Name: Intracellulaires Coloration et cytométrie de flux pour identifier lymphocytaires sous-ensembles au sein murin Aorte, Reins et les ganglions lymphatiques dans un modèle de lhypertension (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Découvrez la coloration intracellulaire et la cytométrie de flux pour identifier les sous-ensembles lymphocytaires dans l'aorte, les reins et les ganglions lymphatiques murins dans un modèle d'hypertension induite par l'angiotensine II.

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Ce travail a été soutenu par un prix de l&#39;American Heart Association Fellowship (16POST29950007) FL, une bourse de formation de la National Institutes of Health (NIH T32 HL069765) à BLD, un prix de l&#39;Association Fellowship American Heart (14POST20420025) à MA Saleh, et une NIH K08 prix (HL121671) au MSM. MSM est également soutenu par une subvention de Gilead Sciences, Inc. recherche

Comité des soins et l&#39;utilisation institutionnelle des animaux de l&#39;Université Vanderbilt a approuvé les procédures décrites ici. Les souris sont logés et soignés conformément au Guide pour les soins et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire (National Academies Press. Revised 2010). 1. Isolement de l&#39;Aortic Vidange Adénopathies, Reins et Aorte de souris <ol><li> Euthanasier les souris par inhalation de CO 2. Pulvériser la poitrine avec 70% d&#39;éthanol et ouvrir avec précaution la peau et la paroi thoracique avec des ciseaux pour exposer le cœur. </li><li> Perfuser le système vasculaire, effectuer une petite incision dans l&#39;oreillette droite et à injecter de façon constante au moins 10 ml de PBS froid (environ 1 ml / s) dans la pointe du ventricule gauche à l&#39;aide d&#39;une aiguille G 21 ou 23. Perfuser jusqu&#39;à ce que tous les organes ont blanchies. Le cœur blêmit premier. Blanchir du foie indique que la perfusion a été bien effectué. </li><li> En utilisant de petites pinces et ciseaux fins, couper doucement et retirer les intestins,estomac, la rate, le pancréas et le foie de mieux visualiser l&#39;aorte. REMARQUE: Cette étape doit être fait de façon très précise que les dommages à l&#39;appareil gastro-intestinal peut induire une contamination. </li><li> Découpez et retirez chaque poumon avec des ciseaux. Rincer la cavité thoracique avec du tampon phosphate salin (PBS) en utilisant une seringue sans aiguille. Retirer le sang et l&#39;excès de liquide en utilisant une gaze stérile. </li><li> Retirer les aortiques ganglions lymphatiques drainants abdominale à l&#39;aide de fines pinces à dissection. Assurez-vous de ne pas rompre la capsule. Enlever la graisse restant sur la surface de chaque ganglion lymphatique avec la pince à dissection. Découpez les deux reins avec des ciseaux fins. </li><li> Disséquer l&#39;ensemble de l&#39;aorte (de l&#39;aorte thoracique et abdominale) avec de fines, ciseaux courbes. Commencez au niveau du cœur et soigneusement disséquer loin de l&#39;œsophage et les vertèbres vers le bas au niveau de la bifurcation iliaque en veillant à garder la graisse périvasculaire entourant attaché à l&#39;aorte. REMARQUE: outre la dissection de l&#39;aorte à remocinq structures environnantes peuvent être effectuées sous un microscope. Plus précisément, enlever les branches artérielles (artères carotides, les artères sous-clavière, coeliaque, mésentériques, rénales et artères) et les ganglions lymphatiques. Gardez une couche uniforme de graisse périvasculaire autour de chaque aorte puisque c&#39;est un site où de nombreuses cellules inflammatoires résident dans le cadre de l&#39;hypertension. Placez chaque tissu dans des tubes séparés contenant du PBS froid. </li></ol> 2. Génération de cellule unique Suspensions de chaque tissu <ol><li> Les reins NOTE: Le rein peut être dissocié en une suspension cellulaire unique en combinant dissociation mécanique ainsi que la digestion enzymatique. <ol><li> Préparer la solution de rein de digestion par addition de la collagénase D (2 mg / ml) et de la DNase I (100 pg / ml) à un milieu RPMI 1640 (supplémenté avec du sérum de 5% de fœtus bovin (FBS)). Préparer 10 ml par échantillon de rein. </li><li> L&#39;utilisation de pinces pour transférer les deux reins dans un tube de dissociation contenant 10 ml de rein digérersolution ionique. </li><li> Effectuer la dissociation mécanique à l&#39;aide d&#39;un dispositif semi-automatique dissociateur selon les instructions du fabricant. </li><li> Après dissociation mécanique, détacher le tube de l&#39;appareil et effectuer la digestion enzymatique. Incuber les échantillons pendant 20 min à 37 ° C sous rotation continue. Arrêtez