Name: Genome Montage et différenciation dirigée des hPSCs pour Interrogation Déterminants Lineage dans le développement du pancréas humain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Apprenez le montage génomique iCRISPR et la différenciation dirigée des hPSCs pour étudier les déterminants de lignée dans le développement pancréatique humain. Cette méthode permet d'explorer les mécanismes génétiques du diabète.

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Ce travail a été financé en partie par le NIH / NIDDK (R01DK096239) et de l&#39;État de New York Stem Cell Science (NYSTEM C029156). ZZ a été soutenue par la bourse de recherche postdoctorale NYSTEM du Centre pour la biologie des cellules souches de l&#39;Institut Sloan Kettering.

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Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Temps Considérations pour Génération Mutant Lines Bien que les approches récentes basées sur les systèmes CRISPR / Cas pour l&#39;édition du génome ont conduit à un ciblage réussi, une plate-forme plus efficace et universel serait préférable à plus grande échelle des analyses de la fonction des gènes. La plate - forme iCRISPR offre une méthode rapide et efficace pour introduire des mutations à un gène d&#39;intérêt 5, 9. Tout d&#39;abord, le procédé de synthèse gARN basée sur la PCR permet la production de centaines de ARNg en format revêtit d&#39;une journée, sans les étapes de clonage chronophages. Deuxièmement, avec la doxycycline inductible cas9 expression dans iCas9 hPSCs, l&#39;étape impliquant gARN transfection nécessite seulement une quantité minimale de travail, et donc, de multiples expériences gARN ciblant peut être réalisée en même temps. Troisièmement, en raison de la haute efficacité de ciblage réalisables avec notre système, l&#39;analyse de ~ 24 - 48 colonies par gARN transfectées doivent être suffcace pour établir monoallélique multiples et lignées mutantes bialléliques pour un seul gène, bien que l&#39;efficacité varient en fonction du locus cible. Comme il est possible pour une personne formée pour ramasser mécaniquement 384 colonies (plaques 4 x 96 puits) en une seule séance, qui devrait prendre ~ 4 h sous un microscope de dissection, une personne formée peut être prévu pour générer des lignées mutantes affectant 12 gènes à l&#39;intérieur 12 mois. La génération simplifiée de mutants HPSC dans un court laps de temps permet l&#39;analyse systématique d&#39;un ensemble de facteurs de transcription et / ou signalisation composants de la voie qui interagissent les uns avec les autres, la régulation du processus de développement 9. En outre, efficace ciblage génique multiplexé ouvre également la porte à étudier les interactions génétiques des traits humains complexes sous-jacents. Génération des modifications génétiques précises La dérivation des CSPi spécifiques au patient de facilement accessible type de cellules somatiques<html> s et la différenciation en types de cellules pathologiques pertinents fournissent une excellente occasion pour la validation fonctionnelle des mutations associées à la maladie. Cependant, en raison de la grande variabilité dans le patrimoine génétique entre les individus, des comparaisons directes entre iPSCs provenant de patients et de donneurs sains ne permettent pas de distinguer les phénotypes de la maladie d&#39;effets de fond. Par conséquent, il est nécessaire de générer CSPi de contrôle isogéniques en corrigeant la mutation de la maladie de retour à la séquence de type sauvage ou d&#39;introduire des mutations spécifiques au patient dans un type sauvage HPSC fond, tel que proposé par d&#39; autres 25, 26. En plus de (null) mutations de perte de fonction, on peut maintenant disséquer plus précisément les mécanismes de la maladie par l&#39;introduction d&#39;une modification de séquences spécifiques au patient dans le locus endogène dans hPSCs, y compris des patients hypermorphic, hypomorphic, neomorphic ou dominant négatif des mutations. ntent &quot;&gt; modification génétique précise emploie HDR pour DSB réparation en présence d&#39;un modèle de réparation. Comme il est beaucoup moins efficace que NHEJ médiée réparation de l&#39;ADN, un plasmide donneur contenant la mutation spécifique au patient, une cassette de sélection des médicaments, et les bras d&#39;homologie a déjà été utilisée comme modèle de réparation 2. Après la sélection des médicaments et la vérification de la mutation spécifique au patient, une deuxième étape est généralement nécessaire pour retirer la cassette de sélection de médicaments. Alors que les systèmes Cre-loxP et FLP-FRT les plus largement utilisés laissent derrière séquence résiduelle dans le locus endogène, l&#39;utilisation de piggyBac transposon a permis le retrait continu de la cassette de sélection de médicaments 27. Plus récemment, des courts modèles de ADNsb ont également été montré pour soutenir HDR efficace avec des endonucléases d&#39;ADN par génie 28. en comparaison avec un plasmide donneur , ADNsb peut être directement synthétisé et évite ainsi l&#39;étape de clonage de temps. ici, il doit êtrefr montré que, par cotransfection gARN et un modèle ADNsb pour induire la réparation d&#39;homologie dirigée, iCRISPR peut être utilisé pour introduire des modifications de nucléotides spécifiques avec une grande efficacité. Ceci est important non seulement pour disséquer le rôle des nucleotides essentiels au sein des domaines fonctionnels de protéines, mais aussi pour modéliser les mutations pathologiques chez l&#39;homme et éventuellement de corriger ces mutations associées à la maladie pour l&#39;intervention thérapeutique. En raison du grand nombre de loci de susceptibilité qui sont associés chacun à des variantes de séquences multiples, modélisation des maladies complexes et multigéniques telles que le diabète a été un défi pour les généticiens. Comme la plate-forme iCRISPR est permissive pour la génération rapide d&#39;une série allélique ou pour le ciblage génique canalisable, il peut faciliter l&#39;enquête de loci associés à la maladie multiple, soit individuellement, soit en combinaison avec des milieux isogéniques. Cibler l&#39;efficacité et les effets hors-cible Nous avons<html> trouvé une bonne corrélation entre le T7E1 