Genome Montage et différenciation dirigée des hPSCs pour Interrogation Déterminants Lineage dans le développement du pancréas humain

Ce protocole montre comment établir la plateforme iCRISPR pour l’édition rapide du génome dans les hPSC, et comment incorporer des lignées modifiées du génome avec une différenciation pancréatique dirigée vers les hPSC pour étudier le développement et la maladie du pancréas humain. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement pancréatique humain, telles que le contrôle génétique du développement pancréatique normal et la base moléculaire du diabète. Le principal avantage de ces techniques est qu’elles nous permettent de modifier efficacement les gènes d’intérêt dans les hPSC et d’utiliser ces lignées cellulaires modifiées pour des études du développement et de la maladie du pancréas humain in vitro.

Cultivez des hPSC dans des conditions chimiquement définies et sans mangeoire sur des boîtes humaines tronquées enrobées de vitronectine. La veille de l’électroporation, ajoutez 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK lors du changement de média. Le jour de l’électroporation, préparez à l’avance des plats de 10 centimètres enrobés de vitronectine.

Ensuite, retirez le milieu de culture des cellules, lavez une fois avec du PBS sans calcium ni magnésium, puis traitez les cellules avec un réactif de dissociation 1X à 37 degrés Celsius pendant environ trois minutes. Ensuite, aspirez le réactif de dissociation avant que les cellules ne se détachent et ajoutez 10,5 millilitres de milieu complet. Utilisez un pipetage doux pour former une suspension unicellulaire avant de transférer dans des tubes à centrifuger.

Effectuez un comptage cellulaire sur 500 microlitres de suspension cellulaire à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Ensuite, granulez les hPSC à 200 fois G pendant cinq minutes. Remettre les cellules en suspension dans du PBS froid à raison de 12,5 fois 10 à la sixième cellules par millilitre, et aliquote dans des volumes de 800 microlitres.

Ajoutez les plasmides dans chaque suspension hPSC de 800 microlitres et mélangez bien. Transférez le mélange dans une cuvette d’électroporation de 0,4 centimètre et conservez-le sur de la glace pendant environ cinq minutes. Électroporez les cellules à l’aide d’un système d’électroporation à 250 volts et 500 microfarads.

Il est essentiel d’utiliser des hPSC saines et proliférantes pour l’édition du génome. Après l’électroporation, transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres avec cinq millilitres de milieu complet préchauffé, puis granulez les cellules. Remettez les cellules en suspension dans 10 millilitres de milieu complet avec 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK, et plaquez une fois 10 à la sixième, 2,5 fois 10 à la sixième, et cinq fois 10 à la sixième cellules de chaque électroporation sur des boîtes recouvertes de vitronectine, de sorte qu’au moins une des plaques ait suffisamment de colonies unicellulaires pour le prélèvement.

Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius. Le deuxième jour, commencez la sélection de la néomycine en ajoutant un milieu contenant 500 microgrammes par millilitre de sulfate G418. Le sixième jour, commencez la sélection de la puromycine en ajoutant un milieu contenant un microgramme par millilitre de dichlorhydrate de puromycine.

Aux jours 10 à 12, les colonies unicellulaires hPSC atteindront un à deux millimètres de diamètre. À ce stade, choisissez 12 à 24 colonies au microscope stéréoscopique. Désagréger mécaniquement les colonies de hPSC en petits morceaux à l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres et transférer les cellules directement dans des plaques à 24 puits recouvertes de vitronectine.

24 heures avant la transfection de l’ARN guide, traitez les hPSC iCas9 avec deux microgrammes par millilitre de doxycycline. Le jour de la transfection, préparez des plaques à 24 puits recouvertes de vitronectine et dissociez les cellules iCas9 en cellules uniques à l’aide du réactif de dissociation 1X comme précédemment. Ensuite, granulez les cellules à 200 fois G pendant cinq minutes et remettez les cellules en suspension à 0,5 fois 10 à la sixième cellules par millilitre dans un milieu complet complété par deux microgrammes par millilitre de doxycycline et un inhibiteur de ROCK de 10 micromolaires.