immédiatement la digestion enzymatique en ajoutant froid du milieu RPMI 1640 additionné de 5% de FBS. </li><li> Transférer la solution par pipetage dans un tube conique de 50 ml après filtration à travers un tamis de 40 um. Démêler le tissu restant en dehors en appuyant avec le piston d&#39;une seringue de 1 ml. Pellet les cellules (500 xg, 8 min, 4 ºC). </li><li> Remettre en suspension le culot dans 3 ml de 36% en gradient de densité milieu de centrifugation. Transférer la suspension dans un tube conique de 15 ml. ajouter doucement 3 ml de 72% de milieu à gradient de densité au-dessous de centrifugation de la suspension cellulaire 3 ml de 36% sans aucune interruption. Centrifugeuse (1000 xg sans frein, 20 min, 4 ° C). &lt;/ Li&gt; <li> Les cellules immunitaires sont situés à l&#39;interface. Retirer la couche jaunâtre supérieure contenant les débris cellulaires, puis amener le volume jusqu&#39;à 15 ml en utilisant du PBS froid. Bien agiter à la dégradation du gradient. Faites tourner les cellules (300 xg, 8 min, 4 ° C) et resuspendre le culot dans 3 ml de RPMI avec 5% de FBS. Compter le nombre de cellules vivantes sur un hémocytomètre en utilisant exclusion du bleu Trypan. </li></ol></li><li> l&#39;aorte <ol><li> Préparer la solution de digestion de l&#39;aorte par l&#39;addition de collagénase (1 mg / ml), la collagénase B (1 mg / ml) et de la DNase I (100 pg / ml) à un milieu RPMI 1640 (supplémenté avec 5% de SBF). </li><li> En utilisant une pince fine, transférer l&#39;aorte dans un tube de 2 ml contenant 1 ml de solution aorte de digestion. Émincer l&#39;ensemble aorte en très petits morceaux avec des ciseaux fins dans la solution 1 ml de digestion. Gardez sur la glace. Incuber les échantillons pendant 30 min à 37 ° C sous rotation continue. </li><li> Transférer la solution dans une boîte de culture de tissus et d&#39;arrêter le enzymatic digestion par addition de 5 fois le volume de RPMI froid avec 5% de FBS. </li><li> Transférer la solution par pipetage dans un tube conique de 50 ml après filtration à travers un tamis de 40 um. Démêler le tissu qui se séparent en une seule suspension cellulaire en pressant avec le piston d&#39;une seringue de 1 ml. Rincer la crépine et sédimenter les cellules (300 xg, 8 min, 4 ° C). </li><li> Laver le culot par addition de 10 ml de RPMI avec 5% de FBS. Faites tourner les cellules (300 xg, 8 min, 4 ° C) et resuspendre le culot dans 3 ml de RPMI avec 5% de FBS. Compter le nombre de cellules vivantes sur un hémocytomètre en utilisant exclusion du bleu Trypan. </li></ol></li><li> Les ganglions lymphatiques de drainage de l&#39; aorte <ol><li> Placer un tamis de 40 pm dans une boîte de culture tissulaire (60 mm x 15 mm). Placez les ganglions lymphatiques sur la crépine et les taquiner à part dans une suspension cellulaire unique en appuyant avec le piston d&#39;une seringue de 1 ml. Rincer le filtre avec 2 ml de RPMI avec 5% de FBS. Recueillir les cellules dans le plat. </li><li> Transfertles cellules dans un tube Falcon de 15 ml et le culot des cellules (300 xg, 8 min, 4 ° C). Remettre en suspension le culot dans 500 pl de RPMI avec 5% de FBS. Compter le nombre de cellules vivantes sur un hémocytomètre en utilisant exclusion du bleu Trypan. </li></ol></li></ol> 3. Ex Vivo Stimulation pour Cytokine détection par cytométrie de flux <ol><li> Préparer le milieu de culture cellulaire: RPMI avec 5% de FBS, 0,1 mM d&#39;acides aminés non essentiels, 50 pM de β-mercaptoéthanol et 1% de pénicilline / streptomycine. </li><li> Centrifuger chaque suspension cellulaire obtenue à partir des noeuds du rein, de l&#39;aorte et des ganglions lymphatiques (300 x g, 8 min, 4 ° C). Remettre en suspension chaque culot avec les milieux de culture cellulaire à une concentration de 1 x 10 6 cellules par ml. </li><li> Stimuler les cellules en ajoutant 2 pi du cocktail d&#39;activation des cellules (contenant phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA), le ionomycine ionophore de calcium, et l&#39;inhibiteur de Golgi Brefeldine A) pour chaque 1 ml de la culture cellulaire. NOTE: La concentration finales de chaque composant sont: 81 nM de PMA, 1,33 uM de ionomycine et 5 ug / ml de Brefeldin A. Le traitement par PMA et ionomycine active les cellules à produire des cytokines. Les cytokines sont des protéines sécrétées qui doivent être piégées dans les cellules à détecter. Brefeldine A cause de l&#39;accumulation de protéines normalement sécrétées dans l&#39;appareil de Golgi et le reticulum endoplasmique. Ainsi, la technique décrite ici augmente la capacité de détection des lymphocytes produisant des cytokines par cytométrie de flux. </li><li> Planche 