Cartographie des interactions ARN-ARN à l'échelle mondiale à l'aide de psoralène biotinylé

L’objectif général de cette vidéo est de décrire la méthode de séquençage du psoralène, des hybrides croisés, ligaturés et sélectionnés, ou SPLASH, dans laquelle les interactions ARN-ARN in vivo par paires sont cartographiées à l’échelle du génome. Cette technique est une méthode simple et à haut débit pour cartographier l’interaction de l’ARN in vivo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la génomique de l’ARN, telles que la façon dont différentes régions le long d’un seul brin d’ARN ou entre différents brins d’ARN interagissent les unes avec les autres.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les levures et les cellules humaines, elle peut également être appliquée à des études sur d’autres organismes modernes, y compris les bactéries et les membranes dans les cellules. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons voulu trouver un moyen de cartographier l’interaction moléculaire. Notez que la procédure suivante contient plusieurs points d’arrêt.

À ces moments-là, l’expérience peut être interrompue brièvement ou indéfiniment. Vous trouverez plus de détails dans le texte d’accompagnement. Commencez cette procédure en lavant deux fois les cellules HeLa avec cinq millilitres de PBS.

Placez le plat verticalement pendant une minute pour égoutter complètement tout excès de PBS. Ensuite, ajoutez un millilitre de PBS contenant 200 micromolaires de psoralène biotinylé et 0,01 % de digitonine qui augmente la perméabilité cellulaire. Prenez soin d’ajouter la solution uniformément sur la surface des cellules.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après l’incubation, retirez le couvercle du plat et placez-le sur de la glace à l’intérieur d’un réticulant UV à trois centimètres de l’ampoule UV. Irradier avec des UV 365 nanomètres pendant 20 minutes.

Après 20 minutes, retirez la parabole du réticulant, puis isolez, fragmentez et précipitez l’ARN des cellules HeLa selon les instructions du document d’accompagnement. Chargez des échantillons d’échelle et d’ARN dénaturés sur un gel de TBE-urée à 6 % de 8,6 centimètres carrés. Fractionnement granulométrique par électrophorèse à 180 volts pendant 40 minutes.

Teindre le gel dans 10 millilitres de tampon TBE contenant une dilution de 1:10 000 de colorant de gel d’acide nucléique pendant cinq minutes dans l’obscurité. Pendant que le gel tache, utilisez une aiguille de calibre 24 pour percer un tube de microfuge propre de 0,6 millilitre au fond. Placez-le dans un tube microfuge de deux millilitres.

À l’aide d’un transilluminateur, visualisez les bandes sur le gel post-coloré et découpez une tranche de gel correspondant à 90 à 110 nucléotides. Transférez la tranche de gel dans le tube de microfuge perforé de 0,6 millilitre dans le tube de microfuge de deux millilitres. Le choix de la taille nous permet de définir la longueur minimale des fragments chimériques et de distinguer ultérieurement les produits ligaturés des produits non ligaturés.

Centrifugez les tranches de gel à 12 000 fois g à température ambiante pendant deux minutes pour déchiqueter la tranche de gel et la recueillir dans le tube de microfuge de deux millilitres. Après l’essorage, jetez le tube de microfuge vide de 0,6 millilitre. À la tranche de gel râpée, ajoutez 700 microlitres de tampon d’élution.

Incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit avec une rotation constante pour permettre la diffusion des échantillons dans le tampon. Transférez les tranches de gel et le tampon d’élution dans un filtre à tube de centrifugation et centrifugez à 20 000 fois g pendant 20 minutes. Après l’essorage, les tranches de gel seront piégées dans le compartiment supérieur du filtre qui peut être jeté.

Précipiter et quantifier l’ARN comme décrit dans le document d’accompagnement. Congelez et stockez l’ARN à moins 80 degrés Celsius dans de l’azote liquide jusqu’à ce qu’il soit utilisé. Pour enrichir les régions de réticulation de l’ARN, commencez par ajouter 100 microlitres de tampon de lyse contenant un inhibiteur de RNase pour laver les billes magnétiques enrobées de streptavidine dans un tube de microfuge.

Dans un tube à centrifuger conique de 15 millilitres, ajoutez deux millilitres de tampon d’hybridation fraîchement préparé, un millilitre de tampon de lyse supplémenté, 1,5 microgramme d’ARN fractionné et 100 microlitres de billes remises en suspension. Tourbillonnez doucement le tube. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avec rotation de bout en bout.

