Name: Différenciation efficace de pluripotentes cellules souches à NKX6-1 + pancréatiques progéniteurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Découvrez un protocole en quatre étapes pour différencier des cellules souches pluripotentes humaines en progéniteurs pancréatiques NKX6.1+. Cette méthode permet d'obtenir des pourcentages élevés de cellules positives pour la recherche sur le diabète.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ce manuscrit a été soutenu par un financement de la Toronto General et la Fondation Western et le Prix d&#39;études supérieures Réseau Banting &amp; Best Diabetes Centre-universitaire de santé.

1. Préparation des solutions et des médias NOTE: Préparer tous les médias pour la culture cellulaire dans un environnement stérile. Médias doit être fabriqué et utilisé immédiatement. Détails des réactifs sont fournis dans le tableau des matériaux. <ol><li> Différenciation des médias <ol><li> Préparer jour 0 Différenciation Médias: RPMI Medium avec 1% de glutamine, 2 uM CHIR 99021, 100 ng / ml activine A, 10 4 M MTG. </li><li> Préparer Jour 1-2 Différenciation Média: RPMI Medium avec 1% de glutamine, 100 ng / ml d&#39; activine A, 10 4 M MTG, 5 ng / ml de bFGF, acide 50 pg / ml Ascorbique. </li><li> Préparer Jour 3-5 Différenciation Média: RPMI Medium avec 1% de glutamine, 1% B27, 10 4 M MTG, 0,75 uM Dorsomorphin, 50 ng / ml FGF10. </li><li> Préparer Jour 6-7 Différenciation Médias: DMEM avec 1% de glutamine, 1% B27, 50 pg / ml d&#39;acide ascorbique, 50 ng / ml FGF10, 0,25 uM SANT-1, 2 uM d&#39;acide rétinoïque, 50 ng / ml NOGGIN. NOTE: rétinoïqueAcid devrait être ajouté aux médias dernier et les médias devraient être protégés de la lumière pour empêcher la dégradation oxydative 15. </li><li> Préparer Jour 8-12 Différenciation Média: DMEM avec 1% de glutamine, 1% de B27, 50 pg / ml d&#39;acide ascorbique, 50 ng / ml NOGGIN, 100 ng / ml de hEGF mM de nicotinamide 10. </li></ol></li><li> Préparer un tampon FACS: 10% de FBS dans du PBS, moins le calcium et le magnésium. </li></ol> 2. HESC Différenciation REMARQUE: Les cellules souches embryonnaires humaines sont décongelées, repiquées et étendu sur des fibroblastes embryonnaires de souris irradiées en présence d&#39;un milieu à base KOSR additionné de 16 bFGF. CSEh sont prêts pour la différenciation lorsque les cellules atteignent 80-95% de confluence. À ce moment , les colonies doivent être grandes avec des frontières définies et une «forme de dôme&quot; structure (figure 1A). Toute la culture cellulaire est effectuée en fond plat, des plaques de culture traitées de tissus revêtus de gélatine à 0,1%. Typiquement, les cellules sont cultivées en 6 ouplaques à 12 puits, dans des volumes de supports de 2 ml ou 1 ml, respectivement. <ol><li> Le jour 0, commencer la différenciation par le remplacement du média-KOSR avec Jour 0 Différenciation Media. </li><li> Les jours 1 et 2, secouez doucement la plaque pour éliminer toutes les cellules mortes de la monocouche avant d&#39;aspirer. Remplacer par jour 1-2 Différenciation Media. </li><li> Au jour 3, les cellules de récolte pour la cytométrie de flux. Si les cellules expriment plus de 90% CXCR4 + / CD117 +, passez à l&#39; étape 2.4. </li><li> Les jours 3 et 5, secouez doucement la plaque pour éliminer toutes les cellules mortes de la monocouche avant aspiration. Remplacer par Jour 3-5 Différenciation Media. </li><li> Les jours 6 et 7, remplacer par jour 6-7 Différenciation Media. </li><li> Les jours 8, 10 et 12, remplacer par jour 8-12 Différenciation Media. </li><li> Le jour 13, les cellules de récolte pour cytométrie en flux pour déterminer PDX1 et d&#39;expression NKX6-1. </li></ol> 3. Les cellules de récolte pour l&#39;analyse de cytométrie en flux <ol><li> Dissocier les cellules avecune solution de trypsine commerciale 1x selon le protocole du fabricant et on incube à 37 ° C pendant 3 min. </li><li> Enlever la solution de trypsine commerciale et resuspendre cellules individuelles dans 1000 ul FACS tampon avec 30 ul DNase I. </li><li> cellules de filtrage en utilisant un filet de nylon tamis cellulaire de 35 pm et transférer dans un tube à centrifuger. </li><li> Centrifuger les cellules à 455 g pendant 5 min. Préparer les cellules soit pour la coloration en direct ou fixe. </li></ol> 4. Coloration pour cytométrie de flux <ol><li> Débit préparation pour la coloration en direct le jour 3 <ol><li> Resuspendre les cellules dans 1000 ul FACS tampon. Transfert 200 pi (environ 1-3 x 10 5 cellules) dans deux puits d&#39;une plaque à 96 puits (pour les deux échantillons non colorés et colorées). </li><li> Centrifuger la plaque à 931 g pendant 2 min. Retirer le surnageant en retournant la plaque. </li><li> Colorer avec des anticorps primaires conjugués, CXCR4: APC et CD117: PE (voir M atières Table) pour 30 min à température ambiante à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Centrifuger la plaque à 931 g pendant 2 min. Retirer le surnageant en retournant la plaque. </li><li> échantillons Resuspendre dans 100 pi de tampon FACS. </li><li> Centrifuger la plaque à 931 g pendant 2 min. Retirer le surnageant en retournant la plaque. </li><li> Resuspendre chaque échantillon et le transfert dans un volume total de 300-500 ul FACS tampon à 1 ml de tubes à essai micro ou 5 ml tubes à fond rond. </li><li> Échantillons sur Exécuter dans le cytomètre de flux 17. Si les échantillons ne peuvent pas être exécutés immédiatement, conserver à 4 ° C à l&#39;abri de la lumière. </li></ol></li><li> Débit préparation pour la coloration fixe le jour 13 <ol><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans une solution de fixation / de perméabilisation commerciale pendant 24 heures à 4 ° C. