Name: Différenciation efficace de pluripotentes cellules souches à NKX6-1 + pancréatiques progéniteurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Découvrez un protocole en quatre étapes pour différencier des cellules souches pluripotentes humaines en progéniteurs pancréatiques NKX6.1+. Cette méthode permet d'obtenir des pourcentages élevés de cellules positives pour la recherche sur le diabète.

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Ce manuscrit a été soutenu par un financement de la Toronto General et la Fondation Western et le Prix d&#39;études supérieures Réseau Banting &amp; Best Diabetes Centre-universitaire de santé.

1. Préparation des solutions et des médias NOTE: Préparer tous les médias pour la culture cellulaire dans un environnement stérile. Médias doit être fabriqué et utilisé immédiatement. Détails des réactifs sont fournis dans le tableau des matériaux. <ol><li> Différenciation des médias <ol><li> Préparer jour 0 Différenciation Médias: RPMI Medium avec 1% de glutamine, 2 uM CHIR 99021, 100 ng / ml activine A, 10 4 M MTG. </li><li> Préparer Jour 1-2 Différenciation Média: RPMI Medium avec 1% de glutamine, 100 ng / ml d&#39; activine A, 10 4 M MTG, 5 ng / ml de bFGF, acide 50 pg / ml Ascorbique. </li><li> Préparer Jour 3-5 Différenciation Média: RPMI Medium avec 1% de glutamine, 1% B27, 10 4 M MTG, 0,75 uM Dorsomorphin, 50 ng / ml FGF10. </li><li> Préparer Jour 6-7 Différenciation Médias: DMEM avec 1% de glutamine, 1% B27, 50 pg / ml d&#39;acide ascorbique, 50 ng / ml FGF10, 0,25 uM SANT-1, 2 uM d&#39;acide rétinoïque, 50 ng / ml NOGGIN. NOTE: rétinoïqueAcid devrait être ajouté aux médias dernier et les médias devraient être protégés de la lumière pour empêcher la dégradation oxydative 15. </li><li> Préparer Jour 8-12 Différenciation Média: DMEM avec 1% de glutamine, 1% de B27, 50 pg / ml d&#39;acide ascorbique, 50 ng / ml NOGGIN, 100 ng / ml de hEGF mM de nicotinamide 10. </li></ol></li><li> Préparer un tampon FACS: 10% de FBS dans du PBS, moins le calcium et le magnésium. </li></ol> 2. HESC Différenciation REMARQUE: Les cellules souches embryonnaires humaines sont décongelées, repiquées et étendu sur des fibroblastes embryonnaires de souris irradiées en présence d&#39;un milieu à base KOSR additionné de 16 bFGF. CSEh sont prêts pour la différenciation lorsque les cellules atteignent 80-95% de confluence. À ce moment , les colonies doivent être grandes avec des frontières définies et une «forme de dôme&quot; structure (figure 1A). Toute la culture cellulaire est effectuée en fond plat, des plaques de culture traitées de tissus revêtus de gélatine à 0,1%. Typiquement, les cellules sont cultivées en 6 ouplaques à 12 puits, dans des volumes de supports de 2 ml ou 1 ml, respectivement. <ol><li> Le jour 0, commencer la différenciation par le remplacement du média-KOSR avec Jour 0 Différenciation Media. </li><li> Les jours 1 et 2, secouez doucement la plaque pour éliminer toutes les cellules mortes de la monocouche avant d&#39;aspirer. Remplacer par jour 1-2 Différenciation Media. </li><li> Au jour 3, les cellules de récolte pour la cytométrie de flux. Si les cellules expriment plus de 90% CXCR4 + / CD117 +, passez à l&#39; étape 2.4. </li><li> Les jours 3 et 5, secouez doucement la plaque pour éliminer toutes les cellules mortes de la monocouche avant aspiration. Remplacer par Jour 3-5 Différenciation Media. </li><li> Les jours 6 et 7, remplacer par jour 6-7 Différenciation Media. </li><li> Les jours 8, 10 et 12, remplacer par jour 8-12 Différenciation Media. </li><li> Le jour 13, les cellules de récolte pour cytométrie en flux pour déterminer PDX1 et d&#39;expression NKX6-1. </li></ol> 3. Les cellules de récolte pour l&#39;analyse de cytométrie en flux <ol><li> Dissocier les cellules avecune solution de trypsine commerciale 1x selon le protocole du fabricant et on incube à 37 ° C pendant 3 min. </li><li> Enlever la solution de trypsine commerciale et resuspendre cellules individuelles dans 1000 ul FACS tampon avec 30 ul DNase I. </li><li> cellules de filtrage en utilisant un filet de nylon tamis cellulaire de 35 pm et transférer dans un tube à centrifuger. </li><li> Centrifuger les cellules à 455 g pendant 5 min. Préparer les cellules soit pour la coloration en direct ou fixe. </li></ol> 4. Coloration pour cytométrie de flux <ol><li> Débit préparation pour la coloration en direct le jour 3 <ol><li> Resuspendre les cellules dans 1000 ul FACS tampon. Transfert 200 pi (environ 1-3 x 10 5 cellules) dans deux puits d&#39;une plaque à 96 puits (pour les deux échantillons non colorés et colorées). </li><li> Centrifuger la plaque à 931 g pendant 2 min. Retirer le surnageant en retournant la plaque. </li><li> Colorer avec des anticorps primaires conjugués, CXCR4: APC et CD117: PE (voir M atières Table) pour 30 min à température ambiante à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Centrifuger la plaque à 931 g pendant 2 min. Retirer le surnageant en retournant la plaque. </li><li> échantillons Resuspendre dans 100 pi de tampon FACS. </li><li> Centrifuger la plaque à 931 g pendant 2 min. Retirer le surnageant en retournant la plaque. </li><li> Resuspendre chaque échantillon et le transfert dans un volume total de 300-500 ul FACS tampon à 1 ml de tubes à essai micro ou 5 ml tubes à fond rond. </li><li> Échantillons sur Exécuter dans le cytomètre de flux 17. Si les échantillons ne peuvent pas être exécutés immédiatement, conserver à 4 ° C à l&#39;abri de la lumière. </li></ol></li><li> Débit préparation pour la coloration fixe le jour 13 <ol><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans une solution de fixation / de perméabilisation commerciale pendant 24 heures à 4 ° C. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 455 g pendant 5 min. Remettre en suspension dans 400 ul solution Perm / Wash. </li><li> Transférer 200 pi de l&#39;échantillon (environ 0,5-1 x 10 6 cellules) à two puits d&#39;une plaque à 96 puits (pour le contrôle IgG et PDX1 / NKX6-1 coloration). Centrifuger à 931 g pendant 2 min. </li><li> Remettre en suspension les culots cellulaires dans une solution Perm / Wash 100 pi contenant l&#39; anti-PDX1 et des anticorps anti-NKX6-1 de commande primaire ou de l&#39; isotype (voir tableau des matériaux). Incuber une nuit à 4 ° C. </li><li> Centrifuger la plaque à 931 g pendant 2 min. Retirer le surnageant en retournant la plaque. échantillons Resuspendre dans 100 pi de solution Perm / Wash. </li><li> Centrifuger la plaque à 931 g pendant 2 min. Retirer le surnageant en retournant la plaque. </li><li> Remettre en suspension les échantillons dans 100 ul de Perm / Wash contenant des anticorps secondaires à température ambiante pendant 1 heure, à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Centrifuger la plaque à 931 g pendant 2 min. Retirer le surnageant en retournant la plaque. </li><li> échantillons Resuspendre dans 100 pi de Perm / Wash Solution. </li><li> Centrifuger la plaque à 931 g pendant 2 min. Retirer le surnageant en retournant la plaque. </li><li> Représentantmanger étape 4.2.9 et 4.2.10. </li><li> Resuspendre chaque échantillon et le transfert dans un volume total de 300-500 ul FACS tampon à 1 ml de tubes à essai micro ou 5 ml tubes à fond rond. </li><li> Échantillons sur Exécuter dans le cytomètre de flux 17. Si les échantillons ne peuvent pas être exécutés immédiatement, conserver à 4 ° C à l&#39;abri de la lumière. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Canadian Diabetes Association. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes">http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes</a> (2016).</li>
<li>Cogger, K., Nostro, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+cell+replacement+therapies+for+the+treatment+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes.</a> Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+NKX6-1%2B+pancreatic+progenitors+from+multiple+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).</li>
<li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Functional+Human+Pancreatic+beta+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. , (2014).</li>
<li>Kroon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+endoderm+derived+from+human+embryonic+stem+cells+generates+glucose-responsive+insulin-secreting+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo.</a> Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+into+functional+islets+capable+of+treating+pre-existing+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice.</a> Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).</li>
<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li>
<li>Gouon-Evans, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP-4+is+required+for+hepatic+specification+of+mouse+embryonic+stem+cell-derived+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm.</a> Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).</li>
<li>Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-promoter-factor+1+is+required+for+pancreas+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice.</a> Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).</li>
<li>Pan, F. C., Wright, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+organogenesis%3A+from+bud+to+plexus+to+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland.</a> Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).</li>
<li>Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nkx6+transcription+factors+and+Ptf1a+function+as+antagonistic+lineage+determinants+in+multipotent+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors.</a> Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipotent+progenitor+domain+guides+pancreatic+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis.</a> Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).</li>
<li>Sander, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeobox+gene+Nkx6.1+lies+downstream+of+Nkx2.2+in+the+major+pathway+of+beta-cell+formation+in+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas.</a> Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).</li>
<li>Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+stability+in+stem+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid stability in stem cell cultures.</a> Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).</li>
<li>Korytnikov, R., Nostro, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+polyhormonal+and+multipotent+pancreatic+progenitor+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells.</a> Methods. , 56-64 (2016).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+signaling+through+TGFbeta+family+members+and+WNT+regulates+patterning+and+pancreatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Development. 138 (5), 861-871 (2011).</li>
<li>Schulz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+system+for+production+of+functional+pancreatic+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 7 (5), e37004(2012).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Générer avec succès NKX6-1 + progéniteurs pancréatiques de hPSCs in vitro repose sur l&#39;utilisation de cultures de haute qualité de hPSCs et la différenciation dirigée impliquant la régulation précise des voies de signalisation spécifiques qui régissent les étapes clés du développement au cours du développement du pancréas. Bien que ce protocole peut être utilisé pour induire l&#39; expression robuste de NKX6-1 à travers une variété de lignes comme indiqué précédemment HPSC 3,</s...