1 à 2 millions de cellules dans un 12 puits (aorte ou des reins) ou 24 puits (ganglionnaire) des plaques à faible adhérence. Placer la plaque dans un 37 ° C humidifié incubateur CO 2 pendant 3 heures. NOTE: Le nombre de cellules ensemencées peut être plus faible dans les ganglions lymphatiques des souris témoins. En outre, le temps de la stimulation doit être déterminée empiriquement pour chaque population de cellules et cytokines étudiées. Dans le cas des lymphocytes T isolés à partir des nœuds aorte, reins ou lymphatiques, nous vous recommandons de stimuler pendant 3 à 4 heures. Une stimulation plus wmalade ne pas augmenter la sécrétion de cytokines et va induire une régulation à la baisse supplémentaire de plusieurs marqueurs de surface des cellules T telles que CD3, CD4 et CD8. (Notez que même une stimulation 3-4 h va induire une certaine régulation négative de ces marqueurs.) </li></ol> 4. Coloration de surface <ol><li> Transférer les cellules dans un tube de polystyrène et FACS centrifuge (300 x g, 8 min, 4 ° C). Laver les cellules deux fois avec du tampon FACS (Ca 2+ et Mg + libre du PBS contenant 4% de FBS et 2 mM d&#39; EDTA) et diviser la suspension cellulaire également dans différents tubes FACS en fonction du nombre de panneaux d&#39;anticorps désirés et le nombre de tubes de contrôle nécessaires ( voir ci-dessous). </li><li> Pour effectuer une compensation pour chaque panneau, préparer des tubes de contrôle non colorées et tubes colorés uniques pour chaque type de tissu et le panneau d&#39;anticorps. En outre, de préparer des tubes de fluorescence moins une (FMO) de commande pour chaque panneau d&#39;anticorps par addition de tous sauf un des anticorps. </li><li> Réglez le volume de chaque tube à 2 ml avec FACSTampon. Centrifuger la suspension de cellules (300 x g, 8 min, 4 ° C), retirer le surnageant et bloquer les récepteurs Fc en incubant les cellules avec 0,5 pg d&#39;anticorps anti-CD16 / CD32 par million de cellules pendant 10 minutes sur de la glace. NOTE: CD16 est faible affinité du récepteur Fc des IgG III (FcR III) et CD32 est FcR II. CD16 / CD32 est exprimé sur les granulocytes, les mastocytes, monocytes / macrophages, les cellules tueuses naturelles, les lymphocytes B, les cellules dendritiques et certaines cellules T matures activées. </li><li> Effectuer la viabilité coloration: Laver les cellules avec PBS 1x, centrifugeuse (300 xg, 8 min, 4 ° C) et remettre en suspension dans 1000 ul de PBS 1x. Ajouter 1 pi d&#39;une amine réactive colorant (viabilité) tache de cellules-impermeant. Incuber pendant 15 min à 4 ° C à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Au cours de l&#39;incubation, préparer le cocktail d&#39;anticorps (pour une coloration de surface) dans un volume approprié de tampon FACS. Laver les cellules deux fois avec 1-2 ml de tampon FACS, la centrifugeuse (300 x g, 8 min, 4 ° C) et remettre en suspension chaque culot avec 100 uldu mélange d&#39;anticorps. Incuber pendant 30 min à 4 ° C à l&#39;abri de la lumière. NOTE: Pour chaque anticorps cytométrie en flux, il est utile de déterminer la quantité optimale d&#39;anticorps nécessaire à l&#39;exécution d&#39;une courbe de titrage de la dose. </li><li> Laver les cellules deux fois avec 2 ml de tampon FACS et sédimenter les cellules (300 xg, 8 min, 4 ° C). </li></ol> 5. Fixation, perméabilisation et intracellulaires Coloration <ol><li> Effectuer la coloration intracellulaire avec un kit de fixation et perméabilisation contenant des tampons appropriés en suivant les instructions du fabricant. Fixer et perméabiliser les cellules en les remettant en suspension dans le tampon approprié. Incuber les échantillons pendant 40 min à 4 ° C à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Ajouter 1 ml de 1x perméabilisation et laver le tampon directement aux cellules fixées et perméabilisées. Centrifugeuse (500 xg, 8 min, 4 ° C) et retirer le surnageant. Reprendre le culot avec 2 ml de 1x tampon de lavage. </li><li> Préparer les mélanges de antibOdies (pour la coloration intracellulaire seulement) dans un volume approprié de 1x tampon de lavage (habituellement de 100 pi par tube). Remarque: Comme cela est décrit ci-dessus, la concentration d&#39;anticorps optimale doit être déterminée pour chaque anticorps dans le panneau. Par exemple, des anticorps anti-IL-17A ou IL-17F, on utilise un facteur de dilution de 1:30, mais pour des anticorps dirigés contre l&#39;IFNy et T-bet, on utilise un facteur de dilution de 1: 100. </li><li> Centrifuger les cellules (500 xg, 8 min, 4 ° C) et remettre en suspension chaque culot avec 100 pi du mélange d&#39;anticorps. Incuber pendant 40 min à 4 ° C