytochrome C test <ol><li> Préparer une chambre d&#39;oxygraphe suspension contenant des mitochondries isolées (0,4 mg / mL) en suivant la procédure décrite dans les étapes 2.1 à 2.5 du protocole et attendre un signal stable. </li><li> Injecter 12,5 ul de 0,8 M malate (5 mM concentration finale) et 10 ul de 2 M de glutamate (10 mM de concentration finale) dans la chambre de oxygraphe suspension contenant des mitochondries isolées (0,4 mg / ml) à travers l&#39;orifice d&#39;injection de titane du bouchon de chambreet enregistrer la respiration cellulaire pendant 3-5 minutes jusqu&#39;à ce qu&#39;un signal de flux d&#39;oxygène stable soit atteint. </li><li> Injecter 10 ul de 0,5 M d&#39;ADP (2,5 mM) dans la chambre de oxygraphe à travers l&#39;orifice d&#39;injection de titane du bouchon de la chambre et l&#39;enregistrement de la respiration mitochondriale jusqu&#39;à ce que le signal de flux d&#39;oxygène augmente, puis diminue et se stabilise (3-5 minutes). </li><li> Enfin, l&#39;injection de 5 ul de 4 mM de cytochrome c (10 uM) dans la chambre de oxygraphe et enregistrer la respiration cellulaire pendant 5 min jusqu&#39;à ce qu&#39;un signal de flux d&#39;oxygène stable soit atteint. </li></ol>

<ol><li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues.+I.+Isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver%3B+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).</li>
<li>Sims, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+metabolically+active+mitochondria+from+rat+brain+and+subregions+using+Percoll+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation.</a> J. Neurochem. 55 (2), 698-707 (1990).</li>
<li>Hartwig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+comparison+between+two+classical+and+a+kit-based+method+for+mitochondria+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation.</a> Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li>
<li>Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+permeabilization+for+the+high-throughput+measurement+of+compartmented+enzyme+activities+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells.</a> Anal. Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat. Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).</li>
<li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62 (4), 1041-1053 (2013).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle%3A+new+perspectives+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1837-1845 (2009).</li>
<li>Vuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+catecholamines+on+hepatic+and+skeletal+muscle+mitochondrial+respiration+after+prolonged+exposure+to+faecal+peritonitis+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Effects of catecholamines on hepatic and skeletal muscle mitochondrial respiration after prolonged exposure to faecal peritonitis in pigs.</a> Innate Immun. 18 (2), 217-230 (2012).</li>
<li>Corrêa, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+in+septic+shock%3A+effects+on+tissue+perfusion%2C+organ+function%2C+and+mitochondrial+respiration+in+a+porcine+model+of+fecal+peritonitis%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II in septic shock: effects on tissue perfusion, organ function, and mitochondrial respiration in a porcine model of fecal peritonitis.</a> Crit. Care Med. 42 (8), e550-e559 (2014).</li>
<li>Jeger, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+response+of+endotoxin+on+hepatocyte+and+muscle+mitochondrial+respiration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro.</a> Biomed Res Int. 2015, 353074(2015).</li>
<li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNicholls%2C+DG+%22Bioenergetics%22">Bioenergetics</a>. 3, Academic Press. San Diego. (2002).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Enzymol.+Relat.+Subj.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 17, 65-134 (1956).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3076726/">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).</li>
<li>Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+phosphorylation+efficiency+and+depression+of+uncoupled+respiration+in+mitochondria+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (20), 11080-11085 (2000).</li>
<li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry%3A+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol. Biol. 810, 25-58 (2012).</li>
<li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PLoS One. 6 (3), e18317(2011).</li>
<li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+functional+impairment+with+aging+is+exaggerated+in+isolated+mitochondria+compared+to+permeabilized+myofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers.</a> Aging Cell. 9 (6), 1032-1046 (2010).</li>
<li>Graham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+crude+mitochondrial+fraction+by+density-gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell.+Biol.+Chapter+3%22%5BJournal%5D)">Purification of a crude mitochondrial fraction by density-gradient centrifugation.</a> Curr. Protoc. Cell. Biol. Chapter 3. 3, (2001).</li>
<li>Franko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+pure+and+functional+mitochondria+from+mouse+tissues+using+automated+tissue+disruption+and+enrichment+with+anti-TOM22+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads.</a> PLoS One. 8 (12), 382392(2013).</li>
<li>Pecinová, A., Drahota, Z., Nůsková, H., Pecina, P., Houštěk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+basic+mitochondrial+functions+using+rat+tissue+homogenates%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates.</a> Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).</li>
<li>Lombardi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+oxidative+phosphorylation+in+skeletal+muscle+mitochondria+subpopulations+in+pig%3A+a+study+using+top-down+elasticity+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Characterisation of oxidative phosphorylation in skeletal muscle mitochondria subpopulations in pig: a study using top-down elasticity analysis.</a> FEBS Lett. 475 (2), 84-88 (2000).</li>
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans la présente étude, nous décrivons un protocole pour isoler de haute qualité, intact et étroitement couplées mitochondries des muscles squelettiques par centrifugation différentielle qui peuvent être utilisés pour des études fonctionnelles telles que haute résolution respirométrie. Afin d&#39;isoler les mitochondries intactes et étroitement couplées, il y a quelques points critiques à prendre en considération dans le présent protocole. Après avoir récolté le tissu osseux, il doit être im...