et les résultats d&#39;analyse de RFLP et le nombre de lignées de mutants identifiés par séquençage. Cela souligne l&#39;importance d&#39;effectuer ces essais en parallèle avec la mise en place de lignes clonales. Alors que l&#39;efficacité de ciblage obtenus peuvent varier en fonction du locus génomique, dans la plupart des expériences de ciblage de gènes individuels, 20-60% des clones ont été trouvés avec les deux allèles mutés (y compris en phase et des mutations du cadre de lecture) 9. Dans les cas où le ciblage génique multiplexé a été réalisée, triples clones mutants bialléliques avec 5-10% des rendements ont été obtenus 5. ADNss médiée HDR de plusieurs gènes ont également été réalisée pour obtenir des altérations génétiques précises, avec l&#39;efficacité de l&#39; obtention d&#39; homozygote knock-in clones allant de 1 à 10% 5. Travailler avec CRISPR / Cas dans hPSCs, des mutations dans les sites potentiels hors-cible qui ne partagent pas la même séquence cible gARN sont encore à détecterlass = &quot;xref&quot;&gt; 5, 9, 12. Le séquençage du génome entier effectué dans une étude récente a également réussi à identifier d&#39; importantes mutations hors-cible dans les lignes HPSC clonales généré en utilisant CRISPR / Cas 29. Néanmoins, afin de minimiser tout effet potentiel de confondre phénotypes introduites par des mutations au niveau des sites d&#39;effets hors-cible, il est suggéré de générer des lignées mutantes indépendants en utilisant au moins deux ARNg indépendantes ciblant différentes séquences dans le même gène. phénotypes similaires observés dans plusieurs lignes générées en utilisant différentes ARNg pourrait principalement exclure la possibilité que le phénotype provient d&#39;un effet hors cible. Feeder dépendante par rapport à la culture indépendante et ciblage Les méthodes traditionnelles de culture HPSC impliquent leur entretien et à l&#39;expansion sur les cellules nourricières dans des milieux contenant du sérum ou le remplacement de sérum qui comprend prod animalduits, tels que l&#39;albumine de sérum bovin. Des cellules nourricières, le sérum, le remplacement de sérum, et l&#39;albumine, contiennent tous les composants indéfinis complexes et montrent une variabilité considérable du lot. L&#39;adaptation à l&#39;état libre-alimentation et défini chimiquement réduit de manière significative les efforts pour l&#39;entretien HPSC et, plus important encore, augmente la cohérence des expériences de différenciation. À l&#39; heure actuelle, il existe très peu d&#39; études qui décrivent les procédures d&#39;édition du génome sur hPSCs cultivées dans des conditions de culture entièrement définies 30. Nous avons trouvé CRISPR plus élevé ciblant l&#39;efficacité lorsque gARN transfection et le dépôt clonale ont été effectuées dans des conditions sans nourricières par rapport aux conditions de culture nourricières-dépendante. Nous pensons que cela est dû à une augmentation de la survie des cellules après la transfection et l&#39;ensemencement à cellule unique pour la formation de colonies. En outre, les cellules nourricières ont été précédemment montré pour séquestrer des réactifs de transfection, ce qui réduit l&#39;efficacité de la transfection. CombinantGenome Montage avec différenciation dirigée Les protocoles de différenciation précédentes ont produit seulement une petite fraction de cellules positives à l&#39;insuline, dont la plupart étaient polyhormonal et ressemblait à des cellules endocrines 23 fœtales. Des progrès récents ont permis la différenciation des hPSCs dans des cellules plus matures de glucose sensible bêta comme 16, 17, 19, 20. Nous pouvons régulièrement obtenir au moins 75% de cellules endodermiques définitives, 40% Pdx1 + Nkx6.1 + progéniteurs pancréatiques, et environ 20% Nkx6.1 + CPEP + cellules bêta-like glucose-sensible en utilisant HUES8 hPSCs 9. Lorsqu&#39;il est combiné avec le système de montage du génome iCRISPR, ce protocole de différenciation plus robuste a facilité l&#39;analyse des facteurs de transcription qui sont cruciales pour les progéniteurs et endocriniens stades pancréatiques de différenciation pancréatique. Cela rendrail possible, dans les études futures, d&#39;examiner un grand nombre de gènes de la maladie de candidat pour la validation fonctionnelle et enquête sur les mécanismes qui sous - tendent le diabète 9. Applications ou orientations futures Notre système de iCRISPR peut faciliter la génération de modifications génomiques plus complexes, telles que la création d&#39;allèles rapporteurs par ciblage génique à l&#39; aide à long donateurs modèles d&#39;ADN codant pour des étiquettes de protéines ou reporters fluorescents 12 HDR-médiée. Nous avons montré que, en raison de la forte CRISPR ciblant l&#39; efficacité atteint dans le système, ce processus peut être effectuée dans hPSCs, sans la nécessité d&#39; une autre sélection de médicaments 12. En outre, le gène multiplexé ciblage peut être utilisé pour étudier les interactions génétiques des maladies humaines complexes sous - jacente, comme le montre notre étude récente, que nous croyons est le premier exemple d&#39; un tel travail 31. iCRISPR peut également être utilisée pour comprendre le contrôle réglementaire du gène en créant des suppressions soit en ARN non codantes ou dans le gène des régions régulatrices, comme des promoteurs et des amplificateurs. Pour générer efficacement des mutants de régulation à l&#39;aide iCRISPR, ARNg peuvent être conçus pour perturber le site de liaison d&#39;une protéine de liaison à l&#39;ADN, y compris mais sans s&#39;y limiter, la machinerie de transcription basale ou un facteur de transcription spécifique d&#39;un tissu. ADNsb HDR modèle à médiation peut également être utilisée pour muter des sites de liaison aux protéines spécifiques. Enfin, on envisage que la poursuite de l&#39; optimisation permettrait l&#39;utilisation de la plate - forme dans iCRISPR hPSCs pour des analyses génétiques débit plus élevé de phénotypes de pluripotence ou phénotypes de la maladie lorsqu&#39;ils sont combinés avec un protocole in vitro de différenciation. Ces études de iCRISPR médiée peuvent permettre l&#39;identification plus rapide des gènes et des études de leur pertinence fonctionnelle associées à la maladie candidats.

