Sublimation de DAN Matrice pour la détection et la visualisation des gangliosides dans Rat Tissue Brain MALDI Imaging Mass Spectrometry

L’objectif global de ce protocole de sublimation est de fournir un processus de préparation d’échantillons détaillé et facile à suivre, pour la détection des gangliosides dans les expériences de spectrométrie de masse par imagerie MALDI. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie, y compris la distribution anatomique et la fonction des gangliosides, à la fois dans le cerveau sain et dans la pathologie cérébrale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être adaptée pour l’imagerie de haute qualité de nombreuses espèces lipidiques, peu de modifications du protocole.

Pour commencer cette procédure, extrayez le tissu cérébral du rat et préparez-vous au cryostat comme décrit dans le protocole textuel. Positionnez ensuite le tissu dans le cryostat. Sectionnez le tissu jusqu’à l’emplacement anatomique souhaité.

Assurez-vous que l’épaisseur de coupe est comprise entre huit et 12 microns. À l’aide de la barre anti-roulis du cryostat, sectionnez lentement une section de tissu aplatie. Des trous ou des marques sur le tissu peuvent se produire si le placement de l’arceau de sécurité est incorrect ou si la lame est émoussée.

Déplacez le tissu au centre de la plate-forme de tranchage à l’aide de pinceaux propres. Pour cartographier le tissu, congelez des lames conductrices ou des plaques métalliques en les plaçant dans le cryostat pendant le tranchage. Lorsque la lame est complètement gelée, déplacez avec précaution le tissu de la section sur le service conducteur de la lame à l’aide de pinceaux propres.

Une fois que toutes les sections de tissu sont correctement positionnées sur la lame, placez un doigt sous la lame opposée au tissu et appuyez jusqu’à ce que la section décongèle. Placez ensuite les lames avec le mouchoir dans un dessiccateur pendant cinq à 10 minutes. Vous pouvez également utiliser une lame chaude et la presser légèrement, côté conducteur vers le bas, contre les sections de tissu aplaties.

En travaillant dans la hotte, placez un bain de sable dans un récipient en aluminium sur une plaque chauffante. La plaque chauffante doit être sur un élévateur à ciseaux en métal de la surface appropriée. Allumez la plaque chauffante et réglez la température sur 140 degrés Celsius.

Utilisez la sonde de retour de température pour surveiller la température du sable tout au long de l’expérience et assurer la constance de la température. Ensuite, placez 300 milligrammes de matrice DAN sur la surface inférieure de l’appareil de sublimation. Étalez la matrice en une couche uniforme au centre de l’appareil jusqu’à la largeur et la longueur approximatives de la lame à sublimer.

Placez une plaque métallique sur la surface intérieure de l’appareil, la plaque étant en contact direct avec le fond du condenseur. Collez une lame de test vierge en diagonale sur la surface de la plaque métallique, avec un ruban adhésif placé sur les bords extérieurs de la diapositive. Connectez les parties supérieure et inférieure de l’appareil avec un joint torique en caoutchouc au milieu pour assurer une étanchéité complète.

Placez un joint en U métallique autour du centre de l’appareil et serrez les étaux jusqu’à ce que les moitiés supérieure et inférieure de l’appareil soient bien scellées. Placez ensuite l’appareil dans le joint torique métallique autour du bain de sable. Ensuite, placez une poignée de glace pilée dans le condenseur.

Remplissez le condenseur au quart à la moitié avec de l’eau froide pour créer de la neige fondue. La neige fondue refroidira la plaque métallique à l’intérieur de l’appareil, puis la diapositive y adhérera. Attendez au moins cinq minutes pour que la température atteigne un état stable.

Ensuite, versez 300 ml de méthanol dans le récipient à piège froid et placez la verrerie dans le récipient. Connectez la pompe à vide à la sortie du piège à froid à l’aide d’un tube en caoutchouc. Utilisez un autre morceau de tube en caoutchouc pour connecter l’entrée du piège à froid à l’appareil de sublimation.

