Name: Propagation à petite échelle des CSPi humaines dans des conditions sans sérum pour la caractérisation immunocytochimique Routine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Apprenez la propagation à petite échelle des cellules souches pluripotentes induites humaines pour leur caractérisation immunocytochimique routinière. Cette méthode économique permet une transition efficace vers des substrats adaptés.

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Sources de financement : L’Université de l’Arizona, la Fondation Jim Himelic et le Centre de biologie des maladies complexes de l’Arizona.

hiPSCs ont été obtenues à partir de fibroblastes dermiques humains isolés à partir de 4 mm biopsies de la peau et reprogrammées dans la maison via Sendai virus médiée reprogrammation 11. L&#39;Université de l&#39;Arizona Institutional Review Board a approuvé toutes les procédures pour le sujet du recrutement et de collecte de biopsie. 1. Préparation de la matrice extracellulaire Surface revêtu pour iPSC Culture <ol><li> Un jour avant la confluence des cultures hiPSC poussent sur iMEFs, préparer la matrice extracellulaire (Matrigel) des plaques enduites. </li><li> dégel lent une aliquote de la matrice extracellulaire (lot dépendant, suivre les instructions sur la fiche technique) sur la glace à 4 ° C pendant 2 h. </li><li> Dans une hotte de biosécurité, en utilisant les embouts de pipettes à froid (stocké à -20 ° C), ajouter 1 aliquote de matrice extracellulaire à Modified Eagle Medium Mixture / éléments nutritifs de froid Dulbecco F-12 (DMEM / F12 / HEPES) selon spécifique, le facteur de dilution du lot . </li><li> Distribuer ~ 60081; L de la matrice extracellulaire par puits de chaque nouvelle culture cellulaire traitée plaque 12 puits nécessaire. </li><li> Incuber la plaque à température ambiante pendant plusieurs heures. Ici, utiliser un temps d&#39;incubation de 3 h. REMARQUE: Les plaques peuvent être utilisées immédiatement ou stockées à 4 ° C pendant jusqu&#39;à deux semaines. </li></ol> 2. Transfert de hiPSCs Cultivé sur des cellules nourricières Imef sur la matrice extracellulaire pour Propagation <ol><li> Le jour de repiquage, retirer la plaque revêtue de la matrice de 4 ° C et laisser la plaque acclimater à la température ambiante pendant 1 h dans la hotte de culture tissulaire. </li><li> Aspirer le moyen de 1 puits d&#39;une plaque à 6 puits de culture hiPSC croissante sur iMEFs et le remplacer par 500 ul de réactif collagénase de dissociation (1 mg / ml dans un milieu de culture de base). </li><li> Incuber à 37 ° C pendant environ 10-30 min jusqu&#39;à ce que les bords des colonies iPSC semblent soulever légèrement. NOTE: Le temps d&#39;incubation est en ligne dépendante et varie. Surveiller la dissociation sous un microscope. </li><li> Voitureefully Aspirer le réactif de dissociation et lavez doucement 2 fois avec du tampon phosphate salin (PBS, pH 7,4). </li><li> Ajouter 1 mL de la température ambiante mTeSR1 milieu complet avec 10 ng inhibiteur de protéine kinase associée à Rho ml (Y-27632 inhibiteur de ROCK) / du puits. NOTE: L&#39;utilisation d&#39;un mélange 50:50 de milieu Imef conditionné et mTeSR1 lors de ce passage initial est suggéré et peut être bénéfique pour la survie des hiPSCs au cours de cette transition des médias. </li><li> En utilisant un petit microscope à contraste de phase placé partiellement à l&#39;intérieur du capot, le score manuellement et ramasser 1 - 2 colonies de hiPSC (~ 700 - 1000 um de diamètre) en utilisant une seringue et une aiguille (25 g, 1 ½ po). Pousser sur les morceaux marqués de la colonie dans le milieu avec une pointe P200 de la pipette. </li><li> Aspirer et disposer de la matrice à partir de la nouvelle plaque, en faisant attention à ne pas perturber le revêtement. </li><li> Transférer 1 ml de la suspension cellulaire de l&#39;ancien puits contenant les CSPi marqués dans la nouvelle matrice ainsi revêtue. </li><li> PlaCE de la plaque dans l&#39;incubateur à 37 ° C, 5% de CO 2. Roche la plaque dans plusieurs, va-et-vient rapide, et l&#39;autre à l&#39;autre des mouvements pour répandre uniformément les cellules. Ne pas déranger la plaque pendant 24 h. </li><li> Effectuer tous les jours pleins changements de médias avec un milieu complet mTeSR1 (addition de Y-27632 ROCK Inhibitor est pas nécessaire après l&#39;étalement initial à l&#39;étape 2.5). </li></ol> Repiquage 3. à petite échelle de hiPSCs sur des plaques de matrice revêtu NOTE: En général, après le transfert initial des hiPSCs à la matrice plaques revêtues, les cellules doivent être repiqué une fois de plus d&#39;une manière similaire pour garantir que tous iMEFs ont été éliminés et les cellules sont adaptées à des conditions exemptes feeder. <ol><li> Un jour avant iPSC confluence Préparer fraîchement revêtue de plaques de matrice tel que discuté dans la section 1. </li><li> Le jour de passage, enlever la plaque revêtue de la matrice de 4 ° C, l&#39;incubation et laisser la plaque acclimater à la température ambiante pendant 1 h dans le cul de tissuture capot. </li><li> Aspirer le moyen de 1 puits d&#39;une plaque à 6 puits de hiPSCs (à l&#39;origine la transition du margeur à la matrice) et le remplacer par 500 ul de tampon de dissociation cellulaire. NOTE: Le tampon de dissociation cellulaire commercial utilisé ici (voir le tableau Matériaux) est plus approprié pour une utilisation avec un milieu mTeSR1 par rapport à la collagénase. </li><li> Incuber à température ambiante pendant 3 à 7 min jusqu&#39;à ce que les bords des colonies iPSC semblent soulever légèrement. Comme mentionné précédemment, la durée d&#39;incubation est conduite à charge et variable. Par conséquent, contrôler la dissociation cellulaire au microscope pour déterminer le moment optimal. </li><li> Aspirer soigneusement le tampon de dissociation et laver délicatement 2 fois avec du PBS. </li><li> Ajouter 500 ul de la température ambiante mTeSR1 milieu complet avec 10 ng d&#39;inhibiteur de ROCK / ml Y-27632 dans le puits. </li><li> Au lieu de colonies de marquer comme à l&#39;étape 2.6, appuyez sur le nombre souhaité de colonies dans les médias en utilisant une pointe de P200 et triturer doucement la suspension cellulaire 2 fois against un coin du puits pour briser les colonies hiPSC en amas de ~ 50-200 um. Par exemple, pour une plaque de 12 puits, prendre 1 - 2 colonies à transférer dans chaque 1 nouveau puits. Transférer la suspension cellulaire du vieux puits dans un nouveau single puits d&#39;une