bioénergétique mitochondrial et les capacités respiratoires peuvent être étudiés non seulement dans des cellules ou des fibres perméabilisées, mais aussi dans les mitochondries isolées. Dans la présente étude, nous décrivons un protocole pour isoler les mitochondries intactes du muscle squelettique en utilisant la centrifugation différentielle pour les mesures de respirométrie à haute résolution. Pour isoler les mitochondries intactes pour respirométrie, le tissu est homogénéisé et les mitochondries sont isolées par un procédé de centrifugation différentielle classique. La méthode de centrifugation différentielle est basée sur centrifugations séquentielles (dans une série de vitesse croissante) des broyats de tissus a été introduit par Pallade et collègues de travail il y a près de 70 ans 1. Le tissu est tout d&#39;abord hachée avec des ciseaux et homogénéisés mécaniquement dans un homogénéisateur en verre avec un pilon ample. Ensuite, l&#39;homogénat est centrifugé à faible vitesse et le culot résultant qui contient du tissu intact, cellulaireles débris et les noyaux sont jetés. Ensuite, on centrifuge le surnageant à plusieurs reprises à grande vitesse, et la fraction enrichie est recueillie mitochondriale. Les avantages de la méthode de centrifugation différentielle pour isoler les mitochondries sont les suivantes: i) la méthode est rapide et mitochondries peut être isolé au sein de 1-1,5 h (expériences respiratoires doivent être effectuées aussi vite que possible); ii) il est peu coûteux; et iii) il est très efficace et les mitochondries obtenues par centrifugation différentielle sont suffisamment pur pour les essais de respirométrie. Les inconvénients de la méthode de centrifugation différentielle pour isoler les mitochondries sont que i) les mitochondries pourraient être endommagés et découplées pendant l&#39;homogénéisation; ii) la contamination des mitochondries avec d&#39;autres composants cellulaires (pouvait être résolu par un nouveau lavage du culot de mitochondries avec des étapes de centrifugation supplémentaires); iii) la possibilité de sélectionner différentes sous - populations mitochondriales, par exemple, au cours de centrifugations différentielles étapes, mitochondria avec dense inférieure peut être exclue 7; et iv) l&#39;entourant cellulaire est absent et que la respiration mitochondriale maximale théorique peut être mesurée. Une autre méthode pour isoler les mitochondries pour les essais de respirométrie est la centrifugation en gradient de densité 2. Dans cette technique, l&#39;extrait de tissu est déposé en couche sur une solution de saccharose ou d&#39;un gradient de Percoll (avec une densité plus élevée au fond du tube de centrifugation) et on centrifuge à une certaine vitesse, ce qui provoque la mitochondrie être isolée des autres composants cellulaires en fonction de leur les densités. Cette méthode est souvent utilisée pour isoler les mitochondries du cerveau avec une très faible contamination par des synaptosomes. Cependant, les mitochondries de foie de rat isolés par centrifugation à gradient de densité sont fortement contaminés par d&#39; autres organelles cellulaires 3. Une des limitations de ce procédé est que le gradient de saccharose présente dans le tube de centrifugation peut se rompre sime mitochondries (choc osmotique). Selon le type de tissu; il y a des facteurs importants à considérer pour l&#39;isolement des mitochondries intactes par centrifugation différentielle. La première nécessité est d&#39;homogénéiser les tissus d&#39;une manière douce. des tissus mous tels que le rein, le cerveau et le foie ont besoin des forces mécaniques appliquées lors de l&#39;homogénéisation douce. Cela contraste avec les tissus durs tels que le muscle cardiaque et squelettique qui nécessitent des forces mécaniques beaucoup plus fortes. Le tissu émincé est habituellement traitée par la protéinase avant l&#39;homogénéisation pour adoucir le tissu. Tous les tampons utilisés lors de l&#39; homogénéisation et la centrifugation doit être refroidi à la glace et ont un pH physiologique pertinent avec une force ionique et osmotique compatible avec