Name: In Vitro Différenciation des cellules souches pluripotentes humaines en cellules trophoblastiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Apprenez la différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en trophoblastes utilisant BMP4 et des inhibiteurs des voies Activin/Nodal. Cette méthode efficace permet d'étudier la formation placentaire et la biologie du développement.

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NOTE: Pour la différenciation des CSEh soit ou hiPSCs en progéniteurs trophoblaste, hPSCs cultivées sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) sont transition vers feeder libres conditions pour deux passages avant d&#39;initier la différenciation avec BMP4 / A / P. Ce processus élimine la contamination MEF de cellules différenciées. Ici, nous présentons un protocole pour la différenciation des CSEh, et le même protocole peut être appliqué à hiPSCs. 1. Culture et récupération des CSEh sur irradiées fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) (Préparation) <ol><li> Gamma-irradiation de MEFs <ol><li> Faire 500 ml de milieu pour la culture des FAE: DMEM avec 10% de FBS, 2 mM de L-glutamine, 1 x pénicilline / streptomycine (Pen / Strep) et 0,1 mM d&#39;acides aminés non essentiels (NEAA). </li><li> Décongelez un flacon de MEFs primaires et utiliser milieu MEF pour la culture des cellules. Développez les MEFs primaires à 30 plaques à l&#39;aide de milieu de culture MEF. NOTE: Les concentrations d&#39;oxygène ne sont pas critiques pour cette étape, de sortesoit des conditions physiologiques (4%) ou ambiant (20%) au sein de l&#39;incubateur peuvent être utilisés. </li><li> Récolter les MEFS. En utilisant 0,25% de trypsine pour éliminer les MEFs des plaques et transférer les cellules dans un tube conique. Placez les MEF en un instrument d&#39;irradiation et d&#39;exposer les cellules à 3500 grays. NOTE: La quantité de temps dépendra de l&#39;activité de la source à l&#39;intérieur de l&#39;unité de irradiateur. </li><li> Resuspendre les MEFs irradiés avec un milieu de culture MEF et compter le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre. </li><li> Pellet les MEF utilisant une centrifugeuse et ajouter 50% du milieu de culture MEF et 50% cellule milieu de congélation (80% de FBS et 20% de milieu de culture MEF). Aliquote de 1 x 10 6 cellules par flacon. </li><li> Placer les flacons MEF irradiées dans un -80 ° C congélateur pendant une nuit, puis de les transférer à l&#39;azote liquide pour le stockage à long terme. </li></ol></li><li> Dégel MEFs congelés et CSEh pour la culture <ol><li> Faire 500 ml de milieu hESC: DMEM / F-12 avec 20% de sérum Replacement mM, 0,1 NEAA, 2 mM de L-glutamine, de 10 ng / ml de bFGF, 0,1 mM de ß-mercaptoéthanol et 1 x Pen / Strep. </li><li> Décongelez un flacon de MEFs un jour avant décongélation des CSEh. Enduire une plaque à 6 puits avec 0,1% de gélatine, en utilisant 1 ml pour chaque puits. Incuber pendant au moins 20 min à température ambiante, puis retirez la gélatine. </li><li> Retirer un flacon de MEFs de stockage dans l&#39;azote liquide et immerger le flacon dans un bain d&#39;eau C 37 °. Regardez le flacon par intermittence jusqu&#39;à ce que de petits cristaux de glace restent. transférer rapidement le contenu du flacon à 9 ml de milieu FAE dans un tube conique de 15 ml. </li><li> Sédimenter les cellules par centrifugation à 200 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans un milieu MEF. Aliquoter la FAE uniformément sur une plaque de 6 puits. Mettre la plaque dans un 37 ° C faible teneur en oxygène (4%) incubateur pendant une nuit. </li></ol></li><li> La culture de routine de CSEh sur MEFs <ol><li> Retirer un flacon de CSEh à partir de l&#39;azote liquide et décongeler rapidement le flacon en utilisant un 37 ° C bain d&#39;eau. pipette doucement les CSEh dans un tube conique de 15 ml contenant 9 ml de milieu CSEh et centrifuger à 200 xg pendant 5 min. Retirez le moyen et remettre les cellules avec 1 ml de milieu CSEh. </li><li> Aspirer le milieu MEF de la plaque préparée à l&#39;étape 1.2.4 et ajouter 1 