Intracellulaires Coloration et cytométrie de flux pour identifier lymphocytaires sous-ensembles au sein murin Aorte, Reins et les ganglions lymphatiques dans un modèle de l'hypertension

L’objectif global de ce protocole est d’obtenir des suspensions unicellulaires de l’aorte, du rein et des ganglions lymphatiques murins afin de quantifier et de caractériser les cellules immunitaires dans un modèle d’hypertension induite par l’angiotensine II. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies cardiovasculaires, telles que quels deux sous-ensembles lymphocytaires favorisent le développement de l’hypertension. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’identification et la quantification de sous-ensembles de cellules immunitaires dans les organes solides au niveau de la cellule unique.

Avant de commencer la procédure, désinfectez le coffre de la souris avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, utilisez des ciseaux pour ouvrir soigneusement la peau et la paroi thoracique afin d’exposer le cœur. Pour perfuser le système vasculaire, faites une petite incision dans l’oreillette droite et injectez régulièrement au moins 10 millilitres de PBS froid à un taux d’environ un millilitre par seconde dans l’apex du ventricule gauche.

Lorsque tous les organes ont blanchi, utilisez une pince à dissection fine pour retirer les ganglions lymphatiques drainant l’aorte abdominale, en prenant soin de ne pas rompre les capsules. Sous un microscope à dissection, retirez les deux reins avec des ciseaux fins. Ensuite, à l’aide de ciseaux fins et incurvés, disséquez l’ensemble de l’aorte thoracique et abdominale en commençant par le cœur et en terminant à la bifurcation iliaque, en prenant soin de garder la graisse périvasculaire environnante attachée à l’aorte.

Ensuite, transférez les reins dans un tube de dissociation contenant 10 millilitres de solution de digestion rénale et utilisez un dissociateur semi-automatisé pour désagréger mécaniquement le tissu rénal selon les instructions du fabricant. À la fin de la dissociation, incuber les échantillons à 37 degrés Celsius en rotation continue. Après 20 minutes, arrêtez immédiatement la digestion enzymatique avec le milieu froid RPMI 1640 complété par 5 % FBS et filtrez la boue tissulaire résultante à travers une passoire de 40 microns dans un tube conique de 50 millilitres.

Utilisez le piston d’une seringue d’un millilitre pour séparer le tissu restant. Ensuite, granulez les cellules par centrifugation. Remettez le granulé en suspension dans trois millilitres de milieu à gradient de densité de 36 % et transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres.

Superposez doucement trois millilitres de milieu à gradient de densité de 72 % sous les cellules, en prenant soin de ne pas perturber les couches, et séparez les cellules par centrifugation. Les cellules immunitaires seront situées à l’interface. Retirez la couche jaunâtre supérieure contenant les débris cellulaires, puis augmentez le volume à 15 millilitres en utilisant du PBS froid.

Bien agiter pour décomposer le gradient puis laver les cellules par centrifugation. Pour isoler les cellules immunitaires de l’aorte, transférez l’aorte dans un tube de deux millilitres contenant un millilitre de solution de digestion de l’aorte fraîchement préparée sur de la glace et utilisez des ciseaux fins pour hacher toute l’aorte en petits morceaux. Ensuite, incubez les fragments à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes de rotation continue.

À la fin de la digestion, ajoutez du RPMI froid complété par 5 % de FBS à cinq fois le volume de la solution de digestion et filtrez la boue tissulaire résultante à travers une passoire de 40 microns. Ensuite, récupérez la suspension unicellulaire par centrifugation et remettez en suspension le granulé dans du RPMI frais avec FBS. Pour générer une suspension unicellulaire à partir des ganglions lymphatiques drainant l’aorte, transférez les ganglions lymphatiques sur une passoire de 40 microns dans une boîte de culture tissulaire de 60 x 15 millimètres et utilisez un piston de seringue d’un millilitre pour désagréger le tissu.

Ensuite, rincez la passoire avec deux millilitres de RPMI plus FBS et transférez les cellules libérées dans un tube conique de 15 millilitres. Pour stimuler les cellules, ajustez d’abord chaque suspension cellulaire à une concentration d’une fois 10 à six cellules par millilitre dans un milieu de culture cellulaire. Ajoutez ensuite deux microlitres du cocktail d’activation cellulaire à chaque groupe de cellules pour chaque millilitre de milieu.