cytosol 4, 5. L&#39;un des avantages d&#39;étudier bioénergétique mitochondrial isolé est que les membranes plasmiques cellulaires ne doivent pas être permeabilisées avec des détergents tels que la saponine ou la digitonine 4, 6, ce qui peut compromettre l&#39;intégrité de la membrane externe mitochondriale. Un autre avantage des mitochondries isolées est l&#39;absence d&#39;autres facteurs cytosoliques qui peuvent interférer avec l&#39;analyse des fonctions mitochondriales telles que la consommation d&#39;oxygène. Les inconvénients de l&#39; utilisation des mitochondries isolées sont la sélection éventuelle de certaines populations mitochondriales au cours des étapes de centrifugation, des dommages à la mitochondrie lors de l&#39; homogénéisation, et l&#39;exigence de grandes quantités d&#39;échantillons biologiques afin d&#39;obtenir un bon rendement de mitochondries isolées 7, 8. Après la procédure d&#39;isolement, les taux respiratoires des complexes mitochondriaux I-, II- et IV-dépendants (états 2, 3 et 4) sont déterminées à l&#39;aide à haute résolution respirométrie. Pour complexe conduit I-respiration, glutamateet malate sont ajoutés, suivis de l&#39;adénosine diphosphate (ADP). Pour la respiration complexe entraînée II, succinate est ajouté, suivi par ADP. Pour complexe entraîné IV-respiration, ascorbate et tetramethylphenylendiamine (TMPD) sont ajoutés , suivis par ADP 9, 10, 11, 12. L&#39;état 2 se réfère à la consommation d&#39;oxygène en présence des seuls substrats. Etat 3 se réfère à la consommation d&#39;oxygène en présence de substrats et l&#39;ADP. État 4 se réfère à la consommation d&#39;oxygène après ADP épuisement. Le rapport de contrôle respiratoire (RCR) est un indice de couplage de la production d&#39;ATP de la consommation d&#39;oxygène et est calculé comme le rapport entre l&#39; état 3 et de l&#39; état 4 13, 15. En résumé, nous décrivons un protocole pour isoler les mitochondries des muscles squelettiques et fonctionnelles intactes par centrifugation différentielle et utiliser ces mitochon isolédria pour des études fonctionnelles et bioénergétiques telles que haute résolution respirométrie.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A 4386</td><td>Produit chimique</td></tr><tr><td>Antimycine A</td><td>Sigma</td><td>A 8674</td><td>Produit chimique, dissous dans l’éthanol</td></tr><tr><td>Ascorbate</td><td>Merck</td><td>1.00127</td><td>Produit chimique</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A 7699</td><td>Produit chimique</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A 6003</td><td>Produit chimique</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>fluka</td><td>3779</td><td>Chimique</td></tr><tr><td>Glutamate</td><td>Sigma,G</td> <td>1626</td><td>Produit chimique</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H 7523</td><td>Chimique</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td>Chimique</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>1.04873</td><td>Chimique</td></tr><tr><td>K-lactobionate</td><td>Sigma</td><td>L 2398</td><td>Chimique</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M 9272</td><td>Produit chimique</td></tr><tr><td>Acide morpholinopropane sulfonique (MOPS)</td><td>Merck</td><td>1.06129</td><td>Produit chimique</td></tr><tr><td>O2k-Core : Oxygraph-2k&nbsp ;</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>Instrument de respirométrie à haute résolution</td></tr><tr><td>Protéinase bactérienne</td><td>Sigma</td><td>P 8038</td><td>Produit chimique</td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>Chimique</td></tr><tr><td>Roténone</td><td>Sigma</td><td>R 8875</td><td>Produit chimique, dissous dans l’éthanol</td></tr><tr><td>Succinate</td><td>Sigma</td><td>S 2378</td><td>Produit chimique</td></tr><tr><td>Schuett homogen-plus Homogénéisateur semi-automatique&nbsp ;</td><td>schuett-biotec GmbH</td><td>3.201 011</td><td>Homogénéisateur de tissus</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>T 8691</td><td>Produit chimique</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>Sigma</td><td>T 3134</td><td>Chimique</td></tr></tbody></table>

