Name: Cartographie des interactions ARN-ARN à léchelle mondiale à laide de psoralène biotinylé (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Découvrez la méthode SPLASH pour cartographier les interactions ARN-ARN à l'échelle génomique in vivo. Cette technique à haut débit permet d'étudier les dynamiques des ARN dans la levure, les bactéries et les cellules humaines.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions les membres du laboratoire Wan et du laboratoire Nagarajan pour des discussions informatives. N. Nagarajan est soutenu par un financement de A * STAR. Y.Wan est soutenu par le financement de A * STAR et Society in Science-Branco Weiss Fellowship.

<ol><li>Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+transcriptome+through+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Genet%22%5BJournal%5D)">Understanding the transcriptome through RNA structure.</a> Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).</li>
<li>Kertesz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+measurement+of+RNA+secondary+structure+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast.</a> Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Measurement+of+RNA+Folding+Energies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies.</a> Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).</li>
<li>Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+RNA+structure+using+nuclease+digestion+and+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing.</a> Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+and+variation+of+RNA+secondary+structure+across+the+human+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome.</a> Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).</li>
<li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+imprints+in+vivo+decode+RNA+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms.</a> Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+profiling+of+RNA+secondary+structure+reveals+novel+regulatory+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features.</a> Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).</li>
<li>Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+probing+of+RNA+structure+reveals+active+unfolding+of+mRNA+structures+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo.</a> Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).</li>
<li>Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking%2C+ligation%2C+and+sequencing+of+hybrids+reveals+RNA-RNA+interactions+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).</li>
<li>Sugimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hiCLIP+reveals+the+in+vivo+atlas+of+mRNA+secondary+structures+recognized+by+Staufen+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1.</a> Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).</li>
<li>Engreitz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-RNA+interactions+enable+specific+targeting+of+noncoding+RNAs+to+nascent+Pre-mRNAs+and+chromatin+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites.</a> Cell. 159 (1), 188-199 (2014).</li>
<li>Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+determination+of+RNA+structure+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation.</a> Nat.Biotechnol. , (2015).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Duplex+Map+in+Living+Cells+Reveals+Higher-Order+Transcriptome+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure.</a> Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).</li>
<li>Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O'Hanlon, D., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Mapping+of+Human+RNA-RNA+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions.</a> Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).</li>
<li>Aw, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Mapping+of+Eukaryotic+RNA+Interactomes+Reveals+Principles+of+Higher-Order+Organization+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation.</a> Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont pas d&#39;intérêts financiers concurrents.

Ici, nous décrivons en détail le flux de travail expérimental et informatique pour SPLASH, une méthode qui nous permet d&#39;identifier les interactions ARN en paire d&#39;une manière généreuse. Nous avons utilisé avec succès SPLASH dans les cultures bactériennes, de levure et humaines et prévoyons que la stratégie peut être largement appliquée à divers organismes sous différents états cellulaires. L&#39;une des étapes critiques du protocole consiste à commencer par au moins 20 μg d&#39;ARN réticulé pour avoir un matéri...