La prévalence du diabète augmente et selon l&#39;Association canadienne du diabète, il est estimé que plus de 11 millions de personnes au Canada sont diabétiques ou prédiabétiques, avec 5-10% de ces personnes ayant le diabète de type 1 (DT1) 1. DT1 est une maladie auto-immune qui est provoquée par la destruction des cellules ß produisant de l&#39;insuline qui sont situées dans les îlots de Langerhans. Actuellement, les personnes vivant avec le DT1 nécessitent des sources exogènes de l&#39; insuline 2. Malgré les progrès de la thérapie à l&#39;insuline, les patients DT1 continuent d&#39;avoir un moment difficile la régulation de leurs niveaux de glucose dans le sang et continuent de souffrir à la fois hypo- et hyperglycémie. Une forme prometteuse de traitement pour restaurer normoglycémie dans DT1 est l&#39;utilisation de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh), qui pourraient être utilisés pour générer une offre illimitée de cellules productrices d&#39; insuline ß la fois in vivo et in vitro 3, 4, 5, 6, 7. Différencier CSEh à ß-like cellules pourraient permettre d&#39;étudier le diabète in vitro, permettant l&#39;identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour le diabète de type 2 et de fournir des cellules pour la transplantation chez des patients DT1. La tentative la plus réussie de générer des cellules productrices d&#39;insuline à partir de cellules hES in vitro est de récapituler les événements embryonnaires qui se produisent au cours du développement du pancréas 4, 5. Cela implique la manipulation des voies de signalisation distinctes pour modéliser avec précision les étapes clés du pancréas en développement. Le développement du pancréas commence par l&#39;induction de l&#39;endoderme définitif, qui est caractérisé par l&#39;expression de CXCR4 et CD117 (c-KIT) , 8, 9. Régulation précise de definitive organisation endoderme est nécessaire pour la formation du tube intestinal, qui subit alors antéro-postérieur à patterning et ventrale-dorsale. Dorsale et ventrale du pancréas bourgeons sortent de la zone de l&#39;intestin antérieur , postérieur , qui exprime le gène à homéoboîte pancréatique et duodénal (Pdx1), qui est nécessaire pour le développement du pancréas 10. Le fusible dorsale et ventrale pour former les bourgeons du pancréas, qui est ensuite soumis à un remodelage epithelial et d&#39; expansion 11. Engagement envers le endocrines et exocrines lignée est accompagnée par la production de cellules souches multipotentes (PPM) qui expriment, entre autres, les facteurs de transcription Pdx1, et Nkx6.1 Ptf1a 12, 13. PPMs qui deviendront des cellules endocrines et canalaires continuent d&#39;exprimer Nkx6-1 tout en diminuant l&#39; expression Ptf1a. Contrairement à cela, les cellules de la lignée exocrines vont perdre expression de Nkx6-1 et maintenir l&#39; expression Ptf1a 12. Le facteur de transcription Nkx6-1 a un rôle clé dans le développement du pancréas, en particulier au cours de la différenciation des cellules progénitrices endocrines à ß cellules. Comme décrit précédemment, la suppression des résultats Nkx6-1 dans la formation altération des cellules ß du pancréas 14 au cours du développement. Par conséquent, la génération de cellules bêta productrices d&#39; insuline in vitro et in vivo nécessite l&#39;induction efficace des Nkx6-1. Nous avons récemment développé un protocole pour générer efficacement Pdx1 + / NKX6-1 + progéniteurs pancréatiques de hPSCs. Ces progéniteurs pancréatiques HPSC dérivés génèrent des cellules ß matures sur la transplantation dans des souris immunodéficientes 3. Le protocole de différenciation peut être divisé en 4 étapes caractéristiques: 1) endoderme définitif induction, 2) foregut postérieure patterning, 3) la spécification du pancréas et 4) induction NKX6-1. Ici, nous fournissons une description détaillée de chaque étape de la différenciation dirigée.