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) ont la capacité à la fois l&#39;auto-renouvellement et donner lieu à tous les dérivés des trois lignées germinales embryonnaires. Ils fournissent une ressource précieuse pour la thérapie de remplacement cellulaire et la modélisation de la maladie en servant de plate-forme unique pour récapituler les processus cellulaires dans un contexte de développement humain. Ils sont également une source de cellules expérimentales pour des analyses évolutives, à haut débit. Cependant, les progrès ont été limités en raison de deux principaux défis: le manque d&#39;outils de modification génétique efficaces et la difficulté à récapitulant les étapes du développement embryonnaire complexes dans une boîte de culture. La modification génétique est un outil indispensable pour étudier la fonction des gènes dans le développement normal et la maladie. Cependant, alors que le gène classique des approches de ciblage par recombinaison homologue se sont révélés être un outil puissant pour disséquer la fonction des gènes chez la souris cellules souches embryonnaires (mESCs) 1, cette approchea été extrêmement inefficace lorsqu&#39;il est appliqué à hPSCs 2, 3. La récente adhésion rapide des programmables, des nucléases spécifiques au site de la nature à l&#39;utilisation en laboratoire, y compris les nucléases à doigts de zinc (de ZFN), transcription nucléases effectrices activatrices-like (Talens), et les répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées en cluster (CRISPR) associée CRISPR-/ (Cas) les systèmes 4, signifie que l&#39; ingénierie des génomes est devenu une tâche beaucoup plus facile dans un large éventail d&#39;organismes et de lignées cellulaires, y compris dans hPSCs. Ces outils d&#39;édition de gènes profitent du fait que les nucléases chimères telles que l&#39;endonucléase cas9 peuvent permettre toute une série de modifications génétiques en induisant des cassures double brin (CDB) à des endroits précis, ce qui déclenche le mécanisme de réparation d&#39;ADN endogène pour activer soit non homologue fin de jonction (NHEJ) ou la réparation d&#39;homologie dirigée (HDR). Les deux mécanismes peuvent être exploités pour la manipulation génétique en induisant either insertion aléatoire et des mutations de deletion (les indels, par l&#39; intermédiaire NHEJ), pour créer des mutations de changement qui invalident allèles du gène, ou des substitutions de nucleotides précises (par RDH), pour récapituler les mutations du patient pour la modélisation des maladies humaines ou à corriger une mutation responsable de la maladie pour la thérapie génique . CRISPR / Cas à médiation par l&#39;ingénierie du génome nécessite deux composants: le cas9 endonucléases d&#39;ARN guidée constante nécessaire pour le clivage de l&#39;ADN et un ARN CRISPR variable (crRNA) et (tracrRNA) duplex trans-activation qui indique la reconnaissance de la cible d&#39;ADN. Le duplex crRNA / tracrRNA peut être remplacé par un seul ARN guide chimérique (gARN), qui ont été trouvés pour travailler plus efficacement 5, 6, 7. Bien que le système / cas9 CRISPR a été adapté pour les organismes les plus expérimentaux et des lignées cellulaires, la livraison et l&#39;expression de cas9 et gARN varie de façon significative et doit encore être optimisé pour Achíveille édition du génome efficace dans de nombreux systèmes, y compris hPSCs 8. Une plate - forme de génome-édition efficace, iCRISPR, a été créé en hPSCs 5. Dans ce système, une approche TALEN à médiation a été utilisé pour cibler les deux alleles du «transgène locus refuge&quot; AAVS1 en trans, un allèle avec un transactivateur inverse à la tetracycline contrôlée (M2rtTA) et l&#39;autre avec un élément de réponse à la tetracycline (TRE ) entraînant l&#39;expression de cas9 (iCas9) dans les hPSCs. Dans des lignées clonales établies (iCas9 hPSCs), cas9 est fortement exprimé avec le traitement de doxycycline. Pendant ce temps, en raison de sa petite taille (100 nt), ARNg simples ou multiples peuvent être facilement livrés en iCas9 hPSCs avec une grande efficacité et peuvent diriger cas9 pour le clivage spécifique du site, ce qui permet la perturbation du gène NHEJ médiation efficace, ainsi que HDR-médiée modifications de nucléotides précises en présence de courts-ADN simple brin (ADNsb) modèles de donateurs. Le système peut être iCRISPRutilisé pour générer avec succès un panel de lignées HPSC maladie mimant avec biallélique (de homozygotes ou hétérozygotes composites) ou des mutations hétérozygotes perte de fonction dans les gènes de développement importants 5, 9. Bien qu&#39;un certain nombre de groupes ont rapporté l&#39;édition efficace de gènes en utilisant CRISPR / Cas dans hPSCs, le succès reste limité à un petit nombre de laboratoires technologiquement adepte. La plate - forme iCRISPR offre une solution efficace et simple pour l&#39; édition de gènes de routine par des chercheurs de différents niveaux de compétence, et il a déjà été utilisé dans un certain nombre d&#39;études publiées par notre groupe et d&#39; autres 9, 10, 11, 12. Cette approche a également été étendue à silençage inductible basé sur l&#39;expression de 13 dCas9-KRAB. Avec les progrès dans le génome d&#39;édition technologie, des améliorations significatives ont également été obtenus dans HPSC l&#39;entretien et la différenciation dirigée. Les conditions de culture pour hPSCs ont évolué à partir des conditions de milieu fibroblaste embryonnaire de souris irradiées (Imef) dépendant du dispositif d&#39; alimentation à des conditions exemptes d&#39;alimentation, sur des composants de la matrice extracellulaire définis et à partir des formulations de milieux complexes 14 de constitution chimique définie. Ces améliorations ont permis de réduire la variabilité des hPSCs dues à des différences de lot à lot de préparation et de sérum KO Imef pièces de rechange, et de fournir ainsi un environnement plus reproductible pour la différenciation HPSC. Pendant ce temps, une meilleure connaissance des voies régissant le développement embryonnaire humain, ainsi que des découvertes de haut débit des projections de drogue de signalisation, ont conduit à des protocoles de différenciation améliorés 15, 16, 17, 18. Ces protocoles imitent plus étroitement dans vivo les étapes de développement et de générer des types de cellules qui récapitulent étroitement leurs homologues in vivo. Pour la différenciation HPSC dans la lignée du pancréas, des protocoles initiaux imitaient développement pancréatique précoce relativement bien, mais finalement généré les cellules ß polyhormonal qui étaient des phénotypes fœtales immatures et mal répondu à la stimulation du glucose. Les récents progrès 16, 17, 19, 20 ont permis la génération de cellules ß-pancréatiques comme glucose-sensible, ce qui nous permettra d&#39;enquêter sur les événements ultérieurs, tels que la formation et la poursuite de la maturation des cellules ß monohormonal. Ici, nous détaillons l&#39;application des lignes du génome modifié pour l&#39;étude du développement du pancréas en combinant le système iCRISPR avec in vitro plate - forme de différenciation basée-HPSC vers glucose-sensible pancrles cellules ß-like eatic. Ce couplage de puissants outils d&#39;édition du génome , avec un meilleur protocole de différenciation HPSC offre non seulement la vitesse et de l&#39; ampleur nécessaire pour répondre à la demande croissante de la validation de la causalité de la maladie, mais permet également de manipulations génétiques sophistiquées pour d&#39; autres investigations mécanistiques dans le contrôle transcriptionnel qui sous - tendent le développement normal et la maladie 9 .

