Une chambre de mesure de la migration des cellules personnalisable

L’objectif global de cette procédure est de fournir un moyen simple d’étudier les effets des agents chimiotactiques et chimiopulsifs sur la migration cellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’interaction cellulaire, telles que les effets de différents facteurs de croissance sur la cicatrisation des plaies. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est facilement personnalisable pour différentes applications et simple d’utilisation pour les chercheurs de tous niveaux.

Aniqa Chowdhury, une étudiante de premier cycle, et Tyler Harvey, un étudiant diplômé de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, créez un fichier CAO avec la forme souhaitée du micro-canal. Ajustez la largeur et la longueur du canal pour obtenir le dégradé requis.

Ici, des carrés de 2,254 centimètres sont reliés par un canal de 0,127 centimètre de large. Ensuite, obtenez un morceau d’acrylique de l’épaisseur souhaitée afin de créer la bonne profondeur du microcanal. Une largeur de feuille acrylique d’environ un seizième de pouce est idéale car les feuilles plus épaisses sont difficiles à couper et les feuilles très fines peuvent se casser ou se déformer au cours du processus.

Importez le fichier CAO dans un appareil de découpe laser et placez la pièce acrylique sur la surface de coupe. Ensuite, découpez la chambre, selon le protocole du fabricant. Placez la découpe en acrylique en forme d’haltère fraîchement coupée dans une petite boîte de Pétri et couvrez-la jusqu’à ce qu’elle soit nécessaire.

Dans un bateau pesé, ajoutez dix parties d’une base en élastomère, avec une partie de l’agent de durcissement et remuez à l’aide d’une micro-pipette pendant cinq minutes. Transférez le mélange dans une chambre à vide et tirez un vide pendant 30 minutes pour éliminer toutes les bulles d’air emprisonnées dans le PDMS. Lorsque vous avez terminé, éteignez l’aspirateur et retirez le bateau de pesée.

Versez le PDMS dégazé sur une découpe acrylique en forme d’haltère dans une petite boîte de Pétri. Assurez-vous que le PDMS recouvre complètement l’insert. Laissez le PDMS durcir pendant au moins 18 heures à température ambiante, puis coupez soigneusement le PDMS autour de la pièce acrylique avec un scalpel et retirez l’insert.

Dans une armoire de culture cellulaire standard, placez la chambre à microcanaux dans une boîte de Pétri, côté trait vers le haut et recouvrez-la complètement avec de l’éthanol à 70 %. Fermez ensuite le capot et allumez la lumière UV. Exposez la chambre à la lumière UV pendant une à deux heures.

Après l’exposition, ouvrez la hotte à flux laminaire et attendez 15 minutes que la hotte rétablit l’écoulement. Ensuite, retirez l’éthanol à 70 % et lavez les chambres deux fois avec du PBS stérile. Utilisez un millilitre de PBS pour chaque lavage.

Après le lavage final, retirez le PBS et laissez les chambres sécher pendant la nuit, sans les couvercles. Récoltez le type de cellule à tester et ajoutez 100 microlitres de suspension cellulaire à 400 microlitres de bleu trypan à 0,4 % et mélangez doucement. Appliquez 100 microlitres de cette solution sur l’hémocytomètre en remplissant doucement les deux chambres sous la lamelle de verre.

Utilisez un microscope avec un objectif 10x pour faire la mise au point sur la grille de l’hémocytomètre. Ensuite, utilisez un compteur de comptage manuel pour compter les cellules vivantes et non soutenues dans les quatre ensembles de 16 carrés de l’hémocytomètre. Divisez le nombre total de cellules par quatre et multipliez ce nombre par 50 000 pour obtenir le nombre de cellules par millilitre de suspension de cellules.

Sur la base de ce calcul, ajoutez 2500 cellules et 100 microlitres de média dans un puits dans chaque chambre. Laissez les cellules reposer dans la chambre pendant 60 minutes, puis ajoutez des milieux supplémentaires. Pour commencer, ajoutez de l’agarose à de l’eau et faites chauffer la solution au micro-ondes pendant une minute, ou jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute et que la solution soit claire.

Laissez refroidir la solution pendant 15 à 30 secondes avant de la verser dans une boîte de Pétri. Pour éliminer les bulles, placez la boîte de Pétri dans une chambre à vide et laissez l’agarose se solidifier sous vide pendant 30 minutes. Une fois solidifié, coupez un cube d’agarose de deux millimètres sur deux millimètres avec un scalpel dans la boîte de Pétri.

Immergez complètement le cube dans une solution contenant la concentration souhaitée du facteur tactique de chimiothérapie et faites tremper le bloc d’agarose pendant la nuit à température ambiante. Placez ensuite le bloc d’agarose contenant le facteur tactique de chimiothérapie à l’extrémité de la chambre à microcanaux. Utilisez un marqueur, tel que des microbilles de polystyrène ou un défaut microscopique dans la chambre.

Pour identifier l’emplacement de départ relatif des cellules. Utilisez le logiciel d’imagerie pour prendre des images en accéléré du front de la cellule en mouvement toutes les heures pendant 12 heures. La série d’images montrée ici documente le mouvement d’un front cellulaire à travers le canal en réponse à un gradient de sérum bovin fœtal placé à l’extrémité opposée du canal.

La distance de migration a été mesurée en fonction de la distance du front de croissance par rapport à un défaut microscopique dans le dispositif. D’après ces mesures, la vitesse moyenne du front cellulaire était de 13,4 micromètres par heure. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures, avec un temps d’attente supplémentaire de 18 heures pour que le PDMS durcisse et de 12 heures supplémentaires pour l’imagerie en accéléré.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs de différents niveaux de compétence, y compris des étudiants de premier cycle ayant peu d’expérience en laboratoire, pour explorer facilement la cicatrisation des plaies et la migration cellulaire in vitro. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de retirer soigneusement l’insert acrylique du moule PDMS afin d’assurer la réussite de la production d’une chambre à microcanaux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de produire une chambre à microcanaux simple pour étudier la migration cellulaire en réponse à différents signaux chimiques.

À la suite de cette procédure, d’autres indices peuvent être étudiés, tels que de multiples gradients chimiques solubles, des substrats, des fluides et des champs électriques, afin d’étudier leur effet sur la migration cellulaire. N’oubliez pas que travailler avec des découpeuses laser peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l’obtention d’une formation appropriée et l’utilisation d’un équipement de protection individuelle doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.