plaque de 12 puits. </li><li> Rock the plaque dans plusieurs va-et-vient rapide, et d&#39;un côté à côté des mouvements pour répandre uniformément les cellules, et que la plaque reste pendant 24 h dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur. </li><li> Effectuer tous les jours pleins changements de médias avec mTeSR1 milieu complet. Comme mentionné précédemment, il est nécessaire d&#39;ajouter des inhibiteurs de ROCK Y-27632 après le plaquage initial. NOTE: colonies iPSC inutilisées de l&#39;étape 3.7 peuvent être facilement cryoconservés à ce stade. </li></ol> 4. Préparation de la Chambre Diapositives et Lamelles pour Ensemencement des hiPSCs pour Immunocytochimie NOTE: Le protocole suivant utilise 4 puits diapositives de chambre en plastique et 12 mm lamelles de verre avec appropriatvolumes e des médias dans les multi-puits pour soutenir immunocytochimie rentable. Cependant, les volumes des médias peut être augmenté si l&#39;utilisation des puits et des tailles plus grandes lamelle est souhaitée. <ol><li> Un jour avant hiPSC confluence, préparer des lames de chambre fraîchement enduites de matrice extracellulaire tel que discuté dans la section 1. Ajouter suffisamment de solution de matrice (~ 300 - 500 pl par puits d&#39;une lame de chambre 4 puits) pour pleinement bien enrober chacune sans aucun souci de évaporation. Alternativement, après avoir placé 1 lamelle nettoyé et stérilisé dans chaque puits d&#39;une plaque de 24 puits, manteau avec 500 uL matrice extracellulaire et assurez-vous que la lamelle ne flotte pas au-dessus de la solution. </li><li> Le jour de passage, retirez les diapositives de chambre / lamelles recouvertes de 4 ° C et de permettre l&#39;acclimatation à la température ambiante pendant 1 h dans la hotte de culture de tissus. </li><li> Aspirer le moyen de 1 puits d&#39;une plaque de 12 puits de hiPSCs et le remplacer par 500 pi de tampon de dissociation. </li><li> Incuber à la chambre Tempe~ rature pendant 3 à 7 min jusqu&#39;à ce que les bords des colonies iPSC semblent soulever légèrement. </li><li> Aspirer soigneusement le tampon de dissociation et ajouter 1 ml de la température ambiante mTeSR1 milieu complet avec 10 ng / mL Y-27632 Inhibitor ROCK au bien. </li><li> En utilisant un microscope à contraste faible de phase placé à l&#39;intérieur de la hotte de culture de tissus, choisir manuellement 1 colonie / nouveau puits d&#39;une lame de chambre 4 puits ou 1 nouvelle lamelle à plaquer (~ 1000 - 1500 m de diamètre) en utilisant une pointe P200 de pipette en appuyant elle hors de la surface de la plaque dans le milieu. </li><li> Aspirer la matrice de la nouvelle chambre slide / lamelle, en faisant attention à ne pas perturber le revêtement. </li><li> triturer doucement la suspension cellulaire 2 fois contre un coin du puits pour briser les colonies hiPSC en amas de ~ 50-200 um. Transférer 250 ul de la suspension cellulaire du vieux puits dans chaque nouveau puits d&#39;une 4 puits chambre coulissant / lamelle. </li><li> Apportez le volume de chaque nouveau puits jusqu&#39;à 500 pi avec mTeSR1 suiteaining 10 ng / mL Y-27632 ROCK Inhibiteur. </li><li> Placez les diapositives chambre / lamelles dans l&#39;incubateur à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Après 24 h, effectuer des changements quotidiens complets des médias avec mTeSR1 milieu complet. Là encore, comme mentionné précédemment, l&#39;addition de Y-27632 ROCK Inhibiteur ne sont pas nécessaires après le plaquage initial. </li></ol> 5. Préparation de CSPi pour Immunocytochimie <ol><li> Une fois confluentes, préserver les colonies hiPSC via la fixation en enlevant les médias à partir des puits et en ajoutant préchauffé ATTENTION paraformaldéhyde 4% (~ 300 pl / puits d&#39;une lame de chambre 4 puits / lamelle). Incuber à température ambiante pendant 20 min. </li><li> Jeter la paraformaldéhyde appropriée selon biohazard institutionnel et des lignes directrices sur la sécurité chimique. </li><li> Laver les cellules 3 fois pendant 5 minutes à chaque fois sur un agitateur de paillasse avec du PBS. NOTE: Les cellules sur des lames de chambre / lamelles peuvent être stockés avec un grand PBS à 4 ° C indéfiniment à ce stade.Alternativement, ils peuvent être immédiatement utilisés pour la CPI. </li></ol> 6. Immunomarquage de hiPSCs avec pluripotence Marqueurs NOTE: hiPSCs immunocoloration avec des anticorps de pluripotence standard. A titre d&#39;exemple, voici les cellules sont en double-colorées avec des anticorps ciblant un 1 surface et 1 antigène intracellulaire de manière séquentielle comme suit: Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA4) avec des protéines 4 (OCT- anti-octamère liaison 4) et anti-Tra-1-60 avec anti-SRY BOX HMG lié au gène 2 (SOX2) (S&#39;il vous plaît voir le tableau des matériaux pour les détails d&#39;anticorps). <ol><li> Aspirer le PBS des puits et ajouter 500 pi / Solution bien Blocage sans Triton-X-100. Incuber pendant 1 h à température ambiante. </li><li> Préparer une concentration pré-déterminée (ici, utiliser 1: 200) des anticorps de surface, soit SSEA4 ou Tra-1-60, par dilution dans la solution de blocage sans Triton X-100. <ol><li> Pour les diapositives de chambre, préparer 300 pl / puits d&#39;une lame de chambre 4 puitsen mélangeant 298,5 ul de solution de blocage ci-dessus et 1,5 pi d&#39;anti-SSEA4 ou Tra-1-60 anticorps primaire. </li><li> Pour lamelles, préparer 40 pl / lamelle en mélangeant 199 ul de solution de blocage et 1 pi d&#39;anti-SSEA4 ou Tra-1-60 anticorps primaire. </li></ol></li><li> Aspirer la solution de blocage de la lame de la chambre et distribuer l&#39;anticorps primaire dans les puits appropriés. Pour lamelles, placez un morceau de parafilm fermement à l&#39;intérieur d&#39;une boîte de Pétri et distribuer 40 ul de l&#39;anticorps primaire sur le dessus comme une gouttelette. En utilisant une aiguille et une pince de seringue fléchis, soulevez délicatement la lamelle sur la culture bien et placez-le côté de la cellule vers le bas sur la chute de l&#39;anticorps sur le parafilm. Incuber une nuit à 4 ° C. </li><li> Le lendemain matin, laver les cellules 3 fois, 5 - 10 minutes à chaque fois, en retirant l&#39;anticorps à partir de la lame de la chambre et en ajoutant du PBS. Pour lamelles, soulevez chacun hors du parafilm et placez-le dans un puits d&#39;une plaque de 24 puits, côté cellule vers le haut. Ajouter délicatement PBS. </li><li> Préparer des anticorps secondaires appropriés à 1: 500 dans la solution de