isolement des mitochondries intact du muscle squelettique par centrifugation différentielle pour respirométriques mesures haute résolution

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

<classe p='jove_content'>Les mitochondries sont impliquées dans le métabolisme énergétique cellulaire et utilisent l’oxygène pour produire de l’énergie sous forme d’adénosine triphosphate (ATP). La centrifugation différentielle à basse et haute vitesse est couramment utilisée pour isoler les mitochondries des tissus et des cellules en culture. Les fractions mitochondriales brutes obtenues par centrifugation différentielle sont utilisées pour les mesures de respirométrie. La technique de centrifugation différentielle est basée sur la séparation des organites en fonction de leur taille et de leur vitesse de sédimentation. L’isolement des mitochondries est effectué immédiatement après le prélèvement tissulaire. Le tissu est immergé dans un milieu d’homogénéisation glacé, haché à l’aide de ciseaux et homogénéisé dans un homogénéisateur en verre avec un pilon amovible. La technique de centrifugation différentielle est efficace, rapide et peu coûteuse et les mitochondries obtenues par centrifugation différentielle sont suffisamment pures pour les tests de respirométrie. Certaines des limites et des inconvénients des mitochondries isolées, basées sur la centrifugation différentielle, sont que les mitochondries peuvent être endommagées pendant la procédure d’homogénéisation et d’isolement et que de grandes quantités de biopsie tissulaire ou de cellules cultivées sont nécessaires pour l’isolement mitochondrial.

Complexe I-dépendante la respiration Taux isolés mitochondrial complexes I-dépendante des voies respiratoires (états 2, 3 et 4) sont déterminées à l&#39; aide à haute résolution respirométrie (Figure 1, un schéma représentant). I substrats complexes mitochondriaux, le glutamate et le malate, sont ajoutés, suivis par l&#39;addition d&#39;ADP. L&#39;état 2 se réfère à la consomm...

Ici, un échantillon de muscle quadriceps est prélevé sur un porc anesthésié et les mitochondries sont isolées par centrifugation différentielle. Ensuite, les fréquences respiratoires des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale I, II et IV sont déterminées à l’aide de la respirométrie à haute résolution.

Isolement des mitochondries Intact du muscle squelettique par centrifugation différentielle pour respirométriques mesures haute résolution