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 455 g pendant 5 min. Remettre en suspension dans 400 ul solution Perm / Wash. </li><li> Transférer 200 pi de l&#39;échantillon (environ 0,5-1 x 10 6 cellules) à two puits d&#39;une plaque à 96 puits (pour le contrôle IgG et PDX1 / NKX6-1 coloration). Centrifuger à 931 g pendant 2 min. </li><li> Remettre en suspension les culots cellulaires dans une solution Perm / Wash 100 pi contenant l&#39; anti-PDX1 et des anticorps anti-NKX6-1 de commande primaire ou de l&#39; isotype (voir tableau des matériaux). Incuber une nuit à 4 ° C. </li><li> Centrifuger la plaque à 931 g pendant 2 min. Retirer le surnageant en retournant la plaque. échantillons Resuspendre dans 100 pi de solution Perm / Wash. </li><li> Centrifuger la plaque à 931 g pendant 2 min. Retirer le surnageant en retournant la plaque. </li><li> Remettre en suspension les échantillons dans 100 ul de Perm / Wash contenant des anticorps secondaires à température ambiante pendant 1 heure, à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Centrifuger la plaque à 931 g pendant 2 min. Retirer le surnageant en retournant la plaque. </li><li> échantillons Resuspendre dans 100 pi de Perm / Wash Solution. </li><li> Centrifuger la plaque à 931 g pendant 2 min. Retirer le surnageant en retournant la plaque. </li><li> Représentantmanger étape 4.2.9 et 4.2.10. </li><li> Resuspendre chaque échantillon et le transfert dans un volume total de 300-500 ul FACS tampon à 1 ml de tubes à essai micro ou 5 ml tubes à fond rond. </li><li> Échantillons sur Exécuter dans le cytomètre de flux 17. Si les échantillons ne peuvent pas être exécutés immédiatement, conserver à 4 ° C à l&#39;abri de la lumière. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Canadian Diabetes Association. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes">http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes</a> (2016).</li>
<li>Cogger, K., Nostro, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+cell+replacement+therapies+for+the+treatment+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes.</a> Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+NKX6-1%2B+pancreatic+progenitors+from+multiple+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).</li>
<li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Functional+Human+Pancreatic+beta+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. , (2014).</li>
<li>Kroon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+endoderm+derived+from+human+embryonic+stem+cells+generates+glucose-responsive+insulin-secreting+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo.</a> Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+into+functional+islets+capable+of+treating+pre-existing+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice.</a> Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).</li>
<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li>
<li>Gouon-Evans, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP-4+is+required+for+hepatic+specification+of+mouse+embryonic+stem+cell-derived+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm.</a> Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).</li>
<li>Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-promoter-factor+1+is+required+for+pancreas+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice.</a> Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).</li>
<li>Pan, F. C., Wright, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+organogenesis%3A+from+bud+to+plexus+to+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland.</a> Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).</li>
<li>Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nkx6+transcription+factors+and+Ptf1a+function+as+antagonistic+lineage+determinants+in+multipotent+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors.</a> Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipotent+progenitor+domain+guides+pancreatic+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis.</a> Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).</li>
<li>Sander, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeobox+gene+Nkx6.1+lies+downstream+of+Nkx2.2+in+the+major+pathway+of+beta-cell+formation+in+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas.</a> Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).</li>
<li>Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+stability+in+stem+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid stability in stem cell cultures.</a> Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).</li>
<li>Korytnikov, R., Nostro, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+polyhormonal+and+multipotent+pancreatic+progenitor+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells.</a> Methods. , 56-64 (2016).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+signaling+through+TGFbeta+family+members+and+WNT+regulates+patterning+and+pancreatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Development. 138 (5), 861-871 (2011).</li>
<li>Schulz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+system+for+production+of+functional+pancreatic+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 7 (5), e37004(2012).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Générer avec succès NKX6-1 + progéniteurs pancréatiques de hPSCs in vitro repose sur l&#39;utilisation de cultures de haute qualité de hPSCs et la différenciation dirigée impliquant la régulation précise des voies de signalisation spécifiques qui régissent les étapes clés du développement au cours du développement du pancréas. Bien que ce protocole peut être utilisé pour induire l&#39; expression robuste de NKX6-1 à travers une variété de lignes comme indiqué précédemment HPSC 3,</s...

