In Vitro Différenciation des cellules souches pluripotentes humaines en cellules trophoblastiques

L’objectif global de ce protocole est de différencier les cellules souches pluripotentes humaines en cellules trophoblastiques humaines en utilisant l’os morphogénique 4 et les inhibiteurs des voies de signalisation active et nodale afin d’étudier les événements précoces de la formation et de la fonction placentaires humaines. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans l’étude des fonctions des cellules trophoblastiques et de la formation de ces cellules. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut produire des cellules trophoblastiques abondantes pour une grande variété d’applications, y compris la génétique, et permettre des tests de fonction cellulaire.

Pour commencer l’expérience, décongelez une aliquote de matrice extracellulaire sur de la glace pendant trois à quatre heures. À l’aide d’embouts glacés, d’un tube conique froid de 50 millilitres et du milieu égal modifié de Dulbecco, ou milieu DMEM F12, transférez deux milligrammes de matrice extracellulaire dans 24 millilitres de DMEM F12 glacé. Transférez immédiatement le tube conique de 50 millilitres dans de la glace et rangez-le à quatre degrés Celsius.

Pour enrober les plaques de culture tissulaire, ajoutez un millilitre de matrice extracellulaire diluée par puits d’une plaque à six puits. Faites tourner l’assiette pour enrober les puits et incubez l’assiette à température ambiante pendant au moins une heure. Aspirez la matrice extracellulaire de la nouvelle plaque et ajoutez un milieu conditionné aux fibroblastes embryonnaires de souris ou MEFCM contenant bFGF.

À l’aide d’une pipette, transférez les pinces cellulaires grattées de la plaque MEF et aliquotez-les dans la plaque recouverte d’une matrice extracellulaire. Incuber ensuite la plaque. Grattez les cellules différenciées à l’aide d’une pipette Pasteur avant de remplacer le MEFCM par du milieu bFGF tous les jours, en utilisant deux millilitres de milieu pour un puits.

Lorsque les colonies apparaissent grandes et brillantes au microscope, passez les CSEh tous les six à sept jours. Lorsque les cellules sans alimentateur sont prêtes à passer, retirez le milieu et lavez les cellules en ajoutant un millilitre de PBS à l’aide d’une pipette. Aspirez le PBS et remplacez-le par 0,5 milligramme par millilitre de dispase préchauffé à l’aide d’une pipette.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après l’incubation, lavez les cellules avec du PBS en ajoutant deux millilitres de PBS par puits et aspirez le PBS. Ajoutez un millilitre de CM par puits et grattez manuellement les cellules en petits amas à l’aide de la pointe d’une pipette de cinq millilitres.

Ensuite, plaquez les agglomérations de cellules en suspension dans de nouvelles plaques recouvertes d’une matrice extracellulaire. Préparez le milieu de différenciation. Utilisez CM sans bFGF et ajoutez de nouveaux inhibiteurs avant utilisation.

Utilisez des CSEh sans mangeoire poussant sur des plaques recouvertes de matrice extracellulaire pour un passage cultivé à l’intérieur d’un incubateur réglé à 5 % d’oxygène. Après le premier passage sur les plaques recouvertes de matrice extracellulaire, laissez les cellules se fixer pendant 24 heures. Le lendemain, amorcez la différenciation en retirant le CM contenant du bFGF et en le remplaçant par du CM contenant du BMP4/A/P avec deux millilitres par puits dans une plaque à six puits.

Continuez à cultiver les cellules en utilisant des niveaux d’oxygène de 4 %. Remplacez le CM contenant BMP4/A/P tous les deux jours en aspirant l’ancien milieu et en ajoutant un nouveau milieu contenant BMP4/A/P. Collectez les cellules aux points temporels souhaités.

Cultiver des CSEh pour deux passages sur une matrice extracellulaire après les avoir transférés à partir des MEF avec un milieu hESC contenant du bFGF. Une confluence cellulaire élevée est importante, alors divisez les CSEh un à un sur une nouvelle plaque qui assurera une confluence d’au moins 50 % le lendemain. Incuber les cellules pendant la nuit dans l’incubateur à faible teneur en oxygène.

Le lendemain, remplacez le milieu par deux millilitres par puits de milieu de différenciation. Placez les cellules dans un incubateur à faible teneur en oxygène pendant la nuit. Avant la transfection, enrober un plat de gélatine en ajoutant 0,1 % de gélatine dans un plat.

Agitez le plat pour enrober l’assiette, puis laissez l’assiette à température ambiante. Au bout de 20 minutes, retirez la gélatine. Différenciez les cellules jusqu’au point temporel souhaité.

La veille de la transfection, trypsinisez les cellules avec 0,05 % de trypsine pendant cinq minutes. Plaquez les cellules à la confluence souhaitée sur la plaque recouverte de gélatine. Ajouter du CM contenant BMP4/A/P dépourvu de bFGF et incuber la culture pendant la nuit.

Le lendemain, ajoutez un nouveau milieu de différenciation aux cellules. Transfectez des siRNA à l’aide d’un réactif de transfection de siRNA. Pour l’ADN plasmatique, utilisez un réactif de lipofectamine approprié.

Suivez le protocole du produit tel que décrit pour chaque réactif de transfection. Transférez les complexes lipofectamine siRNA dans chaque puits ou plaque de cellules et mélangez doucement. Ensuite, cultivez les cellules pendant la nuit dans un incubateur à faible teneur en oxygène.

Le lendemain, remplacez le média par un nouveau média de différenciation. Récoltez les cellules aux moments souhaités pour vérifier l’efficacité de la perturbation génique à l’aide de la RT-PCR quantitative. Enfin, pour récolter les cellules, ajoutez un millilitre de trypsine à 0,05 % par puits et incubez les cellules.

Ajoutez cinq millilitres de milieu MEF par puits pour neutraliser la trypsine. Faites tourner les cellules à 200 fois g pendant cinq minutes et utilisez la pastille cellulaire pour l’isolement de l’ARN. En utilisant cette technique, les changements morphologiques sont clairement visibles.

Les cellules du premier jour de la différenciation sont plus grandes que les cellules du jour zéro. Au fur et à mesure que la différenciation se poursuit, les cellules se divisent et s’étendent à partir du centre de la colonie, se développant vers l’extérieur. Les colonies individuelles fusionnent par différenciation le cinquième jour, les cellules se développant les unes sur les autres.

L’analyse QRT-PCR révèle que les niveaux d’expression relatifs du marqueur C pluripotent NANOG sont réduits de 75 % après un jour de différenciation lorsque les cellules sont cultivées avec BMP4 et réduits de 90 % en présence de BMP4/A/P. Au deuxième jour de différenciation, les niveaux de NANOG sont très faibles pour les cellules cultivées dans BMP4 seul ou dans BMP4/A/P par rapport à celles dans un milieu hESC CM contenant du bêta FGF. Les transfections effectuées à l’aide d’un plasmide GFP et introduites dans des cellules traitées par BMP4/A/P le premier et le troisième jour de différenciation ont obtenu une efficacité de transfection de 30 à 50 % 24 heures après la transfection.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de différencier les cellules pluripotentes humaines en cellules trophoblastiques in vitro et comment introduire des constructions d’ADN pour manipuler l’expression des gènes.