<table><tbody><tr><td><Milieux > forts et cytokines</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Thioglycérol (MTG)</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D</td><td>338-AC/CF&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplément</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Buffer</td><td>BD Bioscience</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>BD Perm/Wash buffer, 1x</td><td>BD Bioscience</td><td>554723</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>CHIR990210</td><td>Tocris</td><td>4423a</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle Medium modifié (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>VWR</td><td>80510-412&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphine</td><td>Sigma</td><td>P5499</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Wisent</td><td>88150</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R& D</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine de peau de porc</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>NO636</td><td></td></tr><tr><td>NOGGIN</td><td>R& D</td><td>3344-NG</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Acide rétinoïque</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>SANT-1</td><td>Tocris</td><td>1974</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x), rouge de phénol</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Anticorps pour la cytométrie en flux (dilutions de travail)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD117 PE (1:100)</td><td>Life Technologies</td><td>CD11705</td><td></td></tr><tr><td>CXCR4 APC (1:50)</td><td>BD&nbsp ; Bioscience</td><td>551966</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-souris d’âne (H+L), conjugué Alexa Fluor 647 (1:400)</td><td>Life Technologies</td><td>A-31571</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-chèvre d’âne (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400)&nbsp ;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>705-546-147</td><td></td></tr><tr><td>Souris de contrôle des isotypes IgG&nbsp ;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.&nbsp ;</td><td>015-000-003</td><td></td></tr><tr><td>Contrôle des isotypes IgG de chèvre</td><td>R& D&nbsp ; &nbsp ;</td><td>AB-108-C</td><td></td></tr><tr><td>NKX6-1 (1:2 000)</td><td>DSHB</td><td>F55A10</td><td></td></tr><tr><td>PDX1 (1:100)</td><td>R& D</td><td>AF2419</td><td></td></tr></tbody></table>

différenciation efficace de pluripotentes cellules souches à nkx6-1<sup&gt; +</sup&gt; pancréatiques progéniteurs