La prévalence du diabète augmente et selon l&#39;Association canadienne du diabète, il est estimé que plus de 11 millions de personnes au Canada sont diabétiques ou prédiabétiques, avec 5-10% de ces personnes ayant le diabète de type 1 (DT1) 1. DT1 est une maladie auto-immune qui est provoquée par la destruction des cellules ß produisant de l&#39;insuline qui sont situées dans les îlots de Langerhans. Actuellement, les personnes vivant avec le DT1 nécessitent des sources exogènes de l&#39; insuline 2. Malgré les progrès de la thérapie à l&#39;insuline, les patients DT1 continuent d&#39;avoir un moment difficile la régulation de leurs niveaux de glucose dans le sang et continuent de souffrir à la fois hypo- et hyperglycémie. Une forme prometteuse de traitement pour restaurer normoglycémie dans DT1 est l&#39;utilisation de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh), qui pourraient être utilisés pour générer une offre illimitée de cellules productrices d&#39; insuline ß la fois in vivo et in vitro 3, 4, 5, 6, 7. Différencier CSEh à ß-like cellules pourraient permettre d&#39;étudier le diabète in vitro, permettant l&#39;identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour le diabète de type 2 et de fournir des cellules pour la transplantation chez des patients DT1. La tentative la plus réussie de générer des cellules productrices d&#39;insuline à partir de cellules hES in vitro est de récapituler les événements embryonnaires qui se produisent au cours du développement du pancréas 4, 5. Cela implique la manipulation des voies de signalisation distinctes pour modéliser avec précision les étapes clés du pancréas en développement. Le développement du pancréas commence par l&#39;induction de l&#39;endoderme définitif, qui est caractérisé par l&#39;expression de CXCR4 et CD117 (c-KIT) , 8, 9. Régulation précise de definitive organisation endoderme est nécessaire pour la formation du tube intestinal, qui subit alors antéro-postérieur à patterning et ventrale-dorsale. Dorsale et ventrale du pancréas bourgeons sortent de la zone de l&#39;intestin antérieur , postérieur , qui exprime le gène à homéoboîte pancréatique et duodénal (Pdx1), qui est nécessaire pour le développement du pancréas 10. Le fusible dorsale et ventrale pour former les bourgeons du pancréas, qui est ensuite soumis à un remodelage epithelial et d&#39; expansion 11. Engagement envers le endocrines et exocrines lignée est accompagnée par la production de cellules souches multipotentes (PPM) qui expriment, entre autres, les facteurs de transcription Pdx1, et Nkx6.1 Ptf1a 12, 13. PPMs qui deviendront des cellules endocrines et canalaires continuent d&#39;exprimer Nkx6-1 tout en diminuant l&#39; expression Ptf1a. Contrairement à cela, les cellules de la lignée exocrines vont perdre expression de Nkx6-1 et maintenir l&#39; expression Ptf1a 12. Le facteur de transcription Nkx6-1 a un rôle clé dans le développement du pancréas, en particulier au cours de la différenciation des cellules progénitrices endocrines à ß cellules. Comme décrit précédemment, la suppression des résultats Nkx6-1 dans la formation altération des cellules ß du pancréas 14 au cours du développement. Par conséquent, la génération de cellules bêta productrices d&#39; insuline in vitro et in vivo nécessite l&#39;induction efficace des Nkx6-1. Nous avons récemment développé un protocole pour générer efficacement Pdx1 + / NKX6-1 + progéniteurs pancréatiques de hPSCs. Ces progéniteurs pancréatiques HPSC dérivés génèrent des cellules ß matures sur la transplantation dans des souris immunodéficientes 3. Le protocole de différenciation peut être divisé en 4 étapes caractéristiques: 1) endoderme définitif induction, 2) foregut postérieure patterning, 3) la spécification du pancréas et 4) induction NKX6-1. Ici, nous fournissons une description détaillée de chaque étape de la différenciation dirigée.