blocage. <ol><li> Pour les diapositives de chambre, préparer 300 pl / puits d&#39;une lame de chambre 4 puits en mélangeant 499 ul de solution de blocage et 1 pi de chèvre anti-souris IgG3 Alexa Fluor 488 (pour SSEA4) ou 1 pi de chèvre anti-souris IgM Alexa Fluor 488 (pour Tra-1-60). </li><li> Pour les lamelles couvre-objet, préparer 40 ul / lamelle couvre-objet en mélangeant 499 ul de solution de blocage et 1 pi de chèvre anti-souris IgG3 Alexa Fluor 488 (pour SSEA4) ou 1 pi d&#39;anticorps de chèvre anti-IgM de souris Alexa Fluor 488 (pour Tra-1-60 ). </li></ol></li><li> Aspirer le PBS de la glissière de chambre et distribuer l&#39;anticorps secondaire dans les puits appropriés. Pour les lamelles couvre-objet, après l&#39;étape 6.2, inverser les lamelles couvre-objet sur la solution d&#39;anticorps placé sur un parafilm à la température ambiante pendant 2 h. NOTE: Si vous utilisez fluorescent marqué des anticorps secondaires, les cellules doivent être protégées de la lumière. Placer les lames de la chambre et les lamelles dans un env sombreironnement pendant incubations et lavages. </li><li> Laver les cellules 3 fois pendant 5 à 10 min à chaque fois en supprimant l&#39;anticorps de la glissière de la chambre et en ajoutant du PBS. Pour lamelles, soulevez chacun soigneusement du parafilm et replacer dans un puits d&#39;une plaque de 24 puits, côté cellule vers le haut. Ajouter délicatement PBS pendant les lavages. </li><li> Avant de sonder pour le second antigène, intracellulaire OCT-4 ou SOX2 dans ce cas, incuber à nouveau dans la solution de blocage faite avec le réactif de perméabilisation (Triton-X-100) pendant 1 h à température ambiante. </li><li> Pour immunocoloration pour OCT-4 ou SOX2, il suffit de suivre la méthodologie décrite dans les étapes 6.1-6.6 pour appliquer les anticorps primaires et secondaires. Aux fins de ce protocole, utiliser OCT-4 et SOX2 à une concentration de 1: 200 et l&#39;anticorps secondaire de chèvre anti-IgG de lapin Alexa Fluor 594 à 1: 500. </li><li> Après les traitements primaires et secondaires mentionnées ci-dessus d&#39;anticorps, laver les cellules 3 fois pendant 5 à 10 minutes à chaque fois avec du PBS et contre-colorer avec 4 &#39;, 6&#39;-diamidino-2-phenylindole, dichlorhydrate (DAPI) suivant les protocoles standard si la visualisation nucléaire est souhaitée. </li></ol> 7. Préparation pour le visionnement <ol><li> Pour les diapositives de chambre, retirez soigneusement la chambre supérieure de la diapositive, en suivant les instructions du fabricant. Puis, rincer à l&#39;eau distillée et ajouter du milieu et d&#39;une lamelle de montage pour permettre à la microscopie. </li><li> Pour les lamelles couvre-objet, inverser les lamelles sur une goutte de milieu de montage placé sur une lame de microscope en verre. </li><li> Image sous un microscope à fluorescence standard ou confocale. </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li>
<li>Hallett, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+function+of+autologous+iPSC-derived+dopamine+neurons+following+transplantation+in+a+non-human+primate+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson's disease.</a> Cell stem cell. 16, 269-274 (2015).</li>
<li>Haston, K. M., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Trials+in+a+Dish%3A+The+Potential+of+Pluripotent+Stem+Cells+to+Develop+Therapies+for+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+rev+pharm+toxicol%22%5BJournal%5D)">Clinical Trials in a Dish: The Potential of Pluripotent Stem Cells to Develop Therapies for Neurodegenerative Diseases.</a> Annu rev pharm toxicol. 56, 489-510 (2016).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+heart+fail%22%5BJournal%5D)">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circ heart fail. 8, 156-166 (2015).</li>
<li>Byrne, J. A., Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+a+subpopulation+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Enhanced generation of induced pluripotent stem cells from a subpopulation of human fibroblasts.</a> PloS one. 4, 7118(2009).</li>
<li>Sivapatham, R., Zeng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+Characterization+of+Patient-Specific+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+for+Disease+Modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+mol+bio%22%5BJournal%5D)">Generation and Characterization of Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cell for Disease Modeling.</a> Methods mol bio. 1353, 25-44 (2016).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Ruff, D., Lieu, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+stem+cells+using+quantitative+PCR+protein+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+mol+bio%22%5BJournal%5D)">Profiling stem cells using quantitative PCR protein assays.</a> Methods mol bio. 997, 225-236 (2013).</li>
<li>Pripuzova, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+protein+marker+panel+for+characterization+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28hiPSCs%29+using+global+quantitative+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+res%22%5BJournal%5D)">Development of a protein marker panel for characterization of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using global quantitative proteome analysis.</a> Stem cell res. 14, 323-338 (2015).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+jpn+acad+ser+B+phys+biol+sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc jpn acad ser B phys biol sci. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Bigdeli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+human+embryonic+stem+cells+to+feeder-free+and+matrix-free+culture+conditions+directly+on+plastic+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces.</a> J Biotechnol. 133, 146-153 (2008).</li>
<li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+mol+bio%22%5BJournal%5D)">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods mol bio. 767, 137-146 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole systématique présenté ici offre un gain de temps et la méthode rentable, sous la forme d&#39;une technique de culture à échelle réduite, spécifiquement conçu pour soutenir une analyse efficace de la pluripotence via immunocytochimie. Les principaux avantages de la méthode décrite sont les suivantes. Traditionnellement plus de 3 à 4 passages sont nécessaires pour la transition CSPi de couches nourricières de feeder-libres conditions de culture afin d&#39;éliminer les iMEFs résidu...