Étudier comment les macromolécules se plient et interagissent entre elles est la clé pour comprendre la régulation des gènes dans la cellule. Bien que de nombreux efforts aient été concentrés au cours de la dernière décennie pour comprendre comment l&#39;ADN et les protéines contribuent à la régulation des gènes, on connaît relativement moins de la régulation post-transcriptionnelle de l&#39;expression des gènes. L&#39;ARN porte des informations à la fois dans sa séquence linéaire et dans sa structure secondaire et tertiaire 1 . Sa capacité à baser la paire avec elle-même et avec d&#39;autres est importante pour sa fonction in vivo . Les progrès récents dans la sondage de la structure secondaire de l&#39;ARN à haut débit ont fourni des informations précieuses sur les emplacements des régions à double et simple brin dans le transcriptome 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , HoweLes informations sur les partenaires d&#39;interaction d&#39;appariement manquent encore. Pour déterminer quelle séquence d&#39;ARN interagit avec une autre région d&#39;ARN dans le transcriptome, nous avons besoin d&#39;informations globales en paire. La cartographie par paire d&#39;interactions ARN d&#39;une manière globale et impartiale a traditionnellement été un défi majeur. Alors que les approches antérieures, telles que CLASH 9 , hiCLIP 10 et RAP 11 , sont utilisées pour identifier les interactions de l&#39;ARN à grande échelle, ces techniques classent généralement l&#39;association de base d&#39;ARN pour un sous-ensemble d&#39;ARN qui interagissent avec une protéine particulière ou des espèces d&#39;ARN. Les développements récents dans l&#39;étude des interactions globales de l&#39;ARN comprennent la méthode RPL 12 , qui ne stabilise pas les interactions de l&#39;ARN in vivo et ne peut donc capturer qu&#39;un sous-ensemble d&#39;interactions in vivo . Pour surmonter ces défis, nous et d&#39;autres avons développé des stratégies à l&#39;échelle du génome et impartiales à maP ARNA interagère in vivo , en utilisant des versions modifiées du réticulant psoralen 13 , 14 , 15 . Dans ce protocole, nous décrivons les détails pour effectuer l&#39;équation de S de P soralen réticulé, L igated et S élués (SPLASH), qui utilise du psoralène biotinylé pour reticuler l&#39;association des ARN in vivo , suivie d&#39;une ligature de proximité et d&#39;un séquençage à haut débit pour Identifiez les partenaires de base de l&#39;ARN au niveau du génome ( Figure 1 ) 15 . Dans ce manuscrit, nous décrivons les étapes pour effectuer SPLASH à l&#39;aide de cellules adhérentes cultivées, dans ce cas, des cellules HeLa. Le même protocole peut être facilement adapté aux cellules de mammifères en suspension et aux cellules de levure et de bactéries. En bref, les cellules HeLa sont traitées avec du psoralène biotinylé et irradiées à 365 nm pour paires de bases d&#39;ARN interactives par liaison croisée in vivo. Les ARN sont ensuite extraits des cellules, fragmentés et enrichis pour les régions de réticulation en utilisant des billes de streptavidine. Les fragments d&#39;ARN interagissant sont ensuite ligaturés ensemble en utilisant une ligature de proximité et transformés en une banque d&#39;ADNc pour un séquençage profond. Lors du séquençage, les ARN chimériques sont mappés sur le transcriptome / génome pour identifier les régions qui interagissent avec l&#39;ARN qui sont couplées l&#39;une à l&#39;autre. Nous avons utilisé SPLASH avec succès pour identifier des milliers d&#39;interactions d&#39;ARN in vivo dans la levure et différentes cellules humaines, y compris le couplage intramoléculaire et intermoleculaire de base d&#39;ARN dans diverses classes d&#39;ARN, tels que snoRNAs, lncRNAs et mRNAs, pour apercevoir l&#39;organisation structurelle et les modèles d&#39;interaction Des ARN dans la cellule.