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Les cellules souches pluripotentes ont la capacité d&#39;auto renouveler et de se différencier de multiples lignées, elles une source intéressante pour la production de cellules progénitrices pancréatiques qui peuvent être utilisés pour l&#39;étude et le traitement futur du diabète de décision. Cet article décrit un protocole de différenciation à quatre étages conçu pour générer des cellules progénitrices pancréatiques à partir de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh). Ce protocole peut être appliqué à un certain nombre de cellules souches pluripotentes humaines (lignes HPSC). L&#39;approche adoptée pour générer des cellules progénitrices pancréatiques est de différencier les CSEh pour modéliser avec précision les étapes clés du développement du pancréas. Ceci commence par l&#39;induction de l&#39;endoderme définitif, qui est atteint par la mise en culture des cellules en présence d&#39;activine A, le facteur de croissance des fibroblastes basique (bFGF) et CHIR990210. En outre la différenciation et la structuration avec Fibroblast Growth Factor 10 (FGF10) et Dorsomorphin génère des cellules ressemblant à la foregut postérieure. L&#39;ajout de RetinOïque, NOGGIN, SANT-1 et FGF10 différencie les cellules de l&#39;intestin antérieur postérieur dans des cellules caractéristiques de l&#39;endoderme pancréatique. Enfin, la combinaison du facteur de croissance épidermique (EGF), le nicotinamide et NOGGIN conduit à la génération efficace de PDX1 + / + NKX6-1 cellules. La cytométrie en flux est réalisée pour confirmer l&#39;expression de marqueurs spécifiques à des étapes clés du développement du pancréas. Les Pdx1 + / + NKX6-1 progénitrices pancréatiques à l&#39;issue de l&#39; étape 4 sont capables de générer des cellules bêta matures lors de la transplantation chez des souris immunodéficientes et peuvent être en outre différenciés pour générer des cellules productrices d&#39;insuline in vitro. Ainsi, la génération efficace de PDX1 + / NKX6-1 + progéniteurs pancréatiques, comme l&#39;a démontré dans ce protocole, est d&#39; une grande importance car elle fournit une plate - forme pour étudier le développement du pancréas humain in vitro et fournit une source de cellules ayant le potentiel de se différencier en les cellules bêta qui pourraient Eventually être utilisé pour le traitement du diabète.

Génération efficace de progéniteurs du pancréas repose sur la croissance et le maintien des cellules indifférenciées , suivie par l&#39;addition précise des molécules de signalisation spécifiques au cours du protocole de différenciation, comme cela est illustré dans le schéma de la figure 1A. Au jour 0, les cellules non différenciées devrait être de 80 à 95% de confluence et les colonies doivent avoir des bords définis (figure 1A). Au cours de l&#39;étap...

Nous décrivons ici un protocole 4 étapes pour différencier les cellules souches embryonnaires humaines à NKX6-1 + progéniteurs pancréatiques in vitro. Ce protocole peut être appliqué à une variété de lignées de cellules souches pluripotentes humaines.

Différenciation efficace de pluripotentes cellules souches à NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; pancréatiques progéniteurs