Reprogrammation cellules somatiques humaines adultes en cellules souches pluripotentes induites (CSPi) fournit un moyen d&#39;obtenir une offre potentiellement illimitée de cellules spécifiques au patient pour étudier les maladies 1, 2. Récapitulant un phénotype de la maladie in vitro , il serait plausible d&#39;examiner les mécanismes cellulaires et moléculaires associés à la maladie, et d&#39; améliorer la découverte de médicaments et la médecine 3 personnalisé. En outre, CSPi humaines (hiPSCs) offrent la possibilité de dériver des types cellulaires spécifiques qui peuvent être utilisés comme une ressource unique pour remplacer les cellules mortes ou dysfonctionnelles et restaurer la fonction dans le contexte de plusieurs troubles 4, 5. Une condition préalable importante à l&#39;utilisation de CSPi dans les applications ci-dessus est de veiller à ce que leur état pluripotent et indifférenciée est maintenue lors de l&#39;expansion de la culture. En règle générale, techniques telles que la cytométrie en flux, un transfert de Western, une réaction en chaîne par polymérase et des dosages fonctionnels, qui nécessitent de grandes quantités de cellules et du matériel spécialisé, sont utilisés pour l&#39;analyse détaillée de la pluripotence COPSi 6, 7, 8, 9, 10. Toutefois, l&#39;évaluation systématique de l&#39;état indifférencié des CSPi pourrait effectivement être atteint grâce à la propagation limitée de ces cellules spécifiquement pour immunocytochimie (ICC), impliquant ainsi le temps et les ressources réduites. Les progrès récents permettent la croissance des CSPi dans des conditions sans sérum définies, ce qui représente une amélioration significative par rapport aux systèmes classiques de culture qui nécessitent murins couches nourricières de fibroblastes et des médias de sérum contenant. Cependant, la littérature actuelle ne comprend pas les protocoles par étapes claires qui décrivent comment faire la transition CSPi de chargeurcouche aux systèmes sans alimentation. Dans ce contexte, le présent protocole détaille systématiquement comment hiPSCs cultivées sur la souris irradiée fibroblaste embryonnaire (Imef) couches d&#39;alimentation peuvent être (1) apte à se propager dans un milieu sans sérum, et (2) cultivées sur une petite échelle pour soutenir spécifiquement robuste analyse immunocytochimique. Dans l&#39;ensemble, cette méthode représente une procédure rapide et rentable pour la propagation CSPi humaines dans des conditions sans sérum pour confirmer leur pluripotence sur une base régulière en utilisant immunocytochimie.