<table><tbody><tr><td>Milieu chimiquement défini (E8)</td>Milieu basal <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>Essential 8 et supplément Essential 8 inclus</td></tr><tr><td>Forme humaine recombinante tronquée de vitronectine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de ROCK Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de dissociation (enzyme TrypLE Select)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563029</td><td>1x, sans origine animale, enzyme recombinante</td></tr><tr><td>G418 Sulfate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10131035</td><td>Geneticin Antibiotique sélectif</td></tr><tr><td>Puromycine dichlorhydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>Puromycine Antibiotique sélectif</td></tr><tr><td>ADN polymérase (Herculase II Fusion)</td><td>Agilent Technologies</td><td>600679</td><td>kit PCR</td></tr><tr><td>MEGAshortscript T7 Transcription kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear Kit de nettoyage de transcription</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>Hyclate de doxycycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td>Sérum réduit Medium</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX Réactif de transfection</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>13778150</tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit de tissus</td><td>QIAGEN</td><td>69504</td><td>Kit d’extraction d’ADN génomique</td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 milieu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>Milieu BLAR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Fabriqué sur mesure avec une formulation publiée (Rezania et al., 2014)</td></tr><tr><td>Supplément de L-glutamine (GlutaMAX)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>LAMPIRE Biological Laboratories</td><td>7500855</td><td>Sans acides gras</td></tr><tr><td>GDF8</td><td>PeproTech</td><td>120-00</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Tige</td><td>04-0004</td><td>Inhibiteur de GSK-3</td></tr><tr><td>Acide L-ascorbique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td>Vitamine C</td></tr><tr><td>FGF7</td><td>R& D Systems</td><td>251-KG</td><td></td></tr><tr><td>SANT1</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1974</td><td>Inhibiteur de Hedgehog</td></tr><tr><td>RA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td>Acide rétinoïque</td></tr><tr><td>LDN</td><td>Stemgent</td><td>04-0019</td><td>Inhibiteur de BMP</td></tr><tr><td>IWP-2</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3533</td><td>Antagoniste de Wnt&nbsp ;</td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>TPB</td><td>EMD Millipore</td><td>565740-1MG</td><td>Activateur PKC</td></tr><tr><td>3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>ALK5i II</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-270-445</td><td>Inhibiteur d’ALK5 II</td></tr><tr><td>ZnSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0251</td><td></td></tr><tr><td>Héparine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>GSiXX</td><td>EMD Millipore</td><td>565789</td><td>Inhibiteur de la gamma sécrétase XX, inhibiteur de signalisation NOTCH</td></tr><tr><td>N-Cys (N-acétyl cystéine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>EMD Millipore</td><td>648471</td><td>Analogue de la vitamine E</td></tr><tr><td>R428</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2841</td><td>Récepteur AXL tyrosine kinase inhibiteur</td></tr><tr><td>24 mm Transwell avec insert</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3414</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Système d’électroporation</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>0,4 cm Cuvettes d’électroporation</td><td>Bio-Rad</td><td>1652081</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-TALEN-L</td><td>Addgene</td><td>59025</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-TALEN-R</td><td>Addgene</td><td>59026</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-Neo-M2RTTA</td><td>Addgene</td><td>60843</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-Puro-iCas9</td><td>Addgene</td><td>58409</td><td></td></tr><tr><td>T7 Endonuclease I</td><td>NEB</td><td>M0302L</td><td></td></tr><tr><td>Buffer 2</td><td>NEB</td><td>B7002S</td><td>NEBuffer 2</td></tr><tr><td>Long oligonucléotide Eton</td><td>Bioscience ou IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorps SOX17</td><td>R& D Systems</td><td>AF1924</td><td>1:500</td></tr><tr><td>FOXA2</td><td>anticorps Millipore</td><td>07-633</td><td>1:100</td></tr><tr><td>CXCR4-APC anticorps</td><td>R& D Systems</td><td>FAB170A</td><td>1:25</td></tr><tr><td>Anticorps PDX1</td><td>R& D Systems</td><td>AF2419</td><td>1:500</td></tr><tr><td>NKX6.1 anticorps</td><td>DSHB</td><td>F55A12</td><td>1:500</td></tr><tr><td>NKX2.2 anticorps</td><td>DSHB</td><td>74.5A5</td><td>1:100</td></tr><tr><td>NEUROD1</td><td>anticorps Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-1084</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Anticorps anti-insuline</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>1:2 000</td></tr><tr><td>Anticorps peptidique C</td><td>DSHB</td><td>GN-ID4-c</td><td>1:2 000</td></tr><tr><td>Anticorps anti-glucagon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2654</td><td>1:1 000</td></tr></tbody></table>