à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Laver les cellules deux fois avec 2 ml de tampon de lavage 1 fois et sédimenter les cellules (500 xg, 8 min, 4 ° C). Remettre en suspension le culot avec 300 pi de tampon de lavage 1 fois et analyser sur un cytomètre en flux avec des filtres appropriés. </li><li> Pour la quantification du nombre total de cellules par échantillon de tissu, en utilisant des billes de comptage. Avant l&#39;acquisition, ajouter le volume / nombre recommandé de comptage de perles dans chaque tube. </li></ol> 6. Rémunération, Gating, normalisation, et conseils <ol><li> Compensation et gating <ol><li> tubes de commande Exécuter et non colorées simples tachées de compensation pour régler le chevauchement spectral. NOTE: L&#39;utilisation de billes de compensation plutôt que des contrôles de rémunération à base de cellules est nécessaire dans les cas où l&#39;antigène d&#39;intérêt ou d&#39;une population de cellules dans un échantillon est présent à ces faibles niveaux que la compensation en utilisant des cellules sera difficile. A noter également, lors de l&#39;utilisation de colorants en tandem, il est conseillé de préparer des compensations pour chaque expérience puisque les colorants en tandem varient beaucoup à beaucoup et avec chaque jour. </li><li> Exécutez la fluorescence moins un contrôle (COM) pour tous les fluorophores dans le panneau lors du démarrage d&#39;une nouvelle expérience multicolore. REMARQUE: Les commandes FMO sont des échantillons qui contiennent tous les anticorps dans le panneau, sauf un. Ces contrôles permettent une discrimination précise de positif par rapport à des signaux négatifs pour l&#39;anticorps omis de adjus correctementt les portes. Ces contrôles sont particulièrement importants lorsque les niveaux d&#39;expression sont faibles ou lorsque la séparation de la population cible est faible (par exemple, lorsque la cible est une cytokine ou un facteur de transcription). Bien que pas toujours nécessaire, dans certains cas, les contrôles isotypiques peuvent être préférés à la place de FMO contrôle car ils fournissent une compensation adéquate pour l&#39;isotype d&#39;anticorps et fluorophore conjugué sans la spécificité de l&#39;antigène. </li><li> Mettre en place la porte principale: régler Area Forward Scatter (FSC-A) et région Scatter Side (SSC-A) de tension afin de détecter la population leucocytaire. </li><li> Exclure les cellules mortes. REMARQUE: La coloration de viabilité réagit avec les amines libres présentes sur la surface et l&#39;intérieur des cellules. Contrairement aux cellules vivantes, des cellules mortes (avec des membranes compromises) permettent au colorant de pénétrer dans le cytoplasme, augmentant ainsi la quantité de marquage des protéines. Ainsi, les cellules mortes seront plus lumineux que les cellules vivantes permettant la discrimination facile. Porte sur le livecellules. REMARQUE: La viabilité des suspensions cellulaires à partir de l&#39;aorte et le rein peut être inférieure à la viabilité des suspensions de cellules des ganglions lymphatiques en raison de l&#39;étape de digestion supplémentaire. </li><li> Surface Forward Scatter (FSC-A) [y axe] et Forward Scatter Hauteur (FSC-H) [axe x]. Débardeurs apparaissent comme une diagonale sur ce tracé de points. Porte sur cette diagonale d&#39;exclure doublets. Ensuite, tracer SSC-A [y-axe] et CD45 [axe x]. </li><li> Le CD45 + leucocytaire population peut être facilement identifié. Porte sur cette population. populations suivantes peuvent être identifiés à partir de cette population. </li></ol></li><li> La normalisation de la numération <ol><li> perles de comptage ont des caractéristiques qui donnent lieu à faible SSC FSC et élevé. Par exemple, si 50.000 billes sont ajoutées dans 300 ul de la suspension cellulaire unique, l&#39;équation pour le calcul du nombre absolu de tout type de cellules donné par tube est la suivante: Nombre de cellules ptube er = (50.000 / nombre de billes comptées par le cytomètre de flux) x nombre de cellules comptées. L&#39;utilisation de ce calcul, le nombre absolu de tout type cellulaire donné par tube peut être déterminée. En fonction du nombre de tubes ont été générés à partir de chaque organe, le nombre de cellules par organe peut être calculé. REMARQUE: Conservez toutes les cellules et les réactifs à 4 ° C au cours du protocole. Évitez tourbillonnement vigoureux, car il peut endommager les cellules. Utilisez forces minimales pour sédimenter les cellules. Évitez de faire des bulles dans le tube FACS car il peut précipiter la mort cellulaire. Ne laissez pas les granulés secs à tout moment. </li></ol></li></ol>