<table><tbody><tr><td>DMEM-F12/HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de ROCK humain recombinant FGF-Basic</td><td>Cell Sciences</td><td>CRF001B</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 R</td><td>& D</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type IV</td><td>Life Technologies</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel hESC Matrix</td><td>Corning</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 Basal Medium</td><td>StemCell Technologies</td><td>05850</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 5x Supplement</td><td>StemCell Technologies</td><td>05850</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de dissociation cellulaire douce</td><td>StemCell Technologies</td><td>07174</td><td></td></tr><tr><td>0,1 M PO4 Tampon</td><td>interne</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde, prill</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate Tamponné Saline</td><td>n/a</td><td>n/a n/a</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Life Technologies</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4A (C30A3) Anticorps monobloc pour lapin, Sox2 (D6D9) Anticorps monobloc pour lapin, SSEA4 (MC813) Anticorps monobloc pour souris, TRA-1-60(S)) Anticorps monobloc pour souris</td><td>Signalisation cellulaire Signalisation cellulaire Signalisation cellulaire Signalisation cellulaire</td><td>2840 3579 4755 4746</td><td>Alternativement, une combinaison de 6 anticorps primaires de pluripotence peut être achetée ensemble sous forme de kit dans le catalogue #9656</td></tr><tr><td>Chèvre anti-Ms IgM Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21042</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21151</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-Rb IgG Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Plaques</td> <td>de culture cellulaire multipuitsFisher Scientific&nbsp ;</td><td>0720080/0720081</td><td>Disponible en 6, 12, 24, 48, 96 tailles</td></tr><tr><td>de puits Lames de chambre</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>12 565 21</td><td>Disponible en verre ou en plastique Permanox en 1, 2, 4, 8, 16 tailles</td></tr><tr><td>de puits Couvre-cœur pour la croissance</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>12 545 82</td><td>Disponible en tailles 12, 15, 18, 22 et 25 mm</td></tr></tbody></table>

