Name: Targeted In Situ mutagenèse de Histone gènes dans la levure bourgeonnante (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Apprenez la mutagenèse ciblée in situ des gènes d'histones dans la levure Saccharomyces cerevisiae. Cette méthode permet d'étudier le rôle des résidus d'histones dans les processus de chromatine comme la transcription.

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Nous remercions Reine Protacio pour ses commentaires utiles lors de la préparation de ce manuscrit. Nous exprimons notre gratitude à la National Science Foundation (subventions n° 1243680 et 1613754) et au programme Odyssey du Hendrix College pour leur soutien financier.

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Le niveau élevé d&#39;homologie de séquence entre les deux gènes non-alléliques codant pour chacune des quatre protéines histones fondamentales dans les cellules de S. cerevisiae haploïdes peut représenter un défi pour les chercheurs qui souhaitent cibler spécifiquement l&#39; un des deux gènes pour la mutagenèse. Décrit précédemment levure méthodes de mutagenèse, y compris la Delitto Perfetto, génomique (SSG) mutagenèse spécifique du site, et les méthodes de remplacement de l&#39; allèle libre clonage...

Les quatre protéines histones fondamentales H2A, H2B, H3, H4 et jouent un rôle central dans le compactage, l&#39;organisation, et la fonction des chromosomes eucaryotes. Deux ensembles de chacun de ces histones forment l&#39;octamère d&#39;histone, une bobine moléculaire qui dirige l&#39;emballage de ~ 147 paires de bases d&#39;ADN autour de lui - même, entraînant finalement la formation d&#39;un nucléosome 1. Les nucléosomes sont des participants actifs dans une variété de processus basés sur chromosomiques, telles que la régulation de la transcription du gène et la formation de l&#39;euchromatine et l&#39;hétérochromatine dans les chromosomes, et en tant que tels ont fait l&#39;objet d&#39;intenses recherches au cours des dernières décennies. Un certain nombre de mécanismes ont été décrits par lequel nucléosomes peuvent être manipulées d&#39;une manière qui peut faciliter l&#39;exécution des processus spécifiques - ces mécanismes comprennent la modification post-traductionnelle de résidus d&#39;histones, dépendant de l&#39;ATP nucléosome remodelage, et la réorganisation de nucléosome ATP-indépendanteet montage / démontage 2, 3. La levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae est un organisme modèle particulièrement puissant pour la compréhension de la fonction histone dans les eucaryotes. Cela peut être attribué en grande partie au degré élevé de conservation évolutive des protéines histones dans tout le eucaryotes de domaine et la susceptibilité de la levure à une variété de expérimentale génétiques et biochimiques approches 4. approches Reverse-génétiques dans la levure ont été largement utilisés pour étudier les effets des mutations histones spécifiques sur divers aspects de la biologie de la chromatine. Pour ces types d&#39;expériences, il est souvent préférable d&#39;utiliser des cellules dans lesquelles les histones mutantes sont exprimées à partir de leur locus génomique natif, comme expression de plasmides autonomes peuvent conduire à des niveaux anormaux intracellulaires de protéines histones (en raison du nombre de plasmides différents dans les cellules) et la modification concomitante de la chromatine environnements, qui peut finalement confondre l&#39;interprétation des résultats. Ici, nous décrivons une technique basée sur la PCR qui permet de mutagénèse ciblée des gènes d&#39;histones à leurs emplacements génomiques natifs qui ne nécessite pas d&#39;étape et les résultats du clonage dans la génération de la mutation (s) désirée sans restes de séquences d&#39;ADN exogènes dans le génome. Cette technique profite du système de recombinaison homologue efficace dans la levure et a plusieurs caractéristiques en commun avec d&#39; autres techniques similaires développées par d&#39; autres groupes - notamment le Delitto Perfetto, génomique (SSG) mutagenèse spécifique du site, et allèle basée sur la PCR-clonage gratuit méthodes de substitution 5, 6, 7. Cependant, la technique nous décrivons a un aspect qui le rend particulièrement bien adapté pour la mutagenèse des gènes d&#39;histones. Dans les cellules de levure haploïdes, chacun des quatre histones est codé par deux non unllelic gènes et hautement homologues , par exemple, l&#39; histone H3 sont codées par les gènes et HHT1 HHT2, ainsi que les cadres de lecture ouverts (ORF) des deux gènes sont plus de 90% identique dans la séquence. Ce degré élevé d&#39;homologie peut compliquer les expériences conçues pour cibler précisément l&#39;un des deux gènes d&#39;histones codant pour la mutagenèse. Alors que les procédés mentionnés ci-dessus nécessitent souvent l&#39;utilisation d&#39;au moins certaines séquences dans l&#39;ORF du gène cible pour conduire une recombinaison homologue, la technique que nous décrivons ici fait appel à des séquences flanquant les ORFs des gènes d&#39;histones (qui partagent beaucoup moins d&#39;homologie de séquence) pour l&#39;étape de recombinaison, augmentant ainsi la probabilité de ciblage réussi de mutagénèse sur le lieu souhaité. En outre, les régions homologues qui animent la recombinaison peut être très vaste, ce qui contribue à l&#39;efficacité de recombinaison homologue ciblée.