Ensuite, transférez une à deux fois 10 à la sixième cellule aortique ou rénale par puits dans une plaque à 12 puits et une à deux fois 10 à la sixième cellule ganglionnaire par puits dans une plaque à 24 puits. Placez les plaques dans un incubateur de dioxyde de carbone humidifié à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Transférez ensuite les cellules dans les tubes FACS en polystyrène correspondants et granulez les cellules par centrifugation.

Après avoir lavé les cellules deux fois avec un tampon FACS frais dans les mêmes conditions de centrifugation, bloquez la liaison de surface et la liaison de surface non spécifique avec un bloc FC et lavez les cellules dans du PBS. Remettez les granulés en suspension dans un millilitre de PBS frais et colorez les cellules avec un microlitre d’une coloration de viabilité réactive aux amines imprégnées d’alvéoles pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, lavez les cellules deux fois de plus dans un à deux millilitres de tampon FACS et remettez les granules en suspension dans 100 microlitres du cocktail d’anticorps de coloration de la surface cellulaire approprié.

Après 30 minutes à quatre degrés Celsius et à l’abri de la lumière, lavez les cellules deux fois de plus dans deux millilitres de tampon FACS frais, puis fixez et perméabilisez les cellules avec un kit de fixation et de perméabilisation selon les instructions du fabricant. Ensuite, marquez les cellules avec le cocktail d’anticorps intracellulaires d’intérêt et lavez à nouveau les cellules dans le tampon FACS. Pour l’analyse cytométrique en flux de la production de cytokines intracellulaires stimulée, exécutez d’abord les tubes de contrôle non colorés et monocolorés pour ajuster le chevauchement spectral, puis les contrôles de fluorescence moins un pour chaque fluorophore du panneau.

Lorsque les paramètres de base de l’analyse de fluorescence ont été définis, utilisez un graphique de zone de diffusion côte à côte pour définir la porte primaire pour la détection de la population de leucocytes, suivie d’un gate pour exclure les cellules mortes en fonction de leur manque d’expression de la coloration de viabilité. Tracez la zone de diffusion vers l’avant en fonction de la hauteur de diffusion vers l’avant et de la porte pour exclure les doublets. Les leucocytes peuvent alors être identifiés par leur expression de CD45.

Pour déterminer la présence de lymphocytes T producteurs d’IL-17A ou d’IL-17F avec le rein ou l’aorte murin, des suspensions unicellulaires peuvent être préparées, comme cela vient d’être démontré, pour l’analyse de contrôle de fluorescence moins un de chaque cytokine. Comme prévu, très peu de cellules sont positives pour l’IL-17A ou l’IL-17F dans les témoins de fluorescence moins un, ce qui permet de discriminer avec précision les signaux positifs par rapport aux signaux négatifs pour ajuster correctement les portes pour l’identification des cellules positives à l’IL-17A ou à l’IL-17F dans les échantillons expérimentaux. La coloration intracellulaire représentative des lymphocytes T isolés du rein et de l’aorte de souris de type sauvage perfusées avec le véhicule ou l’angiotensine II révèle la présence d’un sous-ensemble de lymphocytes T exprimant l’IL-17A ou l’IL-17F dans les deux tissus.

De plus, la coloration intracellulaire des lymphocytes T des ganglions lymphatiques drainant l’aorte démontre que les lymphocytes T CD8 positifs expriment l’interféron gamma et le T-bet après stimulation de l’angiotensine II. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six à neuf heures selon le nombre de tissus traités. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de travailler rapidement et efficacement pour minimiser la mort cellulaire.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer une suspension unicellulaire à partir du rein, de l’aorte et des ganglions lymphatiques murins, ainsi que de caractériser et de quantifier les sous-ensembles de cellules immunitaires de ces organes. Cette technique permet aux physiologies cardiovasculaires et rénales d’explorer les changements dans les populations de cellules immunitaires qui peuvent contribuer à l’hypertension et à d’autres maladies pro-inflammatoires.