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MSM est soutenu par une subvention de Gilead Sciences cardiovasculaires.

Le protocole décrit dans le présent document a été optimisé pour identifier correctement les sous-ensembles de lymphocytes T présents dans les reins, l’aorte et les ganglions lymphatiques murins. Ce protocole peut être facilement adapté pour examiner d’autres sous-ensembles de cellules immunitaires telles que les lymphocytes B et les cellules immunitaires innées et peut être modifié pour inclure d’autres types de tissus. L’étape de digestion est critique et doit être modifiée et optimisée pour chaque tissu9. U...

Des données récentes démontrent que le système immunitaire adaptatif, en particulier les lymphocytes T jouent un rôle crucial dans le développement de plusieurs maladies cardiovasculaires 1,2,3,4,5. Par exemple, dans le modèle de l&#39; angiotensine II , l&#39; hypertension induite par une accumulation de lymphocytes T dans les vaisseaux et les reins de souris a été décrite 6. L&#39;accumulation vasculaire est principalement dans l&#39;adventice et la graisse périvasculaire. Dans le rein, les cellules T accumulent à la fois dans la moelle et le cortex rénal. Selon le type de sous - ensemble est en cause, ces cellules T donnent naissance à différentes cytokines qui peuvent affecter la fonction vasculaire et rénale et conduire au développement de la pathologie (revue par McMaster et al. 6). Lymphocytes T auxiliaires CD4 + peuvent être divisés en plusieurs sous - ensembles: T helper 1 (Th1), Th2, Th9, Th17, TH22, (Treg) T régulatrices, et T helper folliculaire (TFH) des cellules en fonction de leurs fonctions et signature cytokines 7. De même, les cellules T cytotoxiques CD8 + peuvent être classés comme Tc1, Tc2, TC17 ou 8 TC9. Il existe également des cellules T doubles négatives ( par exemple des cellules qui ne manifestent pas les marqueurs CD4 ou des lymphocytes T CD8). Un sous-ensemble de ces cellules possèdent un récepteur alternatif gamma delta T cellulaire (au lieu des récepteurs alpha et bêta classiques) et sont donc appelées cellules T gamma delta. L&#39;analyse multi-paramètres par cytométrie de flux de marqueur de surface, cytokine et facteur de transcription constitue la meilleure approche pour identifier ces cellules. Bien que cette méthode est largement utilisée dans le domaine de l&#39;immunologie, il est moins bien décrite dans les organes solides et dans le cadre des maladies cardiovasculaires. Dans le passé, l&#39;identification des lymphocytes dans les tissus a été limitée à l&#39;immunohistochimie ou des approches de RT-PCR. Bien que immunohistochimie et immunofluorescence des procédés puissants afin de déterminer la distribution tissulaire d&#39;un antigène d&#39;intEREST, ils sont insuffisants pour identifier les sous-ensembles phénotypique impliqués. En outre, alors que l&#39;analyse par RT-PCR permet de détecter l&#39;expression des ARNm des antigènes, des cytokines ou des facteurs de transcription, elle ne permet pas la détection de protéines multiples simultanément au niveau des cellules individuelles. L&#39;avènement de la cytométrie en flux, en particulier lorsqu&#39;elle est combinée avec la coloration intracellulaire pour détecter des cytokines et des facteurs de transcription, donne des chercheurs ayant une puissante technique qui permet l&#39;identification et la quantification au niveau de la cellule unique de sous-ensembles de cellules immunitaires dans des organes solides. Nous avons optimisé un essai de coloration intracellulaire pour identifier par cytométrie de flux les principaux sous-ensembles de cellules T présents dans le rein de souris, l&#39;aorte et l&#39;aorte ganglions lymphatiques drainant dans un modèle de l&#39;angiotensine II, l&#39;hypertension induite. L&#39;optimisation de chaque étape: la digestion du tissu, ex vivo activation, perméabilisation, et la surface et les résultats de coloration intracellulaire dans un très nouveauproductible dosage qui peut être appliqué à d&#39;autres modèles de maladies cardiovasculaires et rénales.

<table><tbody><tr><td>Collagénase D</td><td>ROCHE</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase A</td><td>ROCHE</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase B</td><td>ROCHE</td><td>11088815001</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>ROCHE</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>1x Tampon de lyse des globules rouges</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1614 1x</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>DPBS sans calcium ni magnésium</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5445-02</td><td>Pour la centrifugation à gradient de densité</td></tr><tr><td>GentleMACS&trade ; Tube C</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>Dispositif de dissociation GentleMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>Utiliser le programme SPLEEN_04</td></tr><tr><td>Cocktail d’activation cellulaire (avec Brefeldin A)</td><td>Biolegend</td><td>423303</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD16/32</td><td>eBioscience</td><td>14-0161-81</td><td>diluer 1:100</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit</td><td>Life Technologies</td><td>L34955</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de facteur de transcription BD</td><td>Pharmingen</td><td>562725</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads&nbsp ;</td><td>eBioscience</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>123 unités eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>CD45 AmCyan (clone 30-F11)</td><td>BioLegend</td><td>103138</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2)</td><td>BioLegend</td><td>100218</td><td></td></tr><tr><td>IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1)</td><td>BioLegend</td><td>506910</td><td></td></tr><tr><td>IL-17F APC (clone 9D3.1C8)</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>517004</tr><tr><td>CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5)</td><td>BD Biosciences</td><td>560181</td><td></td></tr><tr><td>CD8 APC (clone 53-67)</td><td>eBioscience</td><td>17-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>T-bet PE-Cy7 (clone 4B10)</td><td>BioLegend</td><td>644823</td><td></td></tr><tr><td>IFN&gamma ; FITC (clone XMG1.2)</td><td>BD Biosciences</td><td>557724</td><td></td></tr></tbody></table>

intracellulaires coloration et cytométrie de flux pour identifier lymphocytaires sous-ensembles au sein murin aorte, reins et les ganglions lymphatiques dans un modèle de l&#39;hypertension