<table><tbody><tr><td>Échelle d’ADN de 1 kb (normes ADN)</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>A5093-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Sigma</td><td>B0394-500G</td><td></td></tr><tr><td>mélange dNTP (10 mM chacun)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td>Solution EDTA (0,5 M, pH 8,0)</td><td>AmericanBio</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol (200 Proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-824</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique sel disodique dihydraté (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E4884-500G</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de lithium dihydraté</td><td>Sigma</td><td>L6883-250G</td><td></td></tr><tr><td>MyCycler Thermocycler</td><td>BioRad</td><td>170-9703</td><td></td></tr><tr><td>Poly(éthylène glycol) (PEG)</td><td>Sigma</td><td>P3640-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR HS ADN POLYMÉRASE (ADN polymérase haute fidélité)&nbsp ; et tampon 5x</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-443-960</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’ADN de spermatozoïde de saumon</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Sigma 7-9 (base Tris, forme poudre)</td><td>Sigma</td><td>T1378-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium trihydraté</td><td>Sigma</td><td>236500-500G</td><td></td></tr><tr><td>Supra Sieve GPG Agarose (agarose à basse température de rencontre)</td><td>AmericanBio</td><td>AB00985-00100</td><td></td></tr><tr><td>Taq Polymérase et tampon 10x New</td><td>England BioLabs</td><td>M0273X</td><td></td></tr><tr><td>Cure-dents</td><td>Fisher Scientific</td><td>S67859</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td><td>AmericanBio</td><td>AB14043-01000</td><td></td></tr><tr><td>a-D(+)-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC170080025</td><td>pour milieu de levure</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-01-0</td><td>pour milieu de levure</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Fisher</td><td>Scientific DF0118-07-2</td><td>pour milieu YPD</td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0127-17-9</td><td>pour milieu YPD</td></tr><tr><td>Acide 4-aminobenzoïque</td><td>Sigma</td><td>A9878-100G</td><td>pour milieu de décrochage minimal complet&nbsp ;</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma</td><td>A8626-100G</td><td>pour un support de décrochage minimal complet&nbsp ;</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de glycine</td><td>Sigma</td><td>G2879-100G</td><td>pour un milieu de chute minimal complet&nbsp ;</td></tr><tr><td>L-Alanine</td><td>Sigma</td><td>A7627-100G</td><td>pour un support de chute minimal complet&nbsp ;</td></tr><tr><td>Monochlorhydrate de L-arginine</td><td>Sigma</td><td>A5131-100G</td><td>pour un milieu de décrochage minimal complet&nbsp ;</td></tr><tr><td>L-Asparagine monohydrate</td><td>Sigma</td><td>A8381-100G</td><td>pour un milieu de chute minimal complet&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sel de sodium d’acide L-aspartique monohydraté</td><td>Sigma</td><td>A6683-100G</td><td>pour un milieu de décrochage minimal complet&nbsp ;</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de L-cystéine monohydraté</td><td>Sigma</td><td>C7880-100G</td><td>pour un milieu de chute minimal complet&nbsp ;</td></tr><tr><td>Chlorhydrate d’acide L-glutamique</td><td>Sigma</td><td>G2128-100G</td><td>pour un milieu de chute minimal complet&nbsp ;</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G3126-100G</td><td>pour un support de décrochage minimal complet&nbsp ;</td></tr><tr><td>Monochlorhydrate de L-Histidine monohydraté</td><td>Sigma</td><td>H8125-100G</td><td>pour un milieu de chute minimal complet&nbsp ;</td></tr><tr><td>L-Isoleucine</td><td>Sigma</td><td>I2752-100G</td><td>pour un support de décrochage minimal complet&nbsp ;</td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>Sigma</td><td>L8000-100G</td><td>pour un support de décrochage minimal complet&nbsp ;</td></tr><tr><td>Monochlorhydrate de L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>L5626-100G</td><td>pour un milieu de chute minimal complet&nbsp ;</td></tr><tr><td>L-Méthionine</td><td>Sigma</td><td>M9625-100G</td><td>pour un support de décrochage minimal complet&nbsp ;</td></tr><tr><td>L-Phénylalanine</td><td>Sigma</td><td>P2126-100G</td><td>pour un support d’abandon minimal complet&nbsp ;</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma</td><td>P0380-100G</td><td>pour un support de chute minimal complet&nbsp ;</td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Sigma</td><td>S4500-100G</td><td>pour un support de décrochage minimal complet&nbsp ;</td></tr><tr><td>L-Threonine</td><td>Sigma</td><td>T8625-100G</td><td>pour un support de décrochage minimal complet&nbsp ;</td></tr><tr><td>L-Tryptophane</td><td>Sigma</td><td>T0254-100G</td><td>pour un milieu de décrochage minimal complet&nbsp ;</td></tr><tr><td>L-Tyrosine</td><td>Sigma</td><td>T3754-100G</td><td>pour un support de décrochage minimal complet&nbsp ;</td></tr><tr><td>L-Valine</td><td>Sigma</td><td>V0500-100G</td><td>pour un support de décrochage minimal complet&nbsp ;</td></tr><tr><td>myo-Inositol</td><td>Sigma</td><td>I5125-100G</td><td>pour un milieu de décrochage minimal complet&nbsp ;</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>pour un support de décrochage minimal complet&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sulfate d’ammonium</td><td>Fisher Scientific</td><td>A702-500</td><td>pour un milieu de chute minimal complet&nbsp ;</td></tr><tr><td>Base d’azote de levure</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0919-07-3</td><td>pour un milieu de chute minimal complet&nbsp ;</td></tr><tr><td>Acide 5-fluoroorotique (5-FOA)</td><td>AmericanBio</td><td>AB04067-00005</td><td>pour&nbsp ; Milieu 5-FOA</td></tr></tbody></table>

