Différenciation efficace de pluripotentes cellules souches à NKX6-1 ⁺ pancréatiques progéniteurs

L’objectif global de cette procédure est de générer efficacement des progéniteurs pancréatiques exprimant NKX6.1 à partir de cellules souches pluripotentes humaines in vitro en différenciant les cellules à travers quatre étapes clés du développement pancréatique. En différenciant les cellules souches pluripotentes humaines à travers quatre étapes clés du développement pancréatique, ce protocole fournit un modèle pour étudier le développement du pancréas humain in vitro. Le principal avantage de cette technique par rapport aux protocoles existants est que nous sommes capables de générer des pourcentages élevés de cellules progénitrices pancréatiques positives pour NKX6.1 en utilisant une variété de lignées de cellules souches pluripotentes humaines.

Étant donné que les progéniteurs pancréatiques ont le potentiel de générer des cellules bêta productrices d’insuline, cette technique nous donnera l’occasion de développer des cellules pour le traitement du diabète, pour la découverte de médicaments et pour la modélisation de maladies. Au jour zéro, commencez la différenciation en remplaçant le milieu de remplacement du sérum KnockOut par un milieu de différenciation du jour zéro. Ensuite, un et deux jours, secouez doucement la plaque pour éliminer les cellules mortes de la monocouche avant d’aspirer le milieu.

Ensuite, remplacez-le par des milieux de différenciation du premier au deuxième jour. Le troisième jour, récoltez les cellules pour la cytométrie en flux. Si les cellules expriment plus de 90 % de CXCR4 et CD117, l’efficacité est atteinte.

Ensuite, secouez doucement la plaque pour éliminer toutes les cellules mortes de la monocouche avant l’aspiration et remplacez-la par un milieu de différenciation du troisième au cinquième jour. Il est important d’assurer une induction efficace de la sous-derme définitive dès le troisième jour par cytométrie en flux. Si le pourcentage de cellules exprimant à la fois CXCR4 et CD117 est inférieur à 90 %, la différenciation vers les progéniteurs pancréatiques sera probablement compromise.

Les sixième et septième jours, remplacez le média par un média de différenciation des sixième et septième jours. Les jours huit, 10 et 12, remplacez le milieu par un milieu de différenciation du huitième au 12e jour. Puis, le 13e jour, récoltez les cellules pour la cytométrie en flux afin de déterminer l’expression de PDX1 et NKX6.1.

Pour récolter les cellules pour l’analyse par cytométrie en flux, dissociez les cellules d’une solution commerciale de trypsine selon le protocole du fabricant et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Après trois minutes, retirez la solution de trypsine et remettez les cellules individuelles en suspension dans 1 000 microlitres de tampon de fax avec 30 microlitres d’ADN One. Filtrez ensuite les cellules à l’aide d’une passoire à cellules en nylon de 35 micromètres et transférez-les dans un microtube à centrifuger.

Centrifugez les cellules à 455 fois g pendant cinq minutes avant de préparer les cellules pour la coloration vivante ou fixe. Maintenant, résuspendez les cellules dans 1 000 microlitres de mémoire tampon de télécopie. Transférez 200 microlitres dans deux puits d’une plaque de 96 puits pour les échantillons non colorés et colorés.

Ensuite, centrifugez la plaque à 931 fois g pendant deux minutes, puis retirez le surnageant en inversant la plaque, colorez les cellules avec l’anticorps conjugué primaire dans un volume final de 100 microlitres pendant 30 minutes à température ambiante et protégez-les de la lumière. Ensuite, centrifugez la plaque à 931 fois g pendant deux minutes, après deux minutes, retirez le surnageant en inversant la plaque. Ensuite, mettez à nouveau les échantillons en suspension dans 100 microlitres de tampon de télécopie.

Ensuite, centrifugez la plaque 931 fois g pendant deux minutes. Et retirez le surnageant en inversant la plaque. Ensuite, mettez les échantillons en suspension dans 300 à 500 microlitres de tampon de télécopie, transférez-les dans les microtubes à essai d’un millilitre ou les tubes à fond rond de cinq millilitres et analysez les échantillons sur cytomètre en flux.