genome montage et différenciation dirigée des hpscs pour interrogation déterminants lineage dans le développement du pancréas humain

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Interrogation fonction des gènes dans l&#39;auto-renouvellement ou la différenciation des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) offre une plate-forme précieuse à la compréhension du développement humain et à disséquer les mécanismes de la maladie dans un plat. Pour tirer profit de cette application potentielle nécessite des outils efficaces génome d&#39;édition pour générer des mutants HPSC dans les gènes associés à la maladie, ainsi que in vitro protocoles de différenciation HPSC pour produire dans les types de cellules pathologiques pertinentes qui récapitulent étroitement leurs homologues in vivo. Une plate - forme génome-montage efficace pour hPSCs nommé iCRISPR a été développé par le ciblage TALEN à médiation d&#39;une cassette d&#39;expression cas9 dans le locus AAVS1. Ici, les protocoles pour la génération de lignées cas9 HPSC inductibles en utilisant des cellules cultivées dans un milieu chimiquement défini et un état libre dispositif d&#39;alimentation sont décrites. Les procédures détaillées pour l&#39;utilisation du système iCRISPR pour knockout de gène ou des altérations génétiques précises dans hPSCs, soit par nsur homologue extrémité de jonction (NHEJ) ou par des modifications de nucleotides précises à l&#39;aide d&#39;un modèle d&#39;homologie de réparation dirigée (HDR), respectivement, sont inclus. Ces procédures techniques comprennent des descriptions de la conception, la production et la transfection d&#39;ARN de guidage CRISPR (ARNg); la mesure du taux de mutation CRISPR ou par T7E1 RFLP essais; et la mise en place et la validation des lignées mutantes clonales. Enfin, nous procédures de chronique de différenciation HPSC dans les cellules ß-pancréatiques comme glucose sensible en imitant dans le développement embryonnaire du pancréas vivo. La combinaison de la technologie iCRISPR avec une différenciation HPSC dirigée permet l&#39;examen systématique de la fonction des gènes pour approfondir notre compréhension des mécanismes de développement et de la maladie du diabète pancréatique.

Protocoles pour générer des lignes de mutants HPSC en utilisant la plate-forme iCRISPR et de différencier hPSCs dans les cellules ß-like glucose-sensibles sont décrits. La combinaison de la technologie d&#39;édition génome avec une différenciation HPSC dirigée fournit une plate-forme puissante pour l&#39;analyse systématique du rôle des déterminants de la lignée dans le développement humain et de la progression de la maladie.

Genome Montage et différenciation dirigée des hPSCs pour Interrogation Déterminants Lineage dans le développement du pancréas humain