targeted<em&gt; in situ</em&gt; mutagenèse de histone gènes dans la levure bourgeonnante

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Nous décrivons un système basé sur la PCR et la recombinaison homologue pour générer des mutations ciblées dans les gènes d’histones dans les cellules de levure bourgeonnantes. Les allèles mutants qui en résultent résident sur leurs sites génomiques endogènes et aucune séquence d’ADN exogène n’est laissée dans le génome après la procédure. Étant donné que dans les cellules de levure haploïdes, chacune des quatre protéines d’histones de base est codée par deux gènes non alléliques avec des cadres de lecture ouverts (ORF) hautement homologues, il peut être problématique de cibler spécifiquement la mutagenèse sur l’un des deux gènes codant pour une protéine d’histones particulière. La stratégie que nous décrivons ici contourne ce problème en utilisant des séquences à l’extérieur, plutôt qu’à l’intérieur, de l’ORF des gènes cibles pour l’étape de recombinaison homologue. Une autre caractéristique de ce système est que les régions de l’ADN à l’origine des étapes de recombinaison homologue peuvent être rendues très étendues, augmentant ainsi la probabilité de succès des événements d’intégration. Ces caractéristiques rendent cette stratégie particulièrement bien adaptée à la mutagenèse des gènes des histones, mais peut également être adaptée à la mutagénèse d’autres gènes du génome de la levure.

Nous décrivons la production d&#39;un allèle HHT2 exprimant une protéine mutante de l&#39; histone H3 hébergeant une substitution à la position 53 d&#39;une arginine en un acide glutamique (R53E mutant H3) comme un exemple représentatif de la stratégie de mutagenèse ciblée in situ. Nous avons généré une souche dans laquelle l&#39;ensemble de l&#39; ORF de HHT2 est remplacé par le gène URA3 (...

Une stratégie pour générer des mutations dans les gènes d’histones à leur emplacement endogène chez Saccharomyces cerevisiae est présentée.

Targeted<em&gt; In Situ</em&gt; mutagenèse de Histone gènes dans la levure bourgeonnante

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

L'objectif général de cette procédure est de générer des mutations spécifiques dans les gènes d'histones à leur emplacement chromosomique endogène dans les cellules de levure bourgeonnante. Cette méthode peut être utilisée pour déterminer la contribution de résidus d'histones spécifiques dans divers processus utilisant la chromatine comme substrat, tels que la transcription de l'ADN, toutes les combinaisons. Le principal avantage de cette technique est que des gènes d'histones spécifiques peuvent être ciblés pour la mutagenèse, malgré le fait que, chez la levure, chaque protéine histone soit codée par deux gènes non alléliques hautement homologues.Après avoir généré une souche de levure dans laquelle le gène cible d'histone a été éliminé et remplacé par URA3, produire des produits de PCR pour deux fragments partiellement superposés du gène cible d'histone en préparant la réaction suivante pour la première moitié du gène. Pour la seconde moitié du gène, préparer une réaction de PCR similaire en utilisant des amorces différentes. Placer les réactions dans un thermocycleur et programmer le programme suivant.Faites migrer de 20 à 50 microlitres des réactions PCR sur un gel d'agarose à

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Source : Bennett, S. A., et al., Caractérisation des altérations de modification post-traductionnelle des histones dans les modèles de protéinopathie neurodégénérative de levure. J. Vis. Exp. (2019). Cette vidéo montre la procédure d’évaluation des modifications des histones dans les cellules de levure surexprimant les protéines neurodégénératives. Les étapes comprennent la lyse cellulaire, la centrifugation, l’électrophorèse, le transfert membranaire et la détection d’histones modifiées à...

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