<table><tbody><tr><td>1 kb Plus Échelle d’ADN</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>Échelle d’ADN</td><td>10787026</td></tr><tr><td>10 pb Échelle d’ADN</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10821-015</td><td>Échelle d’ADN</td></tr><tr><td>20 % Solution SDS</td><td>Première BASE</td><td>BUF-2052-1L&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>First BASE</td><td>BUF-3050-20X1L</td><td></td></tr><tr><td>3.0 M Solution d’acétate de sodium</td><td>First BASE</td><td>BUF-1151-1L-pH5.2&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Requis pour la précipitation des acides nucléiques</td></tr><tr><td>Solution d’acrylamide/Bis à 40 %, 19:1</td><td>Bio-Rad</td><td>1610145</td><td>TBE Composant de gel d’urée</td></tr><tr><td>Kit tampon Ambion Life</td><td>Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium, qualité moléculaire. &nbsp ;</td><td>Promega</td><td>V3131° ;</td><td>TBE Composant gel d’urée</td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Merck</td><td>1.02445.1000</td><td>Extraction d’ARN</td></tr><tr><td>Simple brin DNA ligase</td><td>Epicentre</td><td>CL9025K</td><td>CircLigase II ssDNA Ligase</td></tr><tr><td>Filtres à tube centrifuge</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS8160-96EA</td><td>Filtres à tube centrifuge Costar Spin-X</td></tr><tr><td>D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628-1G</td><td>Pour le traitement cellulaire</td></tr><tr><td>Dark Reader Transilluminator&nbsp ;</td><td>Clare Chemical Research</td><td>Dark Reader DR89X Transilluminateur</td> à <td>lumière bleue Colorant</td></tr><tr><td>de chargement de gel d’ADN (6x)</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>R0611</td><td>Requis pour l’électroporation de gel d’agarose</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium</td><td>Pan BioTech</td><td>P04-03500</td><td>Pour la culture cellulaire Hela</td></tr><tr><td>Perles magnétiques de streptavidine</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>65002</td><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1&nbsp ;</td></tr><tr><td>Support magnétique pour 15 mL tubes</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>12301D</td><td>DynaMag-15</td></tr><tr><td>Support magnétique pour 15&nbsp ; mL tubes</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>12321D</td><td>DynaMag-2</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382 000.015</td><td>Eppendorf ThermoMixer&nbsp ; C</td></tr><tr><td>Psoralène biotinylé</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>29986</td><td>EZ-Link Psoralène-PEG3-Biotine</td></tr><tr><td>F8T5/BL&nbsp ;</td><td>Hitachi</td><td>F8T5/BL&nbsp ;</td><td>Ampoule UV 365 nm</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10270106&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Composants de Hela medium</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Promega</td><td>H5052° ; &nbsp ;</td><td>Composant dans le tampon d’hybridation</td></tr><tr><td>G8T5</td><td>Sankyo-Denki</td><td>G8T5</td><td>254 nm Bulbe UV</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10814010</td><td>Nécessaire pour la précipitation des acides nucléiques</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>Nanodrop 2000</td><td>Spectrophotomètre pour la quantification des acides nucléiques</td></tr><tr><td>Eau sans nucléases&nbsp ;</td><td>Première BASE</td><td>BUF-1180-500ml&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>15140122&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Composants de Hela medium</td></tr><tr><td>ADN polymérase haute-fidélité (2x)</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>F531L&nbsp ;</td><td>Mélange maître PCR haute fidélité Phusion avec tampon HF (2x)</td></tr><tr><td>Set d’amorces 1</td><td>New England Biolabs</td><td>E7335L&nbsp ;</td><td>Amorces PCR</td></tr><tr><td>Kit d’extraction de gel d’ADN</td><td>QIAgen</td><td>28106</td><td>QIAquick Kit d’extraction de gel</td></tr><tr><td>Kit de quantification fluorométrique</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>Q32854</td><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td></tr> Kit <tr><td>de nettoyage de l’ARN</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>RNeasy Mini Kit Colonne de membrane de silice</td></tr><tr><td>Inhibiteur de RNASE</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>AM2696</td><td>SUPERase In</td></tr><tr><td>Transcriptase inverse</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>18080400</td><td>SuperScript III Synthèse du premier brin SuperMix</td></tr><tr><td>Gel d’acide nucléique Stain</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>S11494</td><td>SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL</td></tr><tr><td>T4 Polynucléotide kinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td>Enzyme de réparation finale</td></tr><tr><td>T4 ARN Ligase 1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td>Enzyme pour ligature de proximité</td></tr><tr><td>T4 ARN Ligase 2, tronqué KQ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0373L</td><td>Enzyme pour ligature adaptatrice</td></tr><tr><td>Temed</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td>TBE Composant de gel d’urée</td></tr><tr><td>Guanidinium thiocyanate-phénol-chloroforme</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>15596018</td><td>TRIzol&reg ; Réactif pour l’extraction de l’ARN</td></tr><tr><td>Urée</td><td>First BASE</td><td>BIO-2070-5kg&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Réticulant UV</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>UV Stratalinker 1800</td></tr><tr><td>Transilluminateur UV</td><td>UVP</td><td>95-0417-01</td><td>Pour la visualisation des bandes</td></tr><tr><td>Xylene Cyanol FF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126-10G</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyage de l’ADN it</td><td>Zymo Research&nbsp ;</td><td>D4004</td><td>Concentrateur d’ADN Zymo-5&nbsp ;</td></tr><tr><td>Liste des logiciels requis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel FastQC</td><td>0.11.4</td><td>http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td><td></td></tr> <tr><td>Logiciel SeqPrep</td><td>1.0.7</td><td>https://github.com/jstjohn/SeqPrep</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel BWA</td><td>0.7.12</td><td>http://bio-bwa.sourceforge.net/</td><td></td></tr> <tr><td>Logiciel SAMTOOLS</td><td>1.2.1</td><td>http://www.htslib.org/</td><td></td></tr> <tr><td>Logiciel PULLSEQ</td><td>1.0.2</td><td>https://github.com/bcthomas/pullseq</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel STAR</td><td>2.5.0c</td><td>https://github.com/alexdobin/STAR</td><td></td></tr><tr><td>rem_dups.py Script PYTHON</td><td>PYTHON 2.7.11</td><td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</td><td></td></tr><tr><td>find_chimeras.py Script PYTHON</td><td>PYTHON 2.7.11</td><td></td><td></td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</tr><tr><td>pickJunctionReads.awk Script</td><td>AWK AWK GNU 4.1.2</td><td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</td><td></td></tr><tr><td>Buffer composition</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elution buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.3 M sodium acetate</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< Tampon >lyse fort</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris-Cl pH 7,0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 % SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ajouter toujours Superase-in frais avant utilisation, sauf lors du lavage des billes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><Tampon Strong>Proteinase K&nbsp ; </fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-Cl pH 7,0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 % SDS</td><fort><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’hybridation</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>750 mM NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 % SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris-Cl pH 7,0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 % formamide (stocker dans l’obscurité à 4 &deg ; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ajoutez toujours Superase-in frais avant utilisation</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< fort >2x tampon de lavage SSC</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x NaCl et citrate de sodium (SSC) (dilué à partir de 20x stock d’Invitrogen SSC)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 % SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><<tr><td>fort>2x tampon de fragmentation d’ARN</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mM MgCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>450 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>300 mM Tris-Cl pH 8,3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fort>2x charge d’ARN Colorant</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95 % Formamide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,02 % SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,02 % bleu</td><td></td> de bromophénol<td></td><td></td></tr><tr><td>0,01 % Xylène Cyanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><<tr>td colspan="4">3' Séquence adaptatrice d’ARN : 
5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC</td></tr><tr><td colspan="4">RT séquence d’amorces : 
AGATCGGAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG</td></tr></tbody></table>