ml de milieu CSEh. Ajouter inhibiteur Rock Y-27632 (10 uM) au milieu CSEh. Transférer les CSEh sur MEF. </li><li> Placer les cellules dans un 37 ° C faible teneur en oxygène (4%) incubateur pendant une nuit. Remplacez le support CSEh quotidien. Grattez cellules différenciées avec une pipette Pasteur, visualisés sous un microscope droit à 4X. </li><li> Passage des hESC tous les 4-6 jours, en fonction de la confluence cellulaire et la taille des colonies hESC. Préparer une plaque de MEFs la veille repiquage. Lorsque les cellules sont prêtes au passage, éliminer le milieu CSEh et laver le puits avec 1 ml de PBS. </li><li> Ajouter 1 mg / ml de collagénase (préchauffé à 37 ° C), incuber à 37 ° C pendant 5 min, puis retirez le collagénase. Wcendres les cellules avec du PBS, ajouter 1 ml de milieu CSEh par puits, et gratter manuellement les cellules en petits bouquets en utilisant la pointe d&#39;un pipette de 5 ml. Transférer les amas de cellules en suspension dans un puits (s) nouvelle MEF-enduit. </li></ol></li></ol> 2. Transition de CSEh à partir de MEFs Feeder-Free sur plaques Matrice Extracellulaire enduites <ol><li> Préparer MEF milieu conditionné (CM) <ol><li> Plate les MEFs irradiées dans un flacon T75 à 90-100% de confluence; il est important que les MEF sont densément plaquées. Observer les cellules en utilisant un microscope pour déterminer si elles ont fixé au fond du flacon (FAE fixent environ 6 heures après le placage ou le jour suivant). REMARQUE: les cellules seules flottent dans le milieu lorsqu&#39;il est observé à l&#39;aide d&#39;un microscope. Le lendemain, retirez moyen MEF et ajouter 25 ml de milieu CSEh manquant B-FGF. </li><li> Recueillir le milieu conditionné après 24 heures d&#39;incubation. Remplacez-le par du milieu frais par jour pendant un maximum de 12 jours. </li&gt; <li> Filtrer le CM collecté en utilisant un filtre de 0,22 pm. Avant d&#39;utiliser, ajouter frais B-FGF au CM. NOTE: CM peut être congelé à -80 ° C et stocké pendant 1 an. Vous pouvez également stocker le CM à 4 ° C pendant 2 semaines. </li></ol></li><li> Transition des CSEh à partir de la culture sur les MEF pour des liaisons de connexion des plaques de matrice extracellulaire revêtu. <ol><li> Préparation de la matrice extracellulaire pour des plaques de culture tissulaire de revêtement <ol><li> Décongeler une aliquote de la matrice extracellulaire sur la glace (environ 3-4 h). En utilisant des pointes glacées, un 50 ml tube conique à froid, et du milieu DMEM / F12, transfert 2 mg de la matrice extracellulaire dans 24 ml de glace-froid DMEM / F-12 (la dilution dépend de la concentration de la matrice extracellulaire du fournisseur ). </li><li> Transférer immédiatement les 50 ml tube conique à la glace et le stocker à 4 ° C. Pour les plaques de culture de tissu de revêtement, ajouter la quantité appropriée de la matrice extracellulaire diluée au bien (par exemple, 1 ml par puits dans une plaque de 6 puits). Agiter pour recouvrir la plaque et incuber à température ambiante pendant au moins 1 h. </li></ol></li><li> CSEh Passage des MEF (comme dans l&#39;étape 1.3) en utilisant CM contenant B-FGF (10 ng / ml). <ol><li> Aspirer pour éliminer la matrice extracellulaire de la nouvelle plaque et ajouter CM contenant B-FGF. Transférer les amas cellulaires grattées de la plaque MEF utilisant une pipette et aliquoter dans la plaque de matrice extracellulaire revêtue. Incuber dans le 37 ° C incubateur faible teneur en oxygène pendant la nuit. </li><li> Remplacer le CM avec un milieu de B-FGF quotidienne; la quantité de milieu dépend de la taille du flacon de culture. Utilisez 2 ml de milieu pour une 6 puits bien. Grattez cellules différenciées avec une pipette Pasteur. </li><li> CSEh Passage tous les 6-7 jours, lorsque les colonies sont lumineuses lorsqu&#39;il est vu sous le microscope. NOTE: colonies CSEh cultivées sur des plaques de matrice extracellulaire revêtues sont plus grandes que les cellules MEF-cultivées. </li><li> Lorsque les cellules nourricières libre-sont prêts à passage, éliminer le milieu, laver par l&#39;annonceurding 1 ml de PBS à l&#39;aide d&#39;une pipette, aspirer pour éliminer le PBS, ajouter 0,5 mg / ml de dispase (préchauffée à 37 ° C) avec une pipette et on incube à 37 ° C pendant 5 min. </li><li> Laver les cellules avec du PBS par addition de 2 ml de PBS par puits et en aspirant ensuite. Ajouter 1 ml de CM par puits et gratter manuellement les cellules en petits bouquets en utilisant la pointe d&#39;un pipette de 5 ml. </li><li> Plate les amas de cellules en suspension dans de nouvelles plaques de matrice extracellulaire revêtu; les cellules devraient adhérer après 24 h. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Différenciation des CSEh Utilisation BMP4 / A / P <ol><li> Préparer le milieu de différenciation. CM utilisation (absence de FGF-B) et ajouter (fraîche) BMP4 (50 ng / ml), A83-01 (1 uM) et PD173074 (0,1 M). Ajouter ces inhibiteurs au CM avant utilisation. </li><li> Utilisez CSEh sans alimentation en croissance sur des plaques de matrice extracellulaire revêtu pour 1 passage, cultivées à l&#39;intérieur d&#39;un incubateur fixé à 4% d&#39;oxygène. Après le premier passage sur des plaques de matrice extracellulaire revêtu,laisser les cellules se fixent pendant 24 heures. Le lendemain, initier la différenciation. Retirez le CM (contenant B-FGF) et le remplacer par CM contenant BMP4 / A / P (2 ml par puits dans une plaque de 6 puits). Continuer la mise en culture des cellules en utilisant des niveaux d&#39;oxygène 4%. </li><li> Remplacer le CM contenant BMP4 / A / P (2 ml / puits pour une plaque de 6 puits) tous les 2 jours. Aspirer pour enlever l&#39;ancien milieu et ajouter un nouveau CM à l&#39;aide d&#39;une pipette. Le deuxième jour après l&#39;ajout et la suppression BMP4 B-FGF (considéré comme le jour de différenciation 2), la morphologie cellulaire change, apparaissant plus grande lorsqu&#39;elle est observée en utilisant un microscope. NOTE: les cellules non différencié, qui présentent des bords ronds lumineux, ne seront pas présents. </li><li> Recueillir les cellules à points de temps souhaités. Les cellules différenciées vont arrêter de se diviser après environ 2 semaines. cellules transfecter au cours de cette période de temps (voir la section suivante). </li></ol> 4. Transfection de cellules trophoblastiques avec siRNA ou l&#39;ADN plasmidique <ol><li> Préparer les cellules trophoblastiques pour la transfection </strong&gt; <ol><li> CSEh de culture pour deux passages sur la matrice extracellulaire après leur transfert des MEF (voir l&#39;étape 2.2). Utiliser le milieu CSEh contenant B-FGF. </li><li> Divisez les CSEh sur une nouvelle plaque de matrice extracellulaire un jour avant la différenciation. Haute confluence cellulaire est important, donc diviser les cellules 1: 1 sur une nouvelle plaque / puits, qui assurera au moins 50% de confluence le lendemain. Incuber les cellules pendant la nuit dans l&#39;incubateur faible teneur en oxygène. NOTE: Les CSEh ne doivent pas être pris en compte lors de cette étape. </li><li> Le lendemain, remplacer le milieu par le milieu de différenciation (CM contenant BMP4 / A / P et manquant B-FGF, en utilisant 2 ml / puits pour une plaque de 6 puits). Retirer l&#39;ancien milieu par aspiration et transférer le nouveau support (2 ml) à l&#39;aide d&#39;une pipette. Placer les cellules dans un incubateur à faible teneur en oxygène (4% d&#39;oxygène) pendant une nuit. </li></ol></li><li> Transfections utilisant des ARNsi de perturbation du gène ou à l&#39; aide de l&#39; ADN plasmidique <ol><li> Différencier les cellules jusqu&#39;à ce que le Time- désirépoint (entre les jours 1 et 14). Le jour avant la transfection, Trypsiniser les cellules en utilisant 0,05% de trypsine pendant 5 min. Plate-les à la confluence souhaitée (selon le protocole de réactif de transfection) sur une plaque de gélatine, enrobées (ajout de 0,1% de gélatine à une plaque de culture tissulaire pendant 20 min, et aspirer à enlever). Ajouter CM contenant BMP4 / A / P (manquant B-FGF) et incuber pendant la nuit. </li><li> Le jour suivant, ajouter un milieu de différenciation dans les cellules fraîches. Transfecter