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Ce protocole décrit comment établir la plateforme iCRISPR pour une édition génomique rapide dans les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC), et comment intégrer des lignées génétiquement modifiées avec une différenciation pancréatique dirigée des hPSC afin d'étudier le développement pancréatique humain et les maladies associées. Ces méthodes permettent de répondre à des questions essentielles dans le domaine du développement pancréatique humain, telles que le contrôle génétique du développement pancréatique normal et la base moléculaire du diabète. Le principal avantage de ces techniques réside dans leur capacité à modifier efficacement des gènes d'intérêt dans les hPSC et à utiliser ces lignées cellulaires modifiées pour étudier in vitro le développement pancréatique humain et les maladies associées.Cultivez les CESP humaines dans des conditions chimiquement définies et sans cellules nourricières, sur des plaques revêtues de vitronectine humaine tronquée. La veille de l'électroporation, ajoutez un inhibiteur de la ROCK à 10 micromolaire lors du changement de milieu. Le jour de l'électroporation, préparez à l'avance des plaques de 10 centimètres revêtues de vitronectine.Ensuite, retirez le milieu de culture des cellules, rincez une fois avec du PBS sans calcium ni magnésium, puis traitez les cellules avec un réactif de dissociation 1X à 37 degrés Celsius pendant environ trois minutes. Ensuite, aspirez le réactif de dissociation avant que les cellules ne se détachent et ajoutez 10,5 millilitres de milieu complet. Procédez à un pipetage doux pour obtenir une suspension monocellulaire avant de transférer dans des tubes de centrifugation.Effectuez un dénombrement cellulaire sur 500 microlitres de suspension cellulaire à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé. Ensuite, centrifugez les hPSC à 200 × g pendant cinq minutes. Resuspendez les cellules dans du PBS froid à une concentration de 12,5 × 10⁶ cellules par millilitre, puis répartissez-les en aliquots de 800 microlitres.Ajouter les plasmides à chaque suspension de 800 microlitres de hPSC et mélanger soigneusement. Transférer le mélange dans une cuvette d'électroporation de 0,4 centimètre et conserver sur glace pendant environ cinq minutes. Électroporer les cellules à l’aide d’un système d’électroporation à 250 volts et 500 microfarads.Il est essentiel d'utiliser des hPSCs saines et proliférant pour l'édition du génome. Après électroporation, transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres contenant cinq millilitres de milieu complet préalablement réchauffé, puis mettez les cellules en pellet. Resuspendez les cellules dans 10 millilitres de milieu complet contenant 10 micromolaire d'inhibiteur ROCK, et ensemencez 1 × 10⁶, 2,5 × 10⁶ et 5 × 10⁶ cellules provenant de chaque électroporation dans des plaques revêtues de vitronectine, afin qu'au moins une des plaques présente un nombre suffisant de colonies monocellulaires pouvant être sélectionnées.Incubez les cellules à 37 degrés Celsius. Au jour deux, commencez la sélection par la néomycine en ajoutant un milieu contenant 500 microgrammes par millilitre de sulfate de G418. Au jour six, commencez la sélection par la puromycine en ajoutant un milieu contenant un microgramme par millilitre de chlorhydrate de dihydrochlorure de puromycine.Entre les jours 10 et 12, les colonies monocellulaires de cellules souches pluripotentes humaines atteindront un diamètre d’un à deux millimètres. À ce stade, sélectionnez 12 à 24 colonies au microscope stéréo. Dissociez mécaniquement les colonies de cellules souches pluripotentes humaines en petits fragments à l’aide d’une pipette de 200 microlitres, puis transférez directement les cellules dans des plaques de 24 puits revêtues de vitronectine.24 heures avant la transfection par ARN guide, traiter les cellules souches pluripotentes humaines exprimant iCas9 par deux microgrammes par millilitre de doxycycline. Le jour de la transfection, préparer des plaques de 24 puits revêtues de vitronectine et dissocier les cellules iCas9 en cellules individuelles à l’aide du réactif de dissociation 1X, comme précédemment. Ensuite, centrifuger les cellules à 200 × g pendant cinq minutes et resuspendre les cellules à une concentration de 0,5 × 10⁶ cellules par millilitre dans un milieu complet supplémenté avec deux microgrammes par millilitre de doxycycline et 10 micromolaire d’inhibiteur