cartographie des interactions arn-arn à l&#39;échelle mondiale à l&#39;aide de psoralène biotinylé

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Savoir comment les ARN interagissent avec eux-mêmes et avec d&#39;autres sont essentiels à la compréhension de la régulation des gènes basée sur l&#39;ARN dans la cellule. Bien que des exemples d&#39;interactions ARN-ARN telles que les interactions entre ARNm et ARNm aient montré qu&#39;ils régulent l&#39;expression des gènes, la mesure dans laquelle les interactions ARN se produisent dans la cellule est encore inconnue. Les méthodes antérieures pour étudier les interactions de l&#39;ARN ont principalement porté sur des sous-groupes d&#39;ARN qui interagissent avec une protéine particulière ou des espèces d&#39;ARN. Ici, nous détaillons une méthode appelée S équation de P soralen réticulé, L igated et S élués (SPLASH) qui permettent une capture intégrale des interactions de l&#39;ARN dans le génome in vivo de manière impartiale. SPLASH utilise une réticulation in vivo , une ligature de proximité et un séquençage à haut débit pour identifier globalement les partenaires intramoléculaires et intermoleculaires de base d&#39;ARN. SPLASH peut être appliqué à différents organismes, y compris des bactéries, des levures et des cellules humaines, ainsi qu&#39;uneDes conditions cellulaires diverses pour faciliter la compréhension de la dynamique de l&#39;organisation de l&#39;ARN dans divers contextes cellulaires. L&#39;ensemble du protocole SPLASH expérimental prend environ 5 jours pour être complété et le flux de travail informatique prend environ 7 jours pour être complété.

La figure 1 représente le schéma du flux de travail SPLASH. Lors de l&#39;addition de psoralène biotinylé en présence de 0,01% de digitonine et de réticulation UV, l&#39;ARN total est extrait des cellules et un point-tache est réalisé pour s&#39;assurer que la réticulation du biotinylé à l&#39;ARN s&#39;est produite efficacement ( figure 2 ). Nous utilisons des oligos biotinylés de 20 bases comme témoins positifs pour titrer la ...

Ici, nous détaillons la méthode de l&#39;équation de S de P soralen réticulé, L igated et S élués (SPLASH), ce qui permet une cartographie génomique des interactions intra-moléculaires et intermoleculaires d&#39;ARN-ARN in vivo . SPLASH peut être appliqué pour étudier les interactions de l&#39;ARN des organismes, y compris la levure, les bactéries et les humains.

Cartographie des interactions ARN-ARN à l&#39;échelle mondiale à l&#39;aide de psoralène biotinylé

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

L'objectif général de cette vidéo est de décrire la méthode de séquençage des hybrides liés, sélectionnés et réticulés par la psoralène, ou SPLASH, permettant de cartographier de manière globale les interactions ARN-ARN in vivo par paires. Cette technique constitue une méthode simple et à haut débit pour cartographier les interactions ARN in vivo. Elle peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la génomique de l'ARN, telles que la manière dont différentes régions le long d'un seul brin d'ARN ou entre différents brins d'ARN interagissent entre elles.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les cellules de levure et humaines, elle peut également être appliquée à l'étude d'autres organismes modernes, notamment les bactéries et les membranes cellulaires. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous avons cherché un moyen de cartographier les interactions moléculaires. Notez que la procédure suivante comporte plusieurs points d'arrêt.À ces moments, l'expérience peut être mise en pause brièvement ou indéfiniment. Des détails sont disponibles dans le texte accompagnant. Commencez cette procédure en lavant les cellules HeLa deux fois avec cinq mil

mapping-rna-rna-interactions-globally-using-biotinylated-psoralen

Research

Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

Transcrits d'ARN sont soumis à régulation post-transcriptionnelle vaste qui est médiée par une multitude d'action trans protéines liant l'ARN (pratiques commerciales restrictives). Nous présentons ici une méthode généralisable pour identifier précisément et à l'échelle du transcriptome à l'échelle des sites liaison à l'ARN de pratiques commerciales restrictives.