propagation à petite échelle des cspi humaines dans des conditions sans sérum pour la caractérisation immunocytochimique routine

Small-scale Propagation of Human iPSCs in Serum-free Conditions for Routine Immunocytochemical Characterization

Il y a un grand intérêt à utiliser les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) pour la modélisation de maladies et les thérapies cellulaires en raison de leur spécificité pour le patient et de leur souche caractéristique. Cependant, la pluripotence des iPSC, essentielle à leur fonctionnalité, doit être confirmée avant que ces cellules puissent être utilisées dans de telles applications. Bien qu’une caractérisation rigoureuse des iPSC, par différents tests cellulaires et fonctionnels, soit nécessaire pour établir leur pluripotence, l’évaluation régulière du maintien de la pluripotence peut être réalisée plus simplement et plus efficacement grâce à des techniques immunocytochimiques. Ici, nous présentons un protocole systématique de culture des hiPSC, de manière réduite, afin de faciliter particulièrement la vérification de leur état pluripotent par immunocytochimie. Plus précisément, cette méthodologie englobe un moyen efficace et rentable de cultiver des iPSC dans des conditions sans sérum et de les plaquer sur de petites lames de chambre ou des lamelles de verre idéales pour l’immunocytochimie.

Ce protocole fournit une description étape par étape de la façon dont CSPi humaine peut être transférée de la couche d&#39;alimentation à des conditions feeder-libre, et par la suite propagée de façon limitée pour permettre spécifiquement immunocytochimie rentable pour confirmer le maintien de la pluripotence. La figure 1 montre une représentation schématique de ce protocole. La figure 2A montre des colonies poussant sur hiPSC iMEFs dans des plaques 6 pu...

La caractérisation régulière des cellules souches pluripotentes induites (CSPi), afin de déterminer le maintien de leur état pluripotent, est une étape importante avant que ces cellules ne soient utilisées pour d’autres applications. Nous décrivons ici une méthode de propagation à petite échelle des iPSC humaines, spécialement conçue pour permettre leur caractérisation facile et routinière par immunocytochimie.

Propagation à petite échelle des CSPi humaines dans des conditions sans sérum pour la caractérisation immunocytochimique Routine

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient ...