de ROCK.Plaquez 500 microlitres des cellules resuspendues dans des puits individuels d'une plaque 24 puits. Pour chaque ARN guide, préparez les mélanges de transfection suivants. Mélange A, 50 microlitres de milieu à faible teneur en sérum plus un microlitre d'ARN guide.Mélanger B : 50 microlitres de milieu à faible teneur en sérum plus trois microlitres de réactif de transfection. Combiner le mélange A et le mélange B pour obtenir une solution finale de 100 microlitres et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Ajouter 50 microlitres du mélange aux cellules dans les puits dupliqués de la plaque 24 puits et homogénéiser soigneusement.Après quatre jours, extraire l'ADN génomique, amplifier par PCR les régions cibles encadrant les séquences ciblées par l'ARN guide, puis estimer l'efficacité d'édition à l'aide d'une digestion T7E1. Commencer la différenciation des lignées de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) lorsque les cellules ont atteint une confluence de 80 %, deux jours après l'ensemencement. Ajouter le milieu du jour zéro de différenciation, puis changer les milieux quotidiennement en utilisant les formules indiquées ici.Le jour 10, analyser par coloration immunofluorescente un sous-ensemble des cellules pour détecter les marqueurs des progéniteurs pancréatiques tardifs PP2, PDX1 et NKX6.1. Ensuite, passer à la culture en interface air-liquide en traitant d'abord les cellules PP2 avec un inhibiteur de la ROCK à 10 micromolaire pendant quatre heures. Une fois le temps d'incubation écoulé, dissocier les cellules comme précédemment.Réduisez au minimum la durée d'exposition aux réactifs de dissociation afin de maximiser la survie cellulaire lors du semis à l'étape de différenciation à l'interface air-liquide. Aspirez le réactif de dissociation avant que les cellules ne se détachent. Ajoutez ensuite 10 millilitres de milieu boo-lah dans la plaque et dispersez les cellules PP2 en cellules uniques en pipettant doucement plusieurs fois vers le haut et vers le bas.Recueillir la suspension unicellulaire. Compter le nombre de cellules et former un culot cellulaire. Après resuspension du culot cellulaire dans le milieu de différenciation S5, déposer cinq à dix microlitres de cellules par point sur un filtre d'insert transwell.Ajouter le milieu S5 dans la partie inférieure de chaque insert transwell et incuber avec des changements de milieu jusqu'à ce que les marqueurs pancréatiques endocriniens soient détectables par coloration immunofluorescente. Cette figure montre la jonction non homologue médiée par iCRISPR dans les cellules souches pluripotentes humaines. L'extinction du gène est très efficace, aucune sélection n'étant nécessaire, et 20 % à 50 % de mutants bialléliques peuvent être facilement obtenus.Pour des modifications génétiques efficaces et précises, les ARN guide sont cotransfectés avec un ADN donneur monocaténaire portant la modification de séquence spécifique, indiquée en rouge. Souvent, afin d'éviter une nouvelle coupure dans les allèles modifiés, il est recommandé d'inclure une mutation silencieuse dans la séquence PAM, indiquée ici en vert. Avec ce système, environ 10 % des clones portant la modification du génome souhaitée, médiée par une réparation dirigée par homologie et sans altérations supplémentaires sur les deux allèles, peuvent être obtenus.Une fois maîtrisée, la mise en place d'une nouvelle lignée de cellules souches pluripotentes humaines exprimant l'iCas9 prend moins de deux mois. Après cela, diverses lignées de colonies de cellules souches pluripotentes humaines mutantes peuvent être générées en un à deux mois. Après la création de lignées cellulaires génétiquement modifiées, la différenciation in vitro progressive de ces lignées mutantes en cellules semblables à des cellules bêta pancréatiques permet d'étudier les étapes spécifiques du développement affectées par ces mutations, ce qui permettra une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents des maladies.

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JoVE Journal

Genetics

Génétique

La présente étude décrit une approche différenciation dirigée dans l'induction de la différenciation du pancréas de cellules souches embryonnaires humaines. D'une grande importance est le fait que des cellules endothéliales de co-culture de maturation de la médiation sur les cellules souches embryonnaires humaines dérivées des progéniteurs pancréatiques en cellules exprimant l'insuline.