Plaquez 500 microlitres des cellules remises en suspension dans les puits individuels de la plaque à 24 puits. Pour chaque ARN guide, faites les mélanges de transfection suivants. Mélanger A, 50 microlitres de milieu sérique réduit plus un microlitre d’ARN guide.

Mélanger B, 50 microlitres de milieu sérique réduit plus trois microlitres de réactif de transfection. Combinez les mélanges A et B pour obtenir un mélange de 100 microlitres et incubez pendant cinq minutes à température ambiante. Ajoutez 50 microlitres du mélange dans les cellules dans les puits dupliqués de la plaque à 24 puits et mélangez bien.

Après quatre jours, extrayez l’ADN génomique, la PCR amplifiez les régions cibles flanquant les séquences de ciblage de l’ARN guide et estimez l’efficacité de l’édition à l’aide de la digestion T7E1. Commencer la différenciation des lignées hPSC lorsque les cellules ont atteint 80 % de confluence deux jours après l’ensemencement. Ajoutez le support de différenciation du jour zéro, puis changez le support quotidiennement à l’aide des formules présentées ici.

Le 10e jour, examinez les marqueurs PP2 du progéniteur pancréatique ultérieur, PDX1 et NKX6.1 par coloration immunofluorescente d’un sous-ensemble des cellules. Passez ensuite à la culture d’interface air-liquide en traitant d’abord les cellules PP2 avec un inhibiteur de ROCK à 10 micromolaires pendant quatre heures. Une fois le temps d’incubation écoulé, dissociez les cellules comme précédemment.

Réduire au minimum la durée du traitement par réactif de dissociation afin de maximiser la survie cellulaire pour l’ensemencement à l’étape de différenciation de l’interface air-liquide. Aspirez le réactif de dissociation avant que les cellules ne se soient détachées. Ajoutez ensuite 10 millilitres de milieu boo-lah dans la plaque et dispersez les cellules PP2 en cellules uniques en pipetant doucement de haut en bas.

Récupérez la suspension à cellule unique. Comptez le numéro de cellule et granulez les cellules. Après avoir remis en suspension la pastille cellulaire dans un milieu de différenciation S5, repérez cinq à 10 microlitres de cellules par point sur un filtre à insert transwell.

Ajouter du milieu S5 au fond de chaque insert transwell et incuber avec des changements de milieu jusqu’à ce que les marqueurs endocriniens pancréatiques soient détectables par coloration immunofluorescente. Cette figure montre la jonction d’extrémité non homologue médiée par iCRISPR dans les hPSC. L’inactivation génique est très efficace, car aucun processus de sélection n’est impliqué, et des mutants bialléliques de 20 à 50 % peuvent être facilement obtenus.

Pour des altérations génétiques efficaces et précises, les ARN guides sont cotransfectés avec un donneur d’ADN simple brin porteur de l’altération de séquence spécifique, représentée en rouge. Souvent, pour éviter une nouvelle coupe dans les allèles modifiés, il est recommandé d’inclure une mutation silencieuse dans la séquence PAM, représentée ici en vert. Avec ce système, environ 10 % des clones portant la modification du génome souhaitée par réparation dirigée par homologie, sans altérations supplémentaires dans les deux allèles, peuvent être obtenus.

Une fois maîtrisée, il faut moins de deux mois pour établir une nouvelle ligne hPSC iCas9. Après cela, une variété de lignées de colonies mutantes hPSC peut être générée en un à deux mois. Après la génération de lignées mutantes génétiques hPSC, la différenciation in vitro par étapes des lignées cellulaires mutantes en cellules pancréatiques de type bêta nous permet d’étudier les étapes spécifiques du développement affectées par ces mutations, ce qui permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents de la maladie.