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

Il est maintenant bien connu que les lymphocytes T jouent un rôle essentiel dans le développement de plusieurs maladies cardiovasculaires1,2,3,4,5. Par exemple, des études de notre groupe ont montré que l’hypertension est associée à une accumulation excessive de lymphocytes T dans les vaisseaux et les reins lors du développement de l’hypertension expérimentale6. Une fois dans ces tissus, les lymphocytes T produisent plusieurs cytokines qui affectent à la fois la fonction vasculaire et rénale, entraînant une vasoconstriction et une rétention de sodium et d’eau1,2. Pour bien comprendre comment les lymphocytes T causent les maladies cardiovasculaires et rénales, il est important de pouvoir identifier et quantifier les sous-ensembles spécifiques de lymphocytes T présents dans ces tissus. Les sous-ensembles de lymphocytes T sont définis par une combinaison de marqueurs de surface, de cytokines qu’ils sécrètent et de facteurs de transcription qu’ils expriment. La complexité de la population de lymphocytes T fait de la cytométrie en flux et de la coloration intracellulaire une technique inestimable pour disséquer les phénotypes des lymphocytes présents dans les tissus. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour identifier les marqueurs de surface et intracellulaires (cytokines et facteurs de transcription) dans les cellules T isolées des reins, de l’aorte et des ganglions lymphatiques drainants aortiques murins dans un modèle d’hypertension induite par l’angiotensine II. Les étapes suivantes sont décrites en détail : isolement des tissus, génération des suspensions unicellulaires, stimulation ex vivo, fixation, perméabilisation et coloration. De plus, plusieurs principes fondamentaux des analyses cytométriques en flux, y compris le choix des contrôles appropriés et des stratégies de contrôle appropriées, sont abordés.

Le protocole décrit permet l&#39;identification de marqueurs de surface et intracellulaires dans les cellules T isolées de rein de souris, de l&#39;aorte et de l&#39;aorte ganglions lymphatiques drainant dans un modèle de l&#39;angiotensine II, l&#39;hypertension induite. Les résultats représentatifs sont présentés ci-dessous. La figure 1 illustre la stratégie de portillonnage utilisé pour identifier la popula...

Cet article fournit une méthodologie détaillée pour identifier et quantifier les sous-ensembles de lymphocytes T fonctionnels présents dans les ganglions rénaux murin, l&#39;aorte et lymphatiques par coloration intracellulaire et cytométrie de flux. Le modèle de l&#39;angiotensine II hypertension induite a été choisi pour expliquer, étape par étape, les procédures et les principes fondamentaux de la cytométrie de flux et de coloration intracellulaire.

Intracellulaires Coloration et cytométrie de flux pour identifier lymphocytaires sous-ensembles au sein murin Aorte, Reins et les ganglions lymphatiques dans un modèle de l&#39;hypertension