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

L'objectif général de cette procédure est de générer efficacement des progéniteurs pancréatiques exprimant NKX6.1 à partir de cellules souches pluripotentes humaines in vitro, en différenciant les cellules à travers quatre stades clés du développement pancréatique. En différenciant les cellules souches pluripotentes humaines à travers quatre stades clés du développement pancréatique, ce protocole fournit un modèle pour étudier le développement du pancréas humain in vitro. Le principal avantage de cette technique par rapport aux protocoles existants est que nous sommes capables de générer de forts pourcentages de cellules progénitrices pancréatiques positives pour NKX6.1 en utilisant diverses lignées de cellules souches pluripotentes humaines.Étant donné que les progéniteurs pancréatiques ont la capacité de générer des cellules semblables à des cellules bêta productrices d'insuline, cette technique nous offrira la possibilité de développer des cellules pour le traitement du diabète, la découverte de médicaments et la modélisation des maladies. Au jour zéro, commencez la différenciation en remplaçant le milieu contenant le substitut sérique KnockOut par le milieu de différenciation du jour zéro. Ensuite, aux jours un et deux, agitez doucement la plaque pour éliminer les cellules mortes de la monocouche avant d'aspirer le milieu.Ensuite, remplacez-le par le milieu de différenciation des jours un à deux. Au jour trois, récoltez les cellules pour la cytométrie en flux. Si les cellules expriment plus de 90 % de CXCR4 et de CD117, l'efficacité a été atteinte.Ensuite, agiter doucement la plaque pour éliminer les cellules mortes de la monocouche avant l'aspiration, puis la remplacer par le milieu de différenciation des jours trois à cinq. Il est important de s'assurer d'une induction efficace de l'endoderme définitif d'ici le jour trois par cytométrie en flux. Si le pourcentage de cellules exprimant à la fois CXCR4 et CD117 est inférieur à 90 %, la différenciation en progéniteurs pancréatiques sera probablement compromise.Les jours six et sept, remplacez le milieu par le milieu de différenciation des jours six à sept. Les jours huit, 10 et 12, remplacez le milieu par le milieu de différenciation des jours huit à 12. Ensuite, le jour 13, récoltez les cellules pour la cytométrie en flux afin de déterminer l'expression de PDX1 et de NKX6.1.Pour récolter les cellules destinées à l'analyse par cytométrie en flux, dissocier les cellules à l'aide d'une solution de trypsine commerciale selon le protocole du fabricant et incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Au bout de trois minutes, éliminer la solution de trypsine et re-suspendre les cellules individuelles dans 1 000 microlitres de tampon fax contenant 30 microlitres de DNA One. Filtrer ensuite les cellules à l’aide d’un tamis en nylon de 35 micromètres et les transférer dans un tube micro-centrifuge.Centrifuger les cellules à 455 fois g pendant cinq minutes avant de préparer les cellules pour une coloration vivante ou fixée. Resuspendre maintenant les cellules dans 1 000 microlitres de tampon fax. Transférer 200 microlitres dans deux puits d'une plaque de 96 puits pour les échantillons non colorés et colorés.Ensuite, centrifuger la plaque à 931 ×g pendant deux minutes, puis éliminer le surnageant en inversant la plaque, colorer les cellules avec l'anticorps conjugué primaire dans un volume final de 100 microlitres pendant 30 minutes à température ambiante et protéger à l'abri de la lumière. Par la suite, centrifuger la plaque à 931 ×g pendant deux minutes, puis après deux minutes, éliminer le surnageant en inversant la plaque. Ensuite, re-suspendre les échantillons dans 100 microlitres de tampon fax.Ensuite, centrifuger la plaque à 931 ×g pendant deux minutes. Retirer le surnageant en inversant la plaque. Puis, re-suspendre les échantillons dans 300 à 500 microlitres de tampon fax, les transférer dans des tubes micro-tests de un millilitre ou des tubes ronds de cinq millilitres et analyser les échantillons en cytométrie en flux.Si les échantillons ne peuvent pas être analysés immédiatement, conservez-les à quatre degrés Celsius et protégez-les de la lumière. Dans cette procédure, re-suspendez le culot cellulaire dans une solution commerciale de fixation et de perméabilisation pendant 24 heures à quatre degrés Celsius. Après 24 heures, centrifugez l'échantillon à 455 ×g pendant cinq minutes, puis re-suspendez-le dans 400 microlitres de solution de perméabilisation commerciale.Ensuite, transférez 200 microlitres de l'échantillon dans deux puits d'une plaque de 96 puits pour le contrôle IGG et la coloration PDX1, NKX6.1, puis centrifugez la plaque à 931 ×g pendant deux minutes. Resuspendez ensuite les culots cellulaires dans 100 microlitres de solution de perméabilisation/lavage commerciale contenant les anticorps primaires anti-PDX1 et anti-NKX61 ou les anticorps de contrôle isotopique. Incubez-les toute la nuit à quatre degrés Celsius.Le lendemain, centrifuger la plaque à 931 ×g pendant deux minutes, éliminer le surnageant en inversant la plaque et re-suspendre les échantillons dans 100 microlitres de