Assurez-vous que le tube est bien fixé à l’aide de pinces métalliques. Utilisez la pompe à vide pour fournir un vide de 30 à 50 millitorr. Laissez les pompes fonctionner pendant au moins cinq minutes pour l’équilibrage de la pression.

Déposez deux à trois petits morceaux de glace sèche dans l’éthanol, au fond du récipient du piège froid. Le piège à froid permet d’empêcher l’accumulation de particules matricielles dans la pompe à vide. Les étaux sur le joint en U de l’appareil de sublimation peuvent avoir besoin d’être resserrés une fois la pompe à vide allumée en raison de la diminution de la pression dans l’appareil.

Assurez-vous que la température du bain de sable s’est stabilisée à 140 degrés Celsius. Vérifiez également que le vide est allumé et que l’appareil est fixé dans le joint torique métallique au-dessus du bain de sable avec tous les tubes connectés. Réglez la minuterie sur sept minutes, mais ne démarrez pas la minuterie.

Soulevez lentement l’élévateur à ciseaux et le bain de sable jusqu’à l’appareil de sublimation jusqu’à ce que le joint en U du sublimateur soit bien au-dessus du joint torique métallique. Cet espace supplémentaire permet d’ajuster l’appareil sur le sable. Appuyez rapidement et doucement sur le sublimateur sur la surface du sable pour vous assurer que l’appareil repose uniformément sur le sable.

Et puis, démarrez immédiatement la minuterie. Lorsque la minuterie sonne, éteignez la pompe à vide et abaissez délicatement l’élévateur à ciseaux jusqu’à ce que le sublimateur ne touche plus le bain de sable et repose solidement dans le joint torique métallique. Desserrez lentement la valve du micro-évent pour relâcher la pression dans l’appareil.

Desserrez la pince métallique autour du tube en caoutchouc de l’appareil de sublimation et commencez lentement à desserrer le tube. Une fois que le tube en caoutchouc a été légèrement desserré, pliez le tube d’un côté pour permettre à la pression résiduelle de s’échapper. Lorsque la pression ambiante revient, retirez avec précaution le tube en caoutchouc de l’appareil de sublimation.

Ensuite, desserrez les étaux sur le joint en U de l’appareil et retirez-les. Séparez soigneusement les deux moitiés de l’appareil de sublimation et retirez la diapositive du haut de la verrerie intérieure. Examinez la diapositive pour confirmer une distribution uniforme de la matrice.

Si la distribution et la quantité de matrice sublimée sont suffisantes, collez une nouvelle lame avec du tissu à l’intérieur du sublimateur et répétez le processus de sublimation. Procédez à l’imagerie et à l’analyse comme décrit dans le protocole texte. Le spectre de masse affiche l’abondance ionique des anolytes dans une gamme de masse de 1000 à 2000

Les principaux gangliosides de la série A sont étiquetés le long du spectre. Voici l’image moléculaire correspondante des gangliosides dans le cerveau du rat. L’image moléculaire montre la distribution anatomique de plusieurs espèces de gangliosides grâce à un codage couleur, qui a été superposé et pseudo-coloré à l’aide du logiciel ImageJ.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent éprouver des difficultés, car il existe de nombreuses variables dans le processus de préparation des échantillons qui peuvent influencer la qualité des résultats de l’IMS qui sont souvent omises dans les protocoles rapportés. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de surveiller la quantité de matrice sublimée après chaque expérience et de modifier le temps de sublimation en conséquence pour la lame. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer le rôle des lipides membranaires tels que les gangliosides, après une lésion cérébrale, la maladie de Ner-Jone et le processus naturel de vieillissement.

Cette méthode peut donner un aperçu de l’abondance et de la distribution anatomique des lipides dans le cerveau, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, y compris les tissus à l’extérieur du cerveau, et même des modèles de plantes et d’insectes. Travailler avec des racines endommagées peut être extrêmement dangereux et des précautions telles que des gants, des masques et une protection oculaire doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.