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

L'objectif général de ce protocole est d'obtenir des suspensions monocellulaires à partir de l'aorte murine, du rein et des ganglions lymphatiques afin de quantifier et de caractériser les cellules immunitaires dans un modèle d'hypertension induite par l'angiotensine II. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies cardiovasculaires, telles que les deux sous-populations de lymphocytes qui favorisent le développement de l'hypertension. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à identifier et à quantifier les sous-populations de cellules immunitaires dans des organes solides au niveau monocellulaire.Avant de commencer la procédure, désinfectez la poitrine de la souris avec de l'éthanol à 70 %. Ensuite, utilisez des ciseaux pour ouvrir soigneusement la peau et la paroi thoracique afin d'exposer le cœur. Pour perfuser le système vasculaire, pratiquez une petite incision dans l'oreillette droite et injectez de manière continue au moins 10 millilitres de PBS froid à un débit d'environ un millilitre par seconde dans l'apex du ventricule gauche.Lorsque tous les organes ont blanchi, utilisez des pinces de dissection fines pour retirer les ganglions lymphatiques drainés par l'aorte abdominale, en prenant soin de ne pas rompre les capsules. Sous un microscope stéréo, retirez les deux reins à l'aide de ciseaux fins. Puis, à l'aide de ciseaux courbes fins, disséquez toute l'aorte thoracique et abdominale en partant du cœur et en terminant à la bifurcation iliaque, en prenant soin de laisser le tissu adipeux périvasculaire environnant attaché à l'aorte.Ensuite, transférez les reins dans un tube de dissociation contenant 10 millilitres de solution de digestion rénale et utilisez un dissociateur semi-automatisé pour dissocier mécaniquement le tissu rénal selon les instructions du fabricant. À la fin de la dissociation, incubez les échantillons à 37 degrés Celsius sous agitation continue. Après 20 minutes, arrêtez immédiatement la digestion enzymatique à l’aide de milieu RPMI 1640 froid supplémenté avec 5 % de FBS et filtrez la suspension tissulaire obtenue à travers un tamis de 40 microns dans un tube conique de 50 millilitres.Utilisez le piston d'une seringue d'un millilitre pour dissocier les tissus restants. Ensuite, faites tomber les cellules en culot par centrifugation. Resuspendez le culot dans trois millilitres de milieu de gradient de densité à 36 % et transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres.Superposez délicatement trois millilitres de milieu de gradient de densité à 72 % sous les cellules, en prenant soin de ne pas perturber les couches, puis séparez les cellules par centrifugation. Les cellules immunitaires se trouveront à l'interface. Éliminez la couche supérieure jaunâtre contenant les débris cellulaires, puis complétez le volume à 15 millilitres à l’aide de PBS froid.Agiter soigneusement pour rompre le gradient, puis laver les cellules par centrifugation. Pour isoler les cellules immunitaires de l'aorte, transférer l'aorte dans un tube de deux millilitres contenant un millilitre de solution de digestion pour aorte fraîchement préparée placée sur de la glace, et utiliser de fines ciseaux pour hacher entièrement l'aorte en petits morceaux. Incuber ensuite les fragments à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes sous agitation continue.À la fin de la digestion, ajouter du RPMI froid supplémenté avec 5 % de FCS à un volume égal à cinq fois celui de la solution de digestion et filtrer la suspension tissulaire obtenue à travers un tamis de 40 microns. Ensuite, recueillir la suspension monocellulaire par centrifugation et resuspendre le culot dans du RPMI frais contenant du FCS. Pour obtenir une suspension monocellulaire à partir des ganglions lymphatiques drainant l'aorte, transférer les ganglions lymphatiques sur un tamis de 40 microns placé dans une boîte de culture tissulaire de 60 sur 15 millimètres et utiliser le piston d'une seringue de un millilitre pour disloquer le tissu.Ensuite, rincez le tamis avec deux millilitres de RPMI supplémenté de FBS et transférez les cellules libérées dans un tube conique de 15 millilitres. Pour stimuler les cellules, ajustez d'abord chaque suspension cellulaire à une concentration de un fois dix puissance six cellules par millilitre dans le milieu de culture cellulaire. Ajoutez ensuite deux microlitres du cocktail d'activation cellulaire à chaque groupe de cellules pour chaque millilitre de milieu.Ensuite, transférez une à deux fois 10 à la puissance 6 cellules aortiques ou rénales par puits dans une plaque de 12 puits, et une à deux fois 10 à la puissance 6 cellules de ganglions lymphatiques par puits dans une plaque de 24 puits. Placez les plaques dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec un taux d'humidité et de dioxyde de carbone contrôlés pendant trois heures. Puis, transférez les cellules dans les tubes FACS en polystyrène correspondants appropriés et faites-les précipiter par centrifugation.Après avoir lavé les cellules deux fois avec du tampon FACS frais dans les mêmes conditions de centrifugation, bloquer les liaisons superficielles non spécifiques à l’aide du blocage FC et laver les cellules dans du PBS. Resuspendre les culots dans un millilitre de PBS frais et colorer les cellules avec un microlitre de colorant vital réactif des amines imperméant aux cellules pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, laver les cellules deux fois supplémentaires dans un à deux millilitres de tampon FACS et resuspendre les culots dans 100 microlitres du cocktail d’anticorps approprié pour la coloration de surface des cellules.Après 30 minutes à quatre degrés Celsius et à l’abri de la lumière, laver les cellules deux fois supplémentaires dans deux millilitres de tampon FACS frais, puis fixer et perméabiliser les cellules à l’aide d’un kit de fixation et de perméabilisation, conformément aux instructions du fabricant. Ensuite, marquer les cellules avec le cocktail d’anticorps intracellulaires d’intérêt et laver à nouveau les cellules dans le tampon FACS. Pour l’analyse cytométrique en flux de la production intracellulaire de cytokines stimulées, analyser d’abord les échantillons non colorés et les témoins monocolorés afin de corriger le recouvrement spectral, suivis des témoins moins un fluorochrome pour chaque fluorochrome du panel.Une fois les paramètres de base de l'analyse de fluorescence définis, utilisez un graphique de dispersion de la surface de diffusion avant par rapport à la dispersion latérale pour définir le premier seuil de sélection en vue de la détection de la population de leucocytes, suivi d'un seuillage permettant d'exclure les cellules mortes en fonction de l'absence d'expression du marqueur de viabilité. Représentez la surface de diffusion avant en fonction de la hauteur de diffusion avant et appliquez un seuil pour exclure les doublets. Les leucocytes peuvent ensuite être identifiés par leur expression de CD45.Pour déterminer la présence de lymphocytes T producteurs d'IL-17A ou d'IL-17F dans le rein murin ou l'aorte, des suspensions monocellulaires peuvent être préparées comme vient d'être démontré pour l'analyse de contrôle par fluorescence moins un de chaque cytokine. Comme prévu, très peu de cellules sont positives pour l'IL-17A ou l'IL-17F dans les contrôles par fluorescence moins un, ce qui permet de distinguer avec précision les signaux positifs des signaux négatifs afin de régler correctement les fenêtres d'analyse pour l'identification des cellules positives pour l'IL-17A ou l'IL-17F dans les échantillons expérimentaux. Une coloration intracellulaire représentative de lymphocytes T isolés du rein et de l'aorte de souris de type sauvage perfusées avec un véhicule ou de l'angiotensine II révèle la présence d'une sous-population de lymphocytes T exprimant l'IL-17A ou l'IL-17F au sein des deux tissus.En outre, la coloration intracellulaire des lymphocytes T provenant des ganglions lymphatiques drainant l'aorte montre que les lymphocytes T CD8 positifs expriment l'interféron gamma et T-bet après une stimulation par l'angiotensine II. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six à neuf heures selon le nombre de tissus traités. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de travailler rapidement et efficacement afin de minimiser la mort cellulaire.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment générer une suspension de cellules individuelles à partir du rein, de l'aorte et des ganglions lymphatiques de la souris, ainsi que comment caractériser et quantifier les sous-populations de cellules immunitaires provenant de ces organes. Cette technique permet aux physiologistes cardiovasculaires et rénaux d'explorer les modifications des populations de cellules immunitaires qui pourraient contribuer à l'hypertension et à d'autres maladies pro-inflammatoires.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cet article présente une cytométrie en flux à base méthode pour étudier la composition immunitaire des aortes. Le document montre aussi une technique supplémentaire qui permet d'examiner l'adventice environnante et paroi de la cuve séparément. Cette méthode ouvre des possibilités d'effectuer des analyses phénotypiques des leucocytes aortique et appliquer plusieurs tests immunologiques pour les études de l'athérosclérose.