<table><tbody><tr><td><Milieux > forts et cytokines</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Thioglycérol (MTG)</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D</td><td>338-AC/CF&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplément</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Buffer</td><td>BD Bioscience</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>BD Perm/Wash buffer, 1x</td><td>BD Bioscience</td><td>554723</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>CHIR990210</td><td>Tocris</td><td>4423a</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle Medium modifié (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>VWR</td><td>80510-412&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphine</td><td>Sigma</td><td>P5499</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Wisent</td><td>88150</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R& D</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine de peau de porc</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>NO636</td><td></td></tr><tr><td>NOGGIN</td><td>R& D</td><td>3344-NG</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Acide rétinoïque</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>SANT-1</td><td>Tocris</td><td>1974</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x), rouge de phénol</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Anticorps pour la cytométrie en flux (dilutions de travail)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD117 PE (1:100)</td><td>Life Technologies</td><td>CD11705</td><td></td></tr><tr><td>CXCR4 APC (1:50)</td><td>BD&nbsp ; Bioscience</td><td>551966</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-souris d’âne (H+L), conjugué Alexa Fluor 647 (1:400)</td><td>Life Technologies</td><td>A-31571</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-chèvre d’âne (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400)&nbsp ;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>705-546-147</td><td></td></tr><tr><td>Souris de contrôle des isotypes IgG&nbsp ;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.&nbsp ;</td><td>015-000-003</td><td></td></tr><tr><td>Contrôle des isotypes IgG de chèvre</td><td>R& D&nbsp ; &nbsp ;</td><td>AB-108-C</td><td></td></tr><tr><td>NKX6-1 (1:2 000)</td><td>DSHB</td><td>F55A10</td><td></td></tr><tr><td>PDX1 (1:100)</td><td>R& D</td><td>AF2419</td><td></td></tr></tbody></table>

différenciation efficace de pluripotentes cellules souches à nkx6-1<sup&gt; +</sup&gt; pancréatiques progéniteurs