ARNsi en utilisant un réactif de transfection ARNsi. Pour l&#39;ADN de plasmide, en utilisant un réactif lipofectamine approprié. </li><li> Suivre le protocole du produit comme décrit pour chaque réactif de transfection. Transférez les complexes de siRNA-lipofectamine à chaque puits / plaque de cellules, mélanger doucement, et la culture des cellules pendant la nuit dans un incubateur à faible teneur en oxygène. NOTE: Certains réactifs de transfection sont inhibées par des antibiotiques, qui exigent CM manque Pen / Strep. </li><li> Le lendemain, le remplacer par les médias de différenciation frais. </li><li> Récolter les cellules au désird points de temps (par exemple, 24 h, 48 h et 72 h) pour vérifier l&#39;efficacité de la perturbation des gènes en utilisant RT-PCR quantitative. Pour la récolte de cellules, utilisez 0,05% de trypsine, en ajoutant 1 ml par puits et incubation pendant 5 min à 37 ° C. Ajouter 5 ml de milieu MEF par puits pour neutraliser la trypsine. Centrifuger les cellules à 200 xg pendant 5 min et en utilisant le culot cellulaire pour l&#39;isolement de l&#39;ARN. </li></ol></li></ol> 5. Pathogen Infection des cellules trophoblastiques: Infection virale Sendai <ol><li> Préparer CSEh de différenciation <ol><li> CSEh de culture pour deux passages sur la matrice extracellulaire après le transfert des MEF (voir l&#39;étape 2.2). Utiliser le milieu CSEh contenant B-FGF. </li><li> Divisez les CSEh sur une nouvelle plaque de matrice extracellulaire un jour avant la différenciation. Haute confluence cellulaire est des cellules importantes, alors fendues 1: 1 sur une nouvelle plaque / puits, qui assurera au moins 50% de confluence le lendemain. Incuber les cellules pendant une nuit dans un incubateur à faible teneur en oxygène (4% d&#39;oxygène). &lt;br /&gt; NOTE: CSEh ne doivent pas être pris en compte lors de cette étape. </li><li> Le jour suivant, remplacer le milieu par le milieu de différenciation (CM contenant BMP4 / A / P et B dépourvu FGF) et de la culture pendant une nuit dans un incubateur à faible teneur en oxygène (4% d&#39;oxygène). </li></ol></li><li> Sendai infection virale des cellules trophoblastiques <ol><li> Un jour avant le jour de différenciation souhaitée, trypsiniser les cellules différenciées (à cellules individuelles) en utilisant 0,05% de trypsine pendant 5 min et les transférer sur une plaque revêtu de gélatine. Ajouter milieu de différenciation et incuber pendant la nuit dans un incubateur à faible teneur en oxygène. </li><li> Le jour suivant, ajouter du milieu d&#39;infection (cela peut varier en fonction du virus). Utiliser CM manque Pen / Strep contenant BMP4 / A / P, en utilisant 0,5 ml pour un puits d&#39;une plaque à 6 puits. Ajouter le virus Sendai pour MOI = 1. Incuber pendant 8 heures dans un incubateur à faible teneur en oxygène. </li><li> Si le temps des points supplémentaires sont nécessaires, éliminer le milieu contenant le virus après 4 h et le remplacer par BMP4 / A / P CM. Recueillir les cellulespour l&#39;isolement d&#39;ARN en utilisant un grattoir à cellules. </li><li> Déterminer l&#39;efficacité de l&#39; infection virale en effectuant qRT-PCR pour les gènes impliqués dans la réponse virale 18. </li></ol></li></ol>

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<li>Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+fibroblast+growth+factor+%28FGF%29+receptor+2+suggests+a+role+for+FGF+signaling+in+pregastrulation+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).</li>
<li>Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF2+sustains+NANOG+and+switches+the+outcome+of+BMP4-induced+human+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation.</a> Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).</li>
<li>Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+inhibition+directs+BMP4-mediated+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+syncytiotrophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+and+development%22%5BJournal%5D)">FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast.</a> Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).</li>