L'objectif général de cette méthode de culture est de propager des cellules souches pluripotentes induites humaines, ou iPSC humaines, à petite échelle, afin de permettre spécifiquement leur caractérisation de routine par immunocytochimie. Ce protocole provenant de mon laboratoire présente une technique d'échelle réduite permettant de transférer des cellules souches pluripotentes induites humaines d'une couche fœtale sous-jacente vers un substrat plus adapté à la détection d'antigènes à l'aide d'anticorps spécifiques de pluripotence. Le principal avantage de cette technique est qu'elle offre un moyen efficace en termes de temps et de coût pour cultiver des cellules pluripotentes dans de petites lamelles à chambre ou sur des lamelles couvre-objets, idéales pour l'immunocytochimie.Le jour du passage, retirez la plaque revêtue de matrice de quatre degrés Celsius et laissez-la s'acclimater à température ambiante pendant une heure dans la hotte de culture tissulaire. Ensuite, aspirez le milieu d'une well d'une plaque de six wells contenant une culture de cellules iPSC humaines en croissance sur iMEFs, puis remplacez-le par 500 microlitres de réactif de dissociation à base de collagénase. Incubez ensuite les cellules à 37 degrés Celsius pendant 10 à 30 minutes, jusqu'à ce que les bords des colonies de cellules iPSC semblent légèrement soulevés, comme observé au microscope. Aspirez soigneusement le réactif de dissociation et lavez doucement les cellules deux fois avec du PBS.Étant donné que le profil de dissociation de chaque lignée spécifique de CIPi peut différer, il est important de surveiller le détachement des colonies au microscope afin de déterminer la durée d'incubation optimale requise avec le réactif de dissociation. Ajouter un millilitre de milieu complet mTeSR à température ambiante contenant 10 nanogrammes par millilitre d'inhibiteur ROCK dans le puits. À l’aide d’un petit microscope à contraste de phase placé partiellement à l’intérieur de la hotte, gratter manuellement et sélectionner une à deux colonies de CIPi humaines.Repousser les morceaux découpés de la colonie dans le milieu à l’aide d’une pointe de pipette P200. Ensuite, aspirer la matrice des nouveaux puits devant être ensemencés, en prenant soin de ne pas perturber le revêtement. Transférer un millilitre de la suspension cellulaire depuis l’ancien puit contenant les iPSC découpées vers le nouveau puit revêtu de matrice.Placer la plaque dans l'incubateur et agiter la plaque par plusieurs mouvements rapides d'avant en arrière et de côté à côté afin de répartir uniformément les cellules. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Après le transfert des iPSC humaines des iMEF vers la matrice extracellulaire, elles sont repiquées dans une plaque de 12 puits de manière similaire aux étapes de repiquage précédentes.Ce passage permet l'élimination de tout iMEF résiduel dans la culture et assure l'adaptation des cellules à des conditions sans cellules nourricières. À l’aide d’une pipette P200, poussez le nombre souhaité de colonies dans le milieu et agitez doucement deux fois la suspension cellulaire contre un coin du puits afin de fragmenter les colonies de cellules souches pluripotentes induites humaines en agrégats d’environ 50 à 200 micromètres de taille. Pour une plaque de 12 puits, détachez une à deux colonies dans le milieu, puis transférez la suspension cellulaire du puits ancien vers un nouveau puits unique d’une plaque de 12 puits.Agiter la plaque par plusieurs mouvements rapides d'avant en arrière et de côté à côté afin de répartir uniformément les cellules, puis laisser reposer la plaque pendant 24 heures à 37 degrés Celsius. Cette section consiste à repiquer les iPSC dans des plaques de 12 puits et à les semer sur des lamelles à chambres petites et des couvre-objets adaptés à l'immunocytochimie. Dans cette procédure, aspirer le milieu d'un puits d'une plaque de 12 puits contenant des iPSC humaines et le remplacer par 500 microlitres de tampon de dissociation.Incuber les cellules à température ambiante pendant environ trois à sept minutes, jusqu'à ce que les bords des colonies de cellules souches pluripotentes induites (iPS) semblent légèrement soulevés. Ensuite, aspirer soigneusement le tampon de dissociation et ajouter un millilitre de milieu complet mTeSR à température ambiante contenant 10 nanogrammes par millilitre d'inhibiteur de ROCK dans le puits. À l'aide d'un petit microscope à contraste de phase placé à l'intérieur de la hotte de culture tissulaire, détacher délicatement les colonies desserrées de la surface de la plaque en les poussant dans le milieu, puis aspirer la matrice de la nouvelle plaque 24 puits contenant des lamelles et une lame-chambre, en prenant soin de ne pas perturber le revêtement.Effectuez délicatement deux titrations de la suspension cellulaire contre un coin du puits afin de fragmenter les colonies de cellules souches pluripotentes induites humaines en agrégats d'environ 50 à 200 micromètres de taille. Transférez 250 microlitres de la suspension cellulaire depuis l'ancien puits vers chaque nouveau puits d'une lame à quatre puits. Lors du semis sur les lamelles, détachez une colonie du puits d'origine, effectuez la titration, puis transférez la suspension cellulaire sur les lamelles placées dans les nouveaux puits d'une plaque à 24 puits.Ensuite, compléter le volume de chaque nouveau puits à 500 microlitres avec du mTeSR1 contenant 10 nanogrammes par millilitre d'inhibiteur ROCK Y27632. Puis, placer la lame à chambre et les lamelles dans l'incubateur à 37 degrés Celsius. Une fois que les iPSC humaines atteignent la confluence, les cellules sont prêtes pour l'immunocytochimie, en utilisant une fixation standard au paraformaldéhyde et un blocage avant l'incubation avec l'anticorps primaire.Préparez maintenant une concentration prédéterminée de l'anticorps dirigé contre la surface, soit SSEA4 soit TRA-1-60, en le diluant dans la solution de blocage sans Triton X-100. Pour les lames à chambres, préparez une quantité suffisante de solution d'anticorps en mélangeant 298,5 microlitres de solution de blocage et 1,5 microlitre d'anticorps primaire anti-SSEA4 ou TRA-1-60, de sorte que chaque puits reçoive 300 microlitres de solution d'anticorps. Aspirez la solution de blocage des chambres de la lame et ajoutez l'anticorps primaire dans les puits appropriés.Pour les lamelles, déposer 40 microlitres de solution d'anticorps sur une boîte recouverte de Parafilm. Retourner délicatement la lamelle, côté cellules vers le bas, dans la solution et incuber les cellules toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, retirer la solution d'anticorps des lames à quatre puits et laver les cellules trois fois, cinq à dix minutes à chaque fois, avec du PBS.Pour les lamelles, remettez-les dans les puits d'une plaque 24 puits et rincez-les avec du PBS, puis procédez de manière similaire à l'incubation avec l'anticorps primaire pour l'incubation avec l'anticorps secondaire, avant de préparer les cellules immunomarquées pour la microscopie en fluorescence. On observe ici une colonie dense de cellules souches pluripotentes induites cultivée sur des cellules nourricières iMEF. Après le premier passage dans une plaque 12 puits revêtue d'une matrice et contenant un milieu sans sérum, quelques cellules iMEF peuvent encore être observées dans la culture.Cette image montre la morphologie typique d'une colonie de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) en monocouche, cultivée sans cellules nourricières, et aucune iMEF n'est présente dans la culture à ce stade. Les images représentatives d'immunofluorescence des iPSC obtenues au microscope confocal montrent une expression positive des marqueurs de pluripotence Oct-4 et SSEA4 avec la coloration nucléaire DAPI, ainsi que Sox2 et TRA-1-60 avec DAPI. Ces deux dernières sont des images de superposition.Une fois maîtrisée, cette technique offre un moyen économique de transférer les iPSC des couches de cellules nourricières iMEF vers des surfaces matricielles et d'effectuer une immunocytochimie, ce qui permet d'économiser du temps et des réactifs coûteux. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que chaque lignée primaire d'iPSC se comporte différemment en culture et doit être surveillée attentivement durant les étapes de repiquage et de semis. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de cultiver et de repiquer économiquement des iPSC humaines à petite échelle pour une caractérisation immunocytochimique de routine.

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Developmental Biology

Biologie du développement

Suspension coloration immunocytochimique de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) pour les marqueurs de surface cellulaire (SSEA-3/SSEA-4) a été réalisé basée sur l'utilisation d'un appareil de self-made cytospin de créer une monocouche de cellules d'observation et de quantification.