Cellules endothéliales co-culture de maturation de la médiation de l&#39;homme les cellules souches embryonnaires à des cellules productrices d&#39;insuline du pancréas dans une approche différenciation dirigée

L’édition du génome des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) peut être effectuée rapidement et efficacement. Voici une procédure expérimentale robuste pour modifier génétiquement les hPSC, comme en témoigne l’édition du locus de la sphère de sécurité AAVS1 pour exprimer l’EGFP et introduire une résistance aux antibiotiques.

Création de Génome édités cellules souches pluripotentes humaines Lines: De Ciblage Isolement

Nous présentons ici pluripotentes humaines protocoles de culture de cellules souches (hPSC), utilisés pour différencier les hPSCs en CD34+ progéniteurs hématopoïétiques. Cette méthode utilise la manipulation spécifique au stade de canonique WNT de signalisation indiquer les cellules exclusivement pour le programme hématopoïétique de définitif ou primitif.

Réalisé la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitif des cellules souches pluripotentes humaines

Nous décrivons ici un protocole 4 étapes pour différencier les cellules souches embryonnaires humaines à NKX6-1 + progéniteurs pancréatiques in vitro. Ce protocole peut être appliqué à une variété de lignées de cellules souches pluripotentes humaines.

Différenciation efficace de pluripotentes cellules souches à NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; pancréatiques progéniteurs

Ce protocole décrit en détail la génération des cellules souches pluripotentes induites exempte d’empreinte (CISP) de cellules pancréatiques humaines dans des conditions sans chargeur, suivie d’édition en utilisant CRISPR/Cas9 ribonucléoprotéines et la caractérisation de la mis à jour le clones de cellules individuelles.

Génération efficace et l’édition de CISP exempte d’engraissement de cellules pancréatiques humaines en utilisant le système CRISPR-Cas9

Nous présentons ici un protocole pour produire de l’insuline exprimant 3D pancreatoids murin de progéniteurs pancréatique flottant e10.5 dissocié et le mésenchyme associé.

Génération d’insuline exempte d’échafaudage, en trois dimensions exprimant Pancreatoids de souris progéniteurs pancréatique In Vitro

Nous présentons ici un protocole détaillé afin de différencier les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) dans les protéines de boîte homéotique pancréas/duodénum 1+ (PDX1+) pour la génération des lignées du pancréas, les cellules basé sur la croissance de monocouche de type non colonie de dissocier les cellules individuelles. Cette méthode convient pour la production homogènes cellules dérivées d’hPSC, la manipulation génétique et dépistage.

Génération efficace du pancréas/duodénum homéotique Protein 1+ postérieure Foregut/pancréatique progéniteurs de hPSCs dans les Cultures de l’adhérence

Le présent protocole décrit une méthode améliorée pour augmenter la co-expression des facteurs de transcription PDX1 et NKX6.1 chez les progéniteurs pancréatiques dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) dans des monocouches planes. Ceci est réalisé en reconstituant la matrice fraîche, en manipulant la densité cellulaire et en dissociant les cellules endodermiques.

Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en précurseurs de cellules bêta pancréatiques dans un système de culture 2D

La différenciation des cellules souches en cellules d’îlots pancréatiques offre une solution alternative au traitement conventionnel du diabète et à la modélisation de la maladie. Nous décrivons un protocole détaillé de culture de cellules souches qui combine un kit de différenciation commercial avec une méthode préalablement validée pour aider à produire des îlots dérivés de cellules souches sécrétrices d’insuline dans une boîte.

Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en amas d’îlots pancréatiques producteurs d’insuline

Cet article présente un protocole de différenciation dirigée et d’analyse fonctionnelle des cellules de type β-cellules. Nous décrivons les conditions de culture et les passages optimaux pour les cellules souches pluripotentes humaines avant de générer des cellules pancréatiques productrices d’insuline. La différenciation en six étapes progresse de la formation définitive de l’endoderme à des cellules fonctionnelles de type β sécrétant de l’insuline en réponse au glucose.

Protocole optimisé pour la génération de cellules pancréatiques fonctionnelles sécrétant de l’insuline à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Nous proposons un protocole mini-invasif pour la transplantation intramusculaire d’îlots de cellules souches pancréatiques dérivées de cellules souches humaines dans des souris immunodéficientes pour une implantation in vivo et une analyse en aval.

Transplantation intramusculaire de cellules endocrines pancréatiques dérivées des cellules souches pluripotentes humaines chez la souris

Apprenez le montage génomique iCRISPR et la différenciation dirigée des hPSCs pour étudier les déterminants de lignée dans le développement pancréatique humain. Cette méthode permet d'explorer les mécanismes génétiques du diabète.

Genome Montage et différenciation dirigée des hPSCs pour Interrogation Déterminants Lineage dans le développement du pancréas humain (Vidéo) | JoVE Journal

Genome Montage et différenciation dirigée des hPSCs pour Interrogation Déterminants Lineage dans le développement du pancréas humain

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