<li>Bischof, P., Irminger-Finger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+cytotrophoblastic+cell%2C+a+mononuclear+chameleon%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).</li>
<li>Cole, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycosylated+hCG%2C+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Hyperglycosylated hCG, a review.</a> Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).</li>
<li>Apps, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+leucocyte+antigen+%28HLA%29+expression+of+primary+trophoblast+cells+and+placental+cell+lines%2C+determined+using+single+antigen+beads+to+characterize+allotype+specificities+of+anti-HLA+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies.</a> Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Nous avons présenté les étapes de base pour différencier les CSEh en progéniteurs trophoblaste. Ce protocole a récemment été optimisé pour différencier rapidement hESC avec l&#39;addition d&#39;inhibiteurs de l&#39;activine / signalisation Nodal, en augmentant la différenciation des cellules trophoblastiques et en évitant la production de progéniteurs de mésoderme, qui sont généralement observés avec le traitement de la BMP4 seul. Le système de modèle de BMP4 permet l&#39;examen des premiers stades de la spécification t...

Le placenta est nécessaire pour la croissance et la survie du fœtus pendant la grossesse et facilite l&#39;échange de gaz, des nutriments, des déchets et des hormones entre la circulation maternelle et fœtale. Le premier organe formé au cours de l&#39; embryogenèse chez les mammifères est le placenta, qui commence à développer 6-7 jours après la conception chez l&#39; homme et chez la souris 3,5-4,5 jours 1, 2, 3, 4. les cellules sont des cellules trophoblastiques les plus importantes du placenta, et ces cellules représentent l&#39;un des événements les plus précoces de la différenciation de la lignée de l&#39;embryon de mammifère. Elles proviennent des cellules du trophectoderme extra-embryonnaires externes du blastocyste préimplantatoire. Notre connaissance des premiers stades du développement placentaire est limitée par les restrictions éthiques et logistiques sur la modélisation du développement humain précoce. Au cours de l&#39;implantation embryonnaire, trophoblastesenvahir l&#39;épithélium maternelle et se différencier en cellules progénitrices spécialisés 5. Cytotrophoblastes (CTBS) sont mononucléées, progéniteurs indifférenciés qui fusionnent et se différencient en syncytiotrophoblastes (SYN) et trophoblastes invasives extravilleux (de EVTS), qui ancre le placenta à l&#39;utérus. SYNs sont multinucléées, les cellules différenciées qui synthétisent les hormones nécessaires au maintien de la grossesse. Les événements de différenciation précoce qui génèrent EVTS et SYNs sont essentiels pour la formation du placenta, comme les déficiences dans les cellules trophoblastiques aboutissent à une fausse couche, la pré-éclampsie, et la restriction de croissance intra - utérine 1. Les types de lignées cellulaires trophoblastiques humaines qui ont été développées comprennent immortalisés CTBS et choriocarcinome, qui produisent des hormones placentaires et présentent des propriétés invasives 6. cellules trophoblastiques primaires de placentas premier trimestre humains peuvent être isolés, mais les cellules rapidement differentiate et arrêter la prolifération in vitro. Surtout, transformé et des lignées de cellules primaires ont des profils d&#39;expression de gènes différents, ce qui indique que les lignées cellulaires tumorigènes et immortalisés trophoblaste peuvent ne pas représenter exactement les trophoblastes principaux 7. En outre, ces lignes ne sont pas susceptibles de ressembler à trophoblaste placentaire progéniteurs des cellules souches parce qu&#39;ils sont dérivés de stade plus avancé d&#39;abord par le troisième trimestre. Il y a un besoin pour un robuste système de culture in vitro de stade précoce trophoblastes humains afin d&#39;étudier les événements précoces de la formation et de la fonction