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Les cellules souches pluripotentes ont la capacité d&#39;auto renouveler et de se différencier de multiples lignées, elles une source intéressante pour la production de cellules progénitrices pancréatiques qui peuvent être utilisés pour l&#39;étude et le traitement futur du diabète de décision. Cet article décrit un protocole de différenciation à quatre étages conçu pour générer des cellules progénitrices pancréatiques à partir de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh). Ce protocole peut être appliqué à un certain nombre de cellules souches pluripotentes humaines (lignes HPSC). L&#39;approche adoptée pour générer des cellules progénitrices pancréatiques est de différencier les CSEh pour modéliser avec précision les étapes clés du développement du pancréas. Ceci commence par l&#39;induction de l&#39;endoderme définitif, qui est atteint par la mise en culture des cellules en présence d&#39;activine A, le facteur de croissance des fibroblastes basique (bFGF) et CHIR990210. En outre la différenciation et la structuration avec Fibroblast Growth Factor 10 (FGF10) et Dorsomorphin génère des cellules ressemblant à la foregut postérieure. L&#39;ajout de RetinOïque, NOGGIN, SANT-1 et FGF10 différencie les cellules de l&#39;intestin antérieur postérieur dans des cellules caractéristiques de l&#39;endoderme pancréatique. Enfin, la combinaison du facteur de croissance épidermique (EGF), le nicotinamide et NOGGIN conduit à la génération efficace de PDX1 + / + NKX6-1 cellules. La cytométrie en flux est réalisée pour confirmer l&#39;expression de marqueurs spécifiques à des étapes clés du développement du pancréas. Les Pdx1 + / + NKX6-1 progénitrices pancréatiques à l&#39;issue de l&#39; étape 4 sont capables de générer des cellules bêta matures lors de la transplantation chez des souris immunodéficientes et peuvent être en outre différenciés pour générer des cellules productrices d&#39;insuline in vitro. Ainsi, la génération efficace de PDX1 + / NKX6-1 + progéniteurs pancréatiques, comme l&#39;a démontré dans ce protocole, est d&#39; une grande importance car elle fournit une plate - forme pour étudier le développement du pancréas humain in vitro et fournit une source de cellules ayant le potentiel de se différencier en les cellules bêta qui pourraient Eventually être utilisé pour le traitement du diabète.

Génération efficace de progéniteurs du pancréas repose sur la croissance et le maintien des cellules indifférenciées , suivie par l&#39;addition précise des molécules de signalisation spécifiques au cours du protocole de différenciation, comme cela est illustré dans le schéma de la figure 1A. Au jour 0, les cellules non différenciées devrait être de 80 à 95% de confluence et les colonies doivent avoir des bords définis (figure 1A). Au cours de l&#39;étap...

Nous décrivons ici un protocole 4 étapes pour différencier les cellules souches embryonnaires humaines à NKX6-1 + progéniteurs pancréatiques in vitro. Ce protocole peut être appliqué à une variété de lignées de cellules souches pluripotentes humaines.

Différenciation efficace de pluripotentes cellules souches à NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; pancréatiques progéniteurs

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

L'objectif général de cette procédure est de générer efficacement des progéniteurs pancréatiques exprimant NKX6.1 à partir de cellules souches pluripotentes humaines in vitro, en différenciant les cellules à travers quatre stades clés du développement pancréatique. En différenciant les cellules souches pluripotentes humaines à travers quatre stades clés du développement pancréatique, ce protocole fournit un modèle pour étudier le développement du pancréas humain in vitro. Le principal avantage de cette technique par rapport aux protocoles existants est que nous sommes capables de générer de forts pourcentages de cellules progénitrices pancréatiques positives pour NKX6.1 en utilisant diverses lignées de cellules souches pluripotentes humaines.Étant donné que les progéniteurs pancréatiques ont la capacité de générer des cellules semblables à des cellules bêta productrices d'insuline, cette technique nous offrira la possibilité de développer des cellules pour le traitement du diabète, la découverte de médicaments et la modélisation des maladies. Au jour zéro, commencez la différenciation en remplaçant le milieu contenant le substitut sérique KnockOut par le milieu de différenciation d

efficient-differentiation-pluripotent-stem-cells-to-nkx6-1-pancreatic

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Cette vidéo montre la génération de cellules progénitrices neurales à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) non transgéniques et transgéniques. Les hPSC sont différenciées en cellules progénitrices neurales à l’aide d’un milieu de différenciation neuronale. Alors que la différenciation est induite dans les cellules non transgéniques à l’aide de petites molécules, les hPSC transgéniques sont différenciées par l’ajout d’un antibiotique qui induit le promoteur d’un facteur de...

Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines non transgéniques et transgéniques en cellules progénitrices neurales

Ici, nous décrivons une méthode pour la purification de cellules embryonnaires humaines différenciées souches qui se sont engagés envers l'endoderme définitif pour l'amélioration des applications en aval et d'autres différenciations.

Une méthode rapide et efficace pour la purification des cellules endoderme Généré à partir d&#39;embryons humains Cellules souches

Protocoles pour générer des lignes de mutants HPSC en utilisant la plate-forme iCRISPR et de différencier hPSCs dans les cellules ß-like glucose-sensibles sont décrits. La combinaison de la technologie d'édition génome avec une différenciation HPSC dirigée fournit une plate-forme puissante pour l'analyse systématique du rôle des déterminants de la lignée dans le développement humain et de la progression de la maladie.