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler les mitochondries du muscle squelettique par centrifugation différentielle et de déterminer les taux respiratoires des complexes I, II et IV de la chaîne respiratoire mitochondriale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la bioénergétique mitochondriale, notamment les maladies et syndromes associés au dysfonctionnement mitochondrial, tels que diverses maladies neurologiques, la septicémie et les troubles liés à l'âge. Le principal avantage de cette technique réside dans l'absence de la plupart des facteurs cytochimiques dans l'préparation mitochondriale isolée, qui pourraient interférer avec l'analyse des fonctions mitochondriales. La démonstration de la procédure sera assurée par Sandra Nansoz, technicienne de mon laboratoire.Pour commencer cette procédure, procurez-vous un bécher contenant des échantillons de tissu musculaire squelettique, comme décrit dans le protocole écrit. Placez le bécher dans un seau à glace. À l’aide de ciseaux fins, hachez le muscle en morceaux d’une à deux millimètres de taille.Ensuite, rincez le tissu haché deux fois avec 20 millilitres de tampon d'isolement glacé pour chaque lavage. Suspendez le tissu lavé dans 10 millilitres de tampon d'isolement par gramme de tissu, puis ajoutez cinq milligrammes de protéase-G tissulaire. Placez ensuite le bécher dans un bain de glace muni d'un agitateur magnétique et agitez pendant 10 minutes.Après cela, diluez la suspension avec 10 millilitres supplémentaires de tampon d'isolement enrichi avec 0,2 % de BSA désengraissée par gramme de tissu. Ensuite, versez délicatement tout le tampon d'isolement hors du bécher. Lavez le tissu deux fois avec du tampon d'isolement froid sur glace enrichi avec 0,2 % de BSA, en utilisant 20 millilitres pour chaque lavage.Ensuite, resuspendre le tissu dans 10 millilitres de tampon d'isolement enrichi en BSA par gramme de tissu. Utiliser un homogénéisateur en verre semi-automatique muni d'un piston à ajustement lâche pour homogénéiser le tissu. Puis, transférer l'homogénat dans un tube de centrifugation et centrifuger à 10 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.À l’aide d’une pipette serologique, éliminer le surnageant. Résuspendre le culot avec 10 millilitres de milieu d’isolement supplémenté en BSA, froid sur glace, par gramme de tissu. Centrifuger la suspension à 350 ×g pendant 10 minutes à 4 °C.Après cela, utilisez une pipette serologique pour prélever le surnageant, en éliminant le culot. Filtrez le surnageant dans un bécher placé sur de la glace à travers deux couches de gaze. Transférez la suspension filtrée dans un tube de centrifugation et centrifugez à 7&nbsp;000&nbsp;×g pendant 10&nbsp;minutes à quatre&nbsp;degrés&nbsp;Celsius.Ensuite, jetez le surnageant. Resuspendez le culot mitochondrial brut dans cinq millilitres de tampon d'isolement enrichi en BSA par gramme de tissu. Centrifugez cette suspension à 7 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.Ensuite, jetez le surnageant et re-suspendez le culot dans 20 millilitres de tampon de lavage. Faites centrifuger à 7 000 ×g pendant 10 minutes à 4 °C. Répétez une fois cette étape de re-suspension et de centrifugation.Après cela, éliminer le surnageant et re-suspendre le culot dans un millilitre de tampon de lavage. Déterminer la concentration en protéines à l’aide de toute méthode standard. Ensuite, conserver la suspension mitochondriale concentrée sur de la glace jusqu’au moment de réaliser les essais de respirométrie.Pour commencer, re-suspendre le concentré mitochondrial dans le tampon de respiration afin d'obtenir une concentration finale de 0,4 milligramme par millilitre de protéine mitochondriale. Ensuite, aspirer le milieu de respiration de la chambre d'oxymètre calibrée à l'air. Ajouter 2,1 millilitres de suspension mitochondriale isolée.Insérez un bouchon pour fermer la chambre de l'oxygraphe. Ensuite, agitez continuellement la suspension mitochondriale à 700 tr/min à 37 degrés Celsius. Enregistrez la respiration cellulaire au niveau de base pendant trois à cinq minutes jusqu'à l'obtention d'un signal stable de flux d'oxygène.Pour commencer la respiration dépendante du complexe I, injecter 12,5 microlitres de malate 0,8 molaire dans une chambre d'oxymétrie préparée avec la suspension mitochondriale isolée, en passant par le port d'injection en titane du bouchon. Ensuite, injecter 10 microlitres de glutamate 2 molaire. Enregistrer la respiration cellulaire pendant trois à cinq minutes jusqu'à l'obtention d'un signal stable de flux d'oxygène.Après cela, injecter 10 microlitres de 0,05 molaire de ADP dans la chambre par le port d'injection. Enregistrer la respiration cellulaire jusqu'à ce que le signal de flux d'oxygène