placentaire. cellules souches embryonnaires humaines (CSEh), qui partagent les propriétés avec la masse cellulaire interne de l&#39;embryon préimplantatoire, sont fréquemment utilisés pour modéliser le développement humain précoce, y compris la formation du début du placenta. Les deux cellules d&#39;origine humaine souches pluripotentes (de hiPSCs) et CSEh peuvent être différenciées en trophoblaste in vitro utilisant des os MorLa protéine phogenic 4 (BMP4) , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. Cette conversion des cellules pluripotentes à des cellules trophoblastiques utilisant BMP4 est spécifique pour les cellules humaines et est largement utilisé pour étudier le développement du placenta humain tôt , car il ne nécessite pas l&#39; accès à des embryons humains précoces 9, 16. Récemment, on a découvert que l&#39;addition des inhibiteurs A83-01 (A) et PD173074 (P), qui bloquent les voies SMAD2 / 3 et MEK1 / 2 signalisation, augmente l&#39;efficacité de la différenciation des progéniteurs dans HPSC trophectoderme analogue, principalement SYNs et EVTS, sans la génération étendue de mésoderme, endoderme, ectoderme ou des cellules 9, 17 </sup&gt;. En utilisant ces conditions moyennes, hESC différenciées pendant 12 jours ont des profils d&#39;expression génique similaire à des cellules du trophectoderme isolées à partir d&#39; embryons blastocyste stade humain et sécrètent diverses hormones de croissance placentaire spécifique, en soutenant la validité de ce système in vitro du modèle 9, 11. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la différenciation des hPSCs in vitro dans les progéniteurs trophoblastiques humaines en utilisant BMP4 / A / P milieu de culture. Ces conditions produisent des nombres de cellules abondantes pour une grande variété d&#39;applications, y compris le séquençage de l&#39;ARN, de disruption de gène en utilisant des ARNsi, des infections pathogènes, et la modification génétique en utilisant la transfection à médiation par lipofection.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Knock Out Remplacement du sérum</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>C’est ce qu’on appelle le « remplacement du sérum » dans ce protocole.</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-155</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>B-FGF</td><td>Millipore</td><td>GF-003</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de roche Y27632</td><td>Calbiochem</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>CF1 MEFs irradiés</td><td>GlobalStem</td><td>6001G</td><td>Les MEF peuvent être générés à partir du jour embryonnaire 13,5 embyos et irradiés.</td></tr><tr><td>0,22 et micro ; Filtre à seringue</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 150i Incubateur à faible teneur en oxygène</td><td>Heracell/VWR</td><td>89187-192</td><td>Tout incubateur de culture tissulaire capable de réguler les concentrations d’oxygène est suffisant.</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP-01M</td><td></td></tr><tr><td>A 83-01</td><td>R& D Systems</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>PD173074</td><td>R& D Systems</td><td>3044/10</td><td></td></tr><tr><td>RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596026</td><td>Trizol est utilisé pour isoler l’ARN total.</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365779001</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>C’est ce que l’on appelle la « matrice extracellulaire » dans ce protocole.</td></tr></tbody></table>

in vitro différenciation des cellules souches pluripotentes humaines en cellules trophoblastiques