PAR-Clip - Une méthode pour identifier transcriptome à l&#39;échelle des sites de liaison des protéines liant l&#39;ARN

Les interactions ARN-protéine sont au cœur de nombreux processus cellulaires. Ici, nous décrivons une méthode in vivo pour isoler un ARN spécifique et identifier de nouvelles protéines qui lui sont associées. Cela pourrait jeter un nouvel éclairage sur la façon dont les ARN sont régulés dans la cellule.

Novel protéines __gVirt_NP_NN_NNPS&lt;__ ARN-Binding Isolation par la méthodologie RaPID

Les lasers sont fréquemment utilisés dans les études de la réponse cellulaire aux dommages de l'ADN. Cependant, ils génèrent des lésions dont l'espacement, la fréquence et les collisions avec les fourches de réplication sont rarement caractérisés. Nous décrivons ici une approche qui permet la détermination de ces paramètres avec réticule laser localisé interbrins.

Analyse des molécule laser Localisés psoralène adduits

Les auteurs décrivent un protocole pour identifier des protéines de liaison à l’ARN et de cartographier leurs régions de liaison à l’ARN dans des cellules vivantes psoralen médiée par les UV et spectrométrie de masse.

Préparation de l’échantillon d’Identification basé sur la spectrométrie de masse des régions de liaison à l’ARN

Ici, nous présentons un protocole de capture interactif appliqué aux protoplastes de mésophylle de la feuille d' Arabidopsis thaliana . Cette méthode repose de manière critique sur la réticulation UV in vivo et permet l'isolement et l'identification des protéines de liaison de l'ARNm de la plante à partir d'un environnement physiologique.

Capture interactine d&#39;ARNm à partir de protoplastes végétaux

Un protocole détaillé pour l’application de la clic chimie assistée par RNA-interactome capture (CARIC) stratégie pour identifier les protéines liant les deux codage et non codantes RNAs est présenté.

Capture et Identification des protéines de liaison à l’ARN à l’aide de Click chimie assistée par ARN-interactome Capture stratégie (CARIC)

Les complexes ARN/protéines purifiées à l’aide de la stratégie de streptavidine-botin sont éluées à solution dans des conditions dénaturation sous une forme impropre pour davantage de purification et d’analyse fonctionnelle. Nous décrivons ici une modification de cette stratégie qui utilise un linker photo-clivables en ARN et une étape d’élution UV douce, ce qui donne des complexes ARN/protéines natives et pleinement fonctionnels.

Seule étape Purification des Complexes macromoléculaires utilisant l’ARN attaché à la biotine et un éditeur de liens Photo-clivables

Ici, nous décrivons l'assemblage des complexes d'allongement de polymérase II d'ARN II (Pol II) exigeant seulement l'ADN synthétique court et les oligonucléotides synthétiques et pol II purifié. Ces complexes sont utiles pour étudier les mécanismes sous-jacents au traitement co-transcriptionnel des transcriptions associées au complexe d'allongement de Pol II.

Arn artificiel Polymerase II Elongation Complexes pour disséquer les événements de traitement de l'ARN cotranscriptionnel

Présentés ici sont des protocoles pour les essais biochimiques in vitro utilisant des étiquettes de biotine qui peuvent être largement applicables pour étudier les interactions protéines-acides nucléiques.

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions In Vitro Biochemical As

Ici, nous présentons une méthode in vitro optimisée pour découvrir, quantifier et valider les interacteurs protéiques de séquences d’ARN spécifiques, en utilisant l’extrait protéique total de cellules humaines, des billes de streptavidine recouvertes d’ARN biotinylé et une analyse par spectrométrie de masse.

Une analyse quantitative optimisée des protéines de liaison à l’ARN à l’aide d’ARN biotinylé court

Découvrez la méthode SPLASH pour cartographier les interactions ARN-ARN à l'échelle génomique in vivo. Cette technique à haut débit permet d'étudier les dynamiques des ARN dans la levure, les bactéries et les cellules humaines.

Cartographie des interactions ARN-ARN à l'échelle mondiale à l'aide de psoralène biotinylé

Explorer plus de vidéos