Après l’incubation, lavez les billes cinq fois avec un tampon de lavage préchauffé. À la fin du cinquième lavage, placez le tube microfuge contenant les billes sur le support magnétique pendant une minute, puis retirez le tampon de lavage. Ajoutez un millilitre de tampon polynucléotide kinase T4 froid aux billes lavées.

Incuber les billes pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius avec rotation de bout en bout. Placez le tube microfuge contenant les billes sur la bande magnétique. Au bout d’une minute, retirez délicatement le tampon.

Répétez cette étape pour un total de deux lavages et retirez le tampon après le dernier lavage. Ensuite, suivez les instructions du document d’accompagnement pour convertir les cinq extrémités principales et les trois extrémités principales pour qu’elles soient compatibles avec la ligature et effectuez la ligature de proximité. Après un lavage, ajoutez 100 microlitres de tampon ARN PK aux billes et remettez-les en suspension en les pipetant de haut en bas.

Chauffez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes sur un bloc chauffant. Ensuite, refroidissez l’échantillon sur de la glace pendant une minute. Ajoutez 500 microlitres de thiocyanate-phénol-chloroforme de guanidinium à l’échantillon.

Mélangez en tourbillonnant vigoureusement pendant 10 secondes. Incuber le mélange à température ambiante pendant 10 minutes. Après l’incubation, utilisez un kit pour précipiter, nettoyer et récupérer l’ARN, assurez-vous que même les petits ARN sont conservés.

Éluer l’ARN dans 100 microlitres d’eau sans nucléases. Transvasez 100 microlitres des échantillons élués dans un puits d’une plaque de 24 puits sur nice. En gardant l’échantillon sur de la glace, les UV l’irradient à 254 nanomètres pendant cinq minutes.

Transférez l’échantillon réticulé inverse dans un tube de microfuge propre. Ajoutez 10 microlitres d’acétate de sodium, un microlitre de glycogène et 300 microlitres d’éthanol à 100 %. Faites précipiter l’ARN à moins 20 degrés Celsius pendant au moins une heure.

Pour récupérer l’ARN, centrifugez l’ARN précipité à 20 000 fois g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après l’essorage, retirez le surnageant et ajoutez un millilitre d’éthanol froid à 70 % pour laver la pastille d’ARN. Centrifugez la pastille lavée à 20 000 fois g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.

Retirez le tampon de lavage et ajoutez 4,25 microlitres d’eau sans nucléase pour remettre l’ARN en suspension. Transférez l’ARN dans un tube PCR de 0,2 millilitre. Enfin, transcrivez, circularisez et amplifiez l’ADNc selon les instructions du document d’accompagnement.

Ce schéma décrit le flux de travail SPLASH. Lors de l’ajout de psoralène biotinylé en présence de 0,01 % de digitonine et de réticulation UV, l’ARN total est extrait des cellules et un dot blot est effectué pour s’assurer que la réticulation était efficace. Des oligonucléoles de 20 bases biotinylées sont ensuite utilisés comme témoins positifs pour titrer la quantité de psoralène biotinylé à ajouter aux cellules de sorte qu’environ une base sur 150 est réticulée.

L’amplification par PCR à petite échelle est ensuite effectuée à l’aide d’un nombre croissant de cycles de PCR afin de déterminer le nombre minimum de cycles requis pour le séquençage profond. Dans un processus efficace de préparation de banque, une banque de séquençage d’ADNc peut être amplifiée à partir d’une entrée d’ARN sélectionnée de 1,5 microgramme en moins de 15 cycles d’amplification par PCR. La bibliothèque est ensuite séquencée à l’aide de deux lectures de paires de 150 bases sur une machine de séquençage tout au long de l’image.

Les lectures de séquençage sont ensuite traitées en fonction du pipeline de calcul. Le résultat final est une liste d’interactions chimériques filtrées qui comprend à la fois des interactions ARN-ARN intramoléculaires et intermoléculaires dans le transcriptome. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de vérifier l’incorporation de psoralène biotinylé lors de l’utilisation de SPLASH sur de nouveaux organismes.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie de l’ARN pour explorer les interactions de l’ARN dans divers organismes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de créer une bibliothèque de séquençage qui capture les interactions d’ARN par paires à l’échelle mondiale dans la cellule.