Genome Montage et différenciation dirigée des hPSCs pour Interrogation Déterminants Lineage dans le développement du pancréas humain

Ce protocole décrit une méthode pour générer des progéniteurs interneurones corticaux et des interneurones post-mitotiques précurseurs de cellules souches embryonnaires de souris à l’aide d’une méthode modifiée de corps-à-monocouche embryoïdes. Ces cellules souches/précurseurs peuvent être utilisés in vitro fluorescent triés et transplantés dans le néocortex néonatal pour l’étude de détermination de sort ou utilisés dans des applications thérapeutiques.

Différenciation des cellules souches embryonnaires de souris en précurseurs des interneurones corticaux

Nous présentons ici un protocole détaillé afin de différencier les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) dans les protéines de boîte homéotique pancréas/duodénum 1+ (PDX1+) pour la génération des lignées du pancréas, les cellules basé sur la croissance de monocouche de type non colonie de dissocier les cellules individuelles. Cette méthode convient pour la production homogènes cellules dérivées d’hPSC, la manipulation génétique et dépistage.

Génération efficace du pancréas/duodénum homéotique Protein 1+ postérieure Foregut/pancréatique progéniteurs de hPSCs dans les Cultures de l’adhérence

Ce protocole détaille une méthode monocouche, sans sérum, pour générer efficacement des cellules hépatocytes à partir de cellules souches pluripotentes humaines (HPSC) en 18 jours. Cela implique six étapes que les hPSC se différencient séquentiellement en types de cellules intermédiaires tels que la strie primitive, endoderm définitif, prégut postérieur et progéniteurs de bourgeons hépatiques avant de former des cellules hépatocytes.

Différenciation efficace des cellules souches pluripotentes humaines en cellules hépatiques

Dans ce protocole, nous décrivons une stratégie de différenciation stable et très efficace pour la génération de neurones sympathiques postganglioniques à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Ce modèle rendra les neurones disponibles pour l’utilisation d’études sur de multiples troubles autonomes.

Différenciation efficace des neurones sympathiques postganglioniques utilisant des cellules souches pluripotentes humaines dans des conditions de culture sans alimentation et définies chimiquement

L’objectif de cet article est de fournir une approche standardisée pour induire la différenciation des progéniteurs hépatiques humains à partir de cellules souches pluripotentes. Le développement de cette procédure avec des formulations de milieux prêtes à l’emploi offre à l’utilisateur un système facile pour générer des cellules hépatiques humaines pour la recherche biomédicale et la traduction.

Spécification du progéniteur hépatique à partir de cellules souches pluripotentes à l’aide d’un système de différenciation défini

Le présent protocole décrit une méthode améliorée pour augmenter la co-expression des facteurs de transcription PDX1 et NKX6.1 chez les progéniteurs pancréatiques dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) dans des monocouches planes. Ceci est réalisé en reconstituant la matrice fraîche, en manipulant la densité cellulaire et en dissociant les cellules endodermiques.

Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en précurseurs de cellules bêta pancréatiques dans un système de culture 2D

La différenciation des cellules souches en cellules d’îlots pancréatiques offre une solution alternative au traitement conventionnel du diabète et à la modélisation de la maladie. Nous décrivons un protocole détaillé de culture de cellules souches qui combine un kit de différenciation commercial avec une méthode préalablement validée pour aider à produire des îlots dérivés de cellules souches sécrétrices d’insuline dans une boîte.

Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en amas d’îlots pancréatiques producteurs d’insuline

Cet article présente un protocole de différenciation dirigée et d’analyse fonctionnelle des cellules de type β-cellules. Nous décrivons les conditions de culture et les passages optimaux pour les cellules souches pluripotentes humaines avant de générer des cellules pancréatiques productrices d’insuline. La différenciation en six étapes progresse de la formation définitive de l’endoderme à des cellules fonctionnelles de type β sécrétant de l’insuline en réponse au glucose.

Protocole optimisé pour la génération de cellules pancréatiques fonctionnelles sécrétant de l’insuline à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Découvrez un protocole en quatre étapes pour différencier des cellules souches pluripotentes humaines en progéniteurs pancréatiques NKX6.1+. Cette méthode permet d'obtenir des pourcentages élevés de cellules positives pour la recherche sur le diabète.

Différenciation efficace de pluripotentes cellules souches à NKX6-1

Explorer plus de vidéos