augmente, diminue, puis se stabilise. Pour la respiration dépendante du complexe II, injecter deux microlitres de rotenone à 0,2 millimolaire dans une chambre d'oxymétrie préparée avec une suspension de mitochondries isolées.Enregistrez la respiration cellulaire jusqu'à l'obtention d'un signal stable de flux d'oxygène. Ensuite, injectez 20 microlitres de succinate à une concentration d'un molaire. Enregistrez la respiration cellulaire jusqu'à l'obtention d'un signal stable de flux d'oxygène.Après cela, injectez 10 microlitres de 0,05 molaire de ADP dans la chambre par le port d'injection. Enregistrez la respiration cellulaire jusqu'à ce que le signal du flux d'oxygène augmente, diminue, puis se stabilise. Pour la respiration dépendante du complexe IV, injectez 2,5 microlitres de 0,8 millimolaire d'ascorbate dans une chambre oxygraphique préparée avec une suspension mitochondriale isolée.Ensuite, injectez immédiatement 2,5 microlitres de TMPD 0,2 molaire et 10 microlitres de DPA 0,05 molaire. Enregistrez la respiration cellulaire jusqu'à l'obtention d'un signal stable de flux d'oxygène. Puis, injectez 10 microlitres d'azoture de sodium 1 molaire.Enregistrez la respiration cellulaire jusqu'à ce que le signal de flux d'oxygène diminue, puis se stabilise. Dans cette étude, des mitochondries intactes sont isolées à partir de muscle squelettique. Les taux respiratoires dépendants du complexe I sont ensuite mesurés par respirométrie à haute résolution.Comme on peut le constater, le taux de respiration mitochondriale augmente immédiatement après l'ajout d'ADP. Le taux de respiration diminue après l'épuisement de l'ADP jusqu'à des niveaux similaires à ceux observés avant l'ajout d'ADP. Cela indique que le rapport entre l'état 3 et l'état 4, appelé rapport de contrôle respiratoire ou RCR, est élevé et que l'intégrité mitochondriale est bien préservée au cours de la procédure d'isolement.Les taux respiratoires dépendants du complexe II sont ensuite observés en inhibant la respiration du complexe I à l’aide de roténone et en ajoutant le substrat du complexe II, le succinate. L’ADP est ensuite introduite, provoquant une augmentation immédiate de la respiration. Une fois l’ADP épuisée, la respiration diminue jusqu’à des niveaux comparables à ceux observés avant l’ajout d’ADP, indiquant un taux de contrôle respiratoire (RCR) élevé, ce qui signifie que l’intégrité mitochondriale est bien préservée durant l’isolement.Les taux de respiration dépendants du complexe IV sont observés en ajoutant de l'ascorbate, du TMPD et de l'ADP. De l'azoture de sodium est ensuite ajouté pour inhiber le complexe IV. La différence de consommation d'oxygène avant et après l'ajout d'azoture de sodium est interprétée comme la respiration réelle du complexe IV. Le taux élevé de respiration dépendante du complexe IV observé en état 3 indique que l'intégrité mitochondriale est bien préservée au cours de la procédure d'isolement.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins d'une heure et demie si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'étalonner les capteurs d'oxygène à l'avance, avant l'homogénéisation. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la mesure de la teneur cellulaire en ADP, du potentiel membranaire mitochondrial, de l'activité enzymatique de l'ATP synthase ou des niveaux de substrats peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme savoir si les variations des taux respiratoires sont dues à un manque de substrat mitochondrial, de potentiel membranaire ou à une activité enzymatique réduite de l'ATP synthase.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler des mitochondries à partir d’un muscle squelettique par centrifugation différentielle et comment mesurer les taux respiratoires des complexes mitochondriaux I, II et IV à l’aide d’une respirométrie à haute résolution. Depuis son développement, cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine du métabolisme énergétique mitochondrial d’étudier la fonction énergétique des mitochondries dans des domaines tels que les maladies mitochondriales génétiques, les myopathies et les lésions dues à l’ischémie-reperfusion, sur des mitochondries isolées. N’oubliez pas que manipuler l’antimycine A, la roténone, l’azoture de sodium et le FCCP peut être extrêmement dangereux.Et des précautions telles que le port de gants et de blouses de laboratoire doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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Ce protocole décrit une procédure pour étudier la respiration des mitochondries isolées de muscles squelettiques. Cette méthode a été adaptée à partir...

Isolement mitochondriale du muscle squelettique

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