Si les échantillons ne peuvent pas être analysés immédiatement, stockez-les à quatre degrés Celsius et protégez-les de la lumière. Dans cette procédure, mettez à nouveau en suspension la pastille cellulaire dans une solution de fixation commerciale et perméable pendant 24 heures à quatre degrés Celsius. Après 24 heures, centrifugez l’échantillon à 455 fois g pendant cinq minutes, puis mettez-le en suspension dans 400 microlitres de solution de lavage permanente commerciale.

Ensuite, transférez 200 microlitres de l’échantillon dans deux puits d’une plaque de 96 puits pour le contrôle IGG et la coloration PDX1, NKX6.1, centrifugez la plaque à 931 fois g pendant deux minutes. Ensuite, mettez à nouveau en suspension les pastilles cellulaires dans 100 microlitres de solution de lavage permanent commerciale contenant des anticorps primaires ou de contrôle isotopique anti-PDX1 et anti-NKX61. Incuber-les toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Le lendemain, centrifugez la plaque à 931 fois g pendant deux minutes, retirez le surnageant en inversant la plaque et remettez les échantillons en suspension dans 100 microlitres de la solution de lavage permanente commerciale. Ensuite, centrifugez la plaque à 931 fois g pendant deux minutes. Retirez le surnageant en inversant la plaque.

Ensuite, suspendez à nouveau les échantillons dans 100 microlitres de solution de lavage permanent contenant des anticorps secondaires à température ambiante pendant une heure et protégez-le de la lumière. Après une maison, centrifugez la plaque 931 fois g pendant deux minutes, puis retirez le surnageant en inversant la plaque, puis remettez les échantillons en suspension dans 100 microlitres de solution commerciale de lavage permanent, centrifugez la plaque à 931 fois g pendant deux minutes, retirez le surnageant en inversant la plaque. Ensuite, mettez à nouveau l’échantillon en suspension dans 100 microlitres de solution de lavage permanent du commerce et centrifugez la plaque à 931 fois g pendant deux minutes avant de retirer le surnageant.

Ensuite, remplacez les échantillons en suspension dans 300 à 500 microlitres de tampon de télécopie et transférez-les dans des tubes à essai séparés d’un millilitre ou de cinq millilitres à fond rond pour la cytométrie en flux. On voit ici un sématique de l’induction du progéniteur pancréatique à partir de cellules souches embryonnaires humaines qui indique le jour de la différenciation, le stade mental de développement, le milieu de base et les cytokines ajoutées à chaque étape. Et voici les images de contraste de phase aux étapes clés de la différenciation pancréatique.

Les cellules H1 ont été différenciées selon le protocole de différenciation en quatre étapes décrit. Avec des cellules souches embryonnaires humaines indifférenciées au jour zéro, un endoderme définitif au premier stade, un intestin postérieur quatre au stade deux, un endoderme pancréatique au stade trois et des progéniteurs pancréatiques endodermiques positifs NKX6.1 au stade quatre. Cette figure montre les graphiques de cytométrie en flux représentatifs du troisième jour pour la coloration des anticorps CXCR4 PE et CD117 APC.

Voici l’échantillon non coloré et voici l’échantillon coloré. Et cette figure montre des graphiques représentatifs de cytométrie en flux du jour 13 pour les cellules progénitrices pancréatiques dérivées du quatrième stade exprimant NKX61 et PDX1. Il s’agit du contrôle IGG et de l’échantillon coloré.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 13 jours. Cependant, cela peut varier en fonction de la lignée cellulaire utilisée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de tester tous les agents en raison de la variabilité d’un lot à l’autre.

Après avoir suivi la procédure, les cellules progénitrices pancréatiques positives NKX6.1 peuvent être différenciées en cellules bêta productrices d’insuline en utilisant d’autres protocoles publiés. Cela fournit une plate-forme pour étudier la maturation et le développement des cellules bêta in vitro. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de différencier efficacement les cellules souches pluripotentes humaines en progéniteurs pancréatiques en faisant passer les cellules par quatre étapes clés de développement.