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Le placenta est le premier organe à développer au cours de l&#39;embryogenèse et est nécessaire pour la survie de l&#39;embryon en développement. Le placenta est composé de différentes cellules trophoblastiques qui se différencient à partir des cellules du trophectoderme extra-embryonnaire du blastocyste préimplantatoire. En tant que tel, notre compréhension des événements de différenciation précoce du placenta humain est limitée en raison des restrictions éthiques et juridiques sur l&#39;isolement et la manipulation de l&#39;embryogenèse humaine. Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) sont un système modèle robuste pour enquêter sur le développement humain et peuvent également être différenciées in vitro en cellules trophoblastiques qui expriment des marqueurs des différents types de cellules trophoblastiques. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour différencier hPSCs dans les cellules trophoblastiques en utilisant la protéine morphogénétique osseuse 4 et inhibiteurs des activine / voies de signalisation Nodal. Ce protocole génère divers types de cellules trophoblastiques qui peuvent être transfectées avec des ARNsipour enquêter sur les phénotypes de perte de fonction ou peuvent être infectés par des agents pathogènes. En outre, hPSCs peuvent être génétiquement modifiés puis différenciées en progéniteurs trophoblaste pour les analyses de gain de fonction. Cette méthode in vitro de différenciation pour générer trophoblastes humains à partir de hPSCs surmonte les restrictions éthiques et juridiques de travailler avec des embryons humains précoces, et ce système peut être utilisé pour une variété d&#39;applications, y compris la découverte de médicaments et les cellules souches.

Vue d&#39;ensemble de différenciation in vitro de hPSCs Ce protocole de différenciation in vitro de cellules hES non différenciées commence cultivées sur MEFs qui sont passés à feeder libres conditions pour un passage (figure 1A). Alors que nous avons décrit la différenciation des CSEh dans ce protocole, nous avons utilisé ce protocole pour différencier avec succès hiPSCs dans les cellules troph...

Ici, nous présentons un protocole pour générer efficacement des cellules trophoblastiques humaines à partir de cellules souches pluripotentes humaines en utilisant la protéine morphogénique osseuse 4 et des inhibiteurs des voies Activin/Nodal. Cette méthode est adaptée à la différenciation efficace des cellules souches pluripotentes humaines et peut générer de grandes quantités de cellules pour la manipulation génétique.

In Vitro Différenciation des cellules souches pluripotentes humaines en cellules trophoblastiques

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

L'objectif général de ce protocole est de différencier des cellules souches pluripotentes humaines en cellules trophoblastiques humaines à l'aide du facteur morphogénétique osseux 4 et d'inhibiteurs des voies de signalisation activine et nodale, afin d'étudier les premiers événements de la formation et de la fonction placentaire humaine. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans l'étude des fonctions des cellules trophoblastiques et de la manière dont ces cellules se forment. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet d'obtenir une grande quantité de cellules trophoblastiques pour diverses applications, notamment en génétique, et autorise la réalisation de tests fonctionnels cellulaires.Pour commencer l'expérience, décongeler un aliquot de matrice extracellulaire sur de la glace pendant trois à quatre heures. À l’aide de pipettes préalablement refroidies, d’un tube conique froid de 50 millilitres et du milieu Dulbecco modifié, ou milieu DMEM F12, transférer deux milligrammes de matrice extracellulaire dans 24 millilitres de DMEM F12 glacé. Transférer immédiatement le tube conique de 50 millilitres sur de la glace et le conserver à quatre degrés Celsius.Pour rev&ecirc;tir les plaques de culture de tissus, ajouter un millilitre de matrice extracellulaire dilu&eacute;e par puits d'une plaque &agrave; six puits. Agiter doucement la plaque afin de recouvrir uniform&eacute;ment les puits, puis incuber la plaque &agrave; temp&eacute;rature ambiante pendant au moins une heure. Aspirer la matrice extracellulaire de la nouvelle plaque et ajouter le milieu conditionn&eacute; par des fibroblastes embryonnaires de souris ou MEFCM contenant du bFGF.Utilisez une pipette pour transférer les agrégats cellulaires prélevés depuis la plaque de MEF et les