Débit analyse par cytométrie de cellules immunitaires dans aortes murin

Nous décrivons des procédures pour quantifier et caractériser les lésions athéroscléreuses dans des modèles murins en utilisant une section de précision du sinus aortique et de l’aorte ascendante combinée à une analyse histochimique et immunohistochimique.

Analyse quantitative et caractérisation des lésions d&#39;athérosclérose dans le murin aortique Sinus

La fonction des cellules vasculaires dépend de l’activité des messagers intracellulaires.  Il s’agit d’une méthode d’imagerie ex vivo à deux photons qui permet de mesurer les niveaux intracellulaires de calcium et d’oxyde nitrique en réponse à des stimuli physiologiques et pharmacologiques dans les cellules endothéliales et musculaires lisses individuelles d’une aorte isolée.

Deux photons imagerie intracellulaire de Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Manipulation et production d&#39;oxyde nitrique endothélial et en cellules de muscle lisse d&#39;un Rat aorte isolée

Les monocytes sont des médiateurs importants d’arteriogenesis dans le contexte de la maladie artérielle périphérique. En utilisant une matrice de type membrane basale et la microscopie intravitale, ce protocole étudie monocyte autoguidage et axés sur la tumeur de l’angiogenèse après injection de monocytes dans le modèle murin de la ligature de l’artère fémorale.

Microscopie intravitale de Monocyte Homing et axés sur la tumeur de l’angiogenèse dans un modèle murin de la maladie artérielle périphérique

Ce manuscrit décrit l’utilisation de souris transgéniques journaliste et itinéraires différents administration des colorants fluorescents en angiotensine II l’hypertension induite par microscopie intravitale vidéo des vaisseaux sanguins pour évaluer l’activation des cellules immunitaires et leur capacité à rouler et à adhérer à l’endothélium.

Visualisation des leucocytes de roulement et l’adhérence à l’angiotensine II infusé souris : Techniques et pièges

Ce protocole vise à identifier les populations de cellules endothéliales lymphatiques dans le foie à l’aide de marqueurs décrits. Nous utilisons la collagénase IV et DNase et un hachage doux de tissu, combiné à la cytométrie en flux, afin d’identifier une population distincte de cellules endothéliales lymphatiques.

Digestion du foie murin pour une cytométrie de cellules endothéliales lymphatiques

Nous vous proposons un protocole normalisé afin de caractériser la composition cellulaire des stades des lésions athéroscléreuses murines y compris des méthodes systématiques de dissection animale, incorporation de tissus, coupes, coloration et analyse des artères brachiocéphalique atheroprone muscle lisse cell lineage traçage souris.

Analyse quantitative de la Composition cellulaire dans les lésions athérosclérotiques avancées de Muscle lisse Cell Lineage-Tracing souris

Ici, nous décrivons un protocole détaillé et reproductible de cytométrie de flux pour identifier les sous-ensembles monocytes/macrophage et t-cell utilisant des essais de coloration extra- et intracellulaire dans la rate murine, la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques et le tissu synovial, utilisant un modèle chirurgical établi de l’arthrose murine.

Analyse de cytométrie de flux des sous-ensembles de cellules immunitaires dans la rate murine, la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques et le tissu synovial dans un modèle d’arthrose

Suite à une infection virale, le rein abrite un nombre relativement important de cellules CD8+ T et offre la possibilité d’étudier les lymphocytes TRM non muqueux. Ici, nous décrivons un protocole pour isoler les lymphocytes rénaux de souris pour l’analyse de cytométrie de flux.

Isolement des cellules CD8+ T résidentes du rein de souris pour l’analyse de cytométrie de flux

Le recrutement des leucocytes et des plaquettes constitue un composant essentiel nécessaire à la croissance efficace des artères collatérales au cours de l’artériogenèse. La microscopie multiphotonique est un outil efficace pour suivre la dynamique cellulaire avec une résolution spatio-temporelle élevée in vivo et moins photo-toxicité pour étudier le recrutement et l’extravasation des leucocytes au cours de l’artériogenèse.

Imagerie intravitale multiphotonique pour la surveillance du recrutement leucocytaire au cours de l’artériogenèse dans un modèle murin de membre postérieur

Ici, nous présentons des protocoles optimisés de nettoyage des tissus pour imager l’aorte murine en trois dimensions (3D). Nous décrivons des procédures de pointe pour l’immunomarquage, la clairance optique et l’imagerie dans le but de définir la proximité anatomique du système nerveux périphérique avec les plaques d’athérosclérose et l’adventice dans l’athérosclérose.

Imagerie tridimensionnelle des tissus de l’aorte dans l’athérosclérose

Découvrez la coloration intracellulaire et la cytométrie de flux pour identifier les sous-ensembles lymphocytaires dans l'aorte, les reins et les ganglions lymphatiques murins dans un modèle d'hypertension induite par l'angiotensine II.

Intracellulaires Coloration et cytométrie de flux pour identifier lymphocytaires sous-ensembles au sein murin Aorte, Reins et les ganglions lymphatiques dans un modèle de lhypertension (Vidéo) | JoVE Journal

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