solution de perméabilisation et de lavage commerciale. Ensuite, centrifuger la plaque à 931 ×g pendant deux minutes. Éliminer le surnageant en inversant la plaque.Ensuite, reprendre les échantillons dans 100 microlitres de solution de perméabilisation-lavage contenant l'anticorps secondaire pendant une heure à température ambiante, en protégeant de la lumière. Après une heure, centrifuger la plaque à 931 ×g pendant deux minutes, puis éliminer le surnageant en inversant la plaque ; ensuite, reprendre les échantillons dans 100 microlitres de solution de perméabilisation-lavage commerciale, centrifuger la plaque à 931 ×g pendant deux minutes, puis éliminer le surnageant en inversant la plaque. Puis, reprendre l'échantillon dans 100 microlitres de solution de perméabilisation-lavage commerciale et centrifuger à nouveau la plaque à 931 ×g pendant deux minutes avant d'éliminer le surnageant.Ensuite, re-suspendez les échantillons dans 300 à 500 microlitres de tampon fax et transférez-les dans des tubes à essai séparés de un millilitre ou des tubes ronds de cinq millilitres à fond arrondi pour l'analyse en cytométrie en flux. Voici un schéma de l'induction de précurseurs pancréatiques à partir de cellules souches embryonnaires humaines, indiquant le jour de différenciation, le stade de développement, le milieu de base et les cytokines ajoutées à chaque stade. Et voici les images en contraste de phase aux étapes clés de la différenciation pancréatique.Les cellules H1 ont été différenciées selon le protocole de différenciation en quatre étapes illustré. À partir de cellules souches embryonnaires humaines non différenciées au jour zéro, l'endoderme définitif à l'étape un, l'intestin postérieur au stade deux, l'endoderme pancréatique au stade trois et les progéniteurs pancréatiques NKX6.1 positifs à l'étape quatre. Cette figure montre les histogrammes représentatifs de cytométrie en flux du jour trois pour la coloration par les anticorps CXCR4 PE et CD117 APC.Voici l'échantillon non coloré et voici l'échantillon coloré. Cette figure montre les profils représentatifs de cytométrie en flux du jour 13 pour les cellules progénitrices pancréatiques issues du stade quatre exprimant NKX61 et PDX1. Ceci est le témoin IgG et voici l'échantillon coloré.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 13 jours. Toutefois, ce délai peut varier selon la lignée cellulaire utilisée. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de tester tous les agents en raison des variations d'un lot à l'autre.Après avoir suivi la procédure, les cellules progénitrices pancréatiques positives pour NKX6.1 peuvent être différenciées davantage en cellules semblables à des cellules bêta productrices d'insuline, en utilisant d'autres protocoles publiés. Cela fournit une plateforme pour l'étude de la maturation et du développement des cellules bêta in vitro. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de différencier efficacement les cellules souches pluripotentes humaines en progéniteurs pancréatiques en faisant passer les cellules par quatre étapes clés du développement.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Cette vidéo montre la génération de cellules progénitrices neurales à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) non transgéniques et transgéniques. Les hPSC sont différenciées en cellules progénitrices neurales à l’aide d’un milieu de différenciation neuronale. Alors que la différenciation est induite dans les cellules non transgéniques à l’aide de petites molécules, les hPSC transgéniques sont différenciées par l’ajout d’un antibiotique qui induit le promoteur d’un facteur de...

Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines non transgéniques et transgéniques en cellules progénitrices neurales

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Génération efficace du pancréas/duodénum homéotique Protein 1+ postérieure Foregut/pancréatique progéniteurs de hPSCs dans les Cultures de l’adhérence

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Différenciation efficace des neurones sympathiques postganglioniques utilisant des cellules souches pluripotentes humaines dans des conditions de culture sans alimentation et définies chimiquement

L’objectif de cet article est de fournir une approche standardisée pour induire la différenciation des progéniteurs hépatiques humains à partir de cellules souches pluripotentes. Le développement de cette procédure avec des formulations de milieux prêtes à l’emploi offre à l’utilisateur un système facile pour générer des cellules hépatiques humaines pour la recherche biomédicale et la traduction.

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Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en précurseurs de cellules bêta pancréatiques dans un système de culture 2D

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Protocole optimisé pour la génération de cellules pancréatiques fonctionnelles sécrétant de l’insuline à partir de cellules souches pluripotentes humaines

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Différenciation efficace de pluripotentes cellules souches à NKX6-1

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