répartir dans la plaque revêtue de matrice extracellulaire. Incubez ensuite la plaque. Grattez les cellules différenciées avec une pipette Pasteur avant de remplacer quotidiennement le milieu MEFCM par du milieu contenant du bFGF, en utilisant deux millilitres de milieu par puits.Lorsque les colonies apparaissent grandes et brillantes au microscope, repiquez les cellules souches embryonnaires humaines toutes les six à sept jours. Lorsque les cellules en culture sans cellules nourricières sont prêtes à être repiquées, retirez le milieu et lavez les cellules en ajoutant un millilitre de PBS à l’aide d’une pipette. Aspirez le PBS et remplacez-le par 0,5 milligramme par millilitre de dispase préchauffée à l’aide d’une pipette.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après l'incubation, laver les cellules avec du PBS en ajoutant deux millilitres de PBS par puits et aspirer le PBS. Ajouter un millilitre de CM par puits et détacher manuellement les cellules en petits agrégats à l’aide de l’extrémité d’une pipette de cinq millilitres.Ensuite, ensemencez les agrégats cellulaires en suspension dans de nouvelles plaques revêtues de matrice extracellulaire. Préparez le milieu de différenciation. Utilisez le milieu CM sans bFGF et ajoutez des inhibiteurs frais juste avant utilisation.Utilisez des cellules souches embryonnaires humaines (hESC) cultivées sans cellules nourricières sur des plaques revêtues de matrice extracellulaire, passagées une fois dans un incubateur réglé à 5 % d'oxygène. Après le premier passage sur les plaques revêtues de matrice extracellulaire, laissez les cellules s'attacher pendant 24 heures. Le jour suivant, déclenchez la différenciation en éliminant le milieu de culture contenant le bFGF et en le remplaçant par du milieu de culture contenant BMP4/A/P, avec deux millilitres par puits dans une plaque à six puits.Poursuivez la culture des cellules en utilisant un niveau d'oxygène de 4 %. Remplacez tous les deux jours le milieu CM contenant BMP4/A/P en aspirant l'ancien milieu et en ajoutant du milieu frais contenant BMP4/A/P. Récupérez les cellules aux temps souhaités.Cultivez les cellules souches embryonnaires humaines pendant deux passages sur matrice extracellulaire après les avoir transférées des cellules MEF dans un milieu pour cellules souches embryonnaires humaines contenant du bFGF. Une forte confluence cellulaire est importante, divisez donc les cellules souches embryonnaires humaines en rapport un pour un sur une nouvelle plaque, ce qui garantira une confluence d'au moins 50 % le lendemain. Incubez les cellules toute la nuit dans un incubateur à faible teneur en oxygène.Le lendemain, remplacez le milieu par deux millilitres par puits de milieu de différenciation. Incubez les cellules toute la nuit dans un incubateur à faible teneur en oxygène. Avant la transfection, recouvrez un plat de gélatine en ajoutant 0,1 % de gélatine dans un plat.Agiter doucement la boîte pour recouvrir la plaque, puis laisser la plaque à température ambiante. Après 20 minutes, retirer la gélatine. Différencier les cellules jusqu'au point temporel souhaité.La veille de la transfection, trypsinez les cellules en utilisant de la trypsine à 0,05 % pendant cinq minutes. Ensemencez les cellules à la confluence souhaitée dans la plaque revêtue de gélatine. Ajoutez le milieu de culture contenant BMP4/A/P mais ne contenant pas de bFGF, puis incubez la culture toute la nuit.Le lendemain, ajoutez un milieu de différenciation frais aux cellules. Transfectez les ARNsi à l'aide d'un réactif de transfection d'ARNsi. Pour l'ADN plasmatique, utilisez un réactif lipofectamine approprié.Suivez le protocole du produit tel que décrit pour chaque réactif de transfection. Transférez les complexes d'ARNsi lipofectamine dans chaque puits ou plaque de cellules et mélangez délicatement. Incubez ensuite les cellules toute la nuit dans un incubateur à faible teneur en oxygène.Le lendemain, remplacez le milieu par du milieu de différenciation frais. Récoltez les cellules aux temps souhaités pour vérifier l'efficacité de la disruption génique à l'