Analyse immunocytochimique des cellules souches pluripotentes humaines en utilisant un appareil Self-Made Cytospin

Nous présentons un protocole de reprogrammation efficace des cellules somatiques humaines dans l'homme cellules souches pluripotentes induites (hiPSC) en utilisant des vecteurs rétroviraux codant Oct3 / 4, Sox2, Klf4 et c-myc (OSKM) et l'identification des hiPSC correctement reprogrammé par coloration en direct avec des Tra 1-81 anticorps.

Colonies sélectionner et isoler de l&#39;homme cellules souches pluripotentes induites à partir de fibroblastes adultes Reprogrammed

Les cellules souches pluripotentes, cellules embryonnaires ou soit souches pluripotentes induites (iPS), constituent une précieuse source de cellules différenciées humaines, y compris les cardiomyocytes. Ici, nous allons nous concentrer sur l'induction de cellules iPS cardiaque, en montrant comment les utiliser pour obtenir des cardiomyocytes humains fonctionnels à travers un protocole corps à base embryoïde.

Génération de cardiomyocytes humains: Un protocole de différenciation des induits des cellules souches pluripotentes humaines chargeur sans

Cellules souches pluripotentes induites (CISP) représentent une source de tissus spécifiques au patient pour des applications cliniques et la recherche fondamentale. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour reprogrammer les cellules humaines périphériques mononucléaires du sang (de PBMNCs) obtenus à partir de couches leucocytaires congelés en CSPi virales sans l'aide de non-intégration des plasmides épisomiques.

Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de Frozen Buffy Manteaux en utilisant non-intégration épisomique plasmides

Ce protocole décrit comment générer des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à partir de cellules T périphériques humaines dans des conditions sans nourrisseur en utilisant une combinaison de vecteurs viraux matrigel et Sendai contenant des facteurs de reprogrammation.

Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules T périphériques humains à l&#39;aide de virus Sendai dans des conditions libres Feeder-

Ici, nous rapportons un protocole pour développer un système tridimensionnel (3-D) à partir de cellules souches induites par l'homme-pluripotent (hiPSC) appelé le corps embryoïde sans sérum (SFEB). Ce modèle 3-D peut être utilisé comme une culture de tranche organotypique pour modéliser le développement cortical humain et pour l'interrogation physiologique des circuits neuronaux en développement.

Développer des corps embryoïdes libres de sérum dérivés dérivés de HiPSC pour l&#39;interrogation de cultures cellulaires souches 3-D à l&#39;aide de tests physiologiquement pertinents

Ce protocole décrit en détail la génération des cellules souches pluripotentes induites exempte d’empreinte (CISP) de cellules pancréatiques humaines dans des conditions sans chargeur, suivie d’édition en utilisant CRISPR/Cas9 ribonucléoprotéines et la caractérisation de la mis à jour le clones de cellules individuelles.

Génération efficace et l’édition de CISP exempte d’engraissement de cellules pancréatiques humaines en utilisant le système CRISPR-Cas9

Un protocole est présenté afin de préparer le polyvinyliques alcool-co-itaconique acides hydrogels avec raideur variable, qui ont été greffés avec et sans les oligopeptides, pour étudier l’effet de la rigidité des biomatériaux sur la différenciation et la prolifération des cellules souches. La rigidité des hydrogels était contrôlée par le temps de réticulation.

Culture de cellules souches pluripotentes humaines sur Polyvinyl alcool-Co-itaconique acides Hydrogels avec raideur variable dans des Conditions sans Xeno

Nous présentons ici un protocole pour la différenciation des cellules souches humaines pluripotentes induites dans chaque dérivé du somite (myotome, sclérotome, dermatome et syndetome) dans des conditions définies chimiquement, qui trouve des applications dans la modélisation de maladies éventuelles et thérapies basées sur les cellules en chirurgie orthopédique.

Dans Vitro génération du Somite dérivés de Human induit Pluripotent Stem cellules

L’objectif du protocole est de comparer différentes conditions de revêtement de la matrice extracellulaire (ECM) afin d’évaluer comment le revêtement différentiel affecte le taux de croissance des cellules souches pluripotentes induites (CSPi). En particulier, nous visons à mettre en place les conditions pour obtenir une croissance optimale des cultures iPSC.

Mesure de la confluence des CSPi à l’aide d’un système d’imagerie automatisé.

Nous décrivons ici un protocole qui facilite la différenciation des cellules souches pluripotentes induites humaines en astrocytes fonctionnels spécifiques du cerveau antérieur. Cela permet d’étudier le rôle des cellules gliales dans la pathogenèse des troubles neurodéveloppementaux, tels que le syndrome de l’X fragile, et de modéliser d’autres troubles cérébraux.

Génération et caractérisation d’astrocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines dépourvus de ribonucléoprotéine messagère X fragile

Apprenez la propagation à petite échelle des cellules souches pluripotentes induites humaines pour leur caractérisation immunocytochimique routinière. Cette méthode économique permet une transition efficace vers des substrats adaptés.

Propagation à petite échelle des CSPi humaines dans des conditions sans sérum pour la caractérisation immunocytochimique Routine (Vidéo) | JoVE Journal

Propagation à petite échelle des CSPi humaines dans des conditions sans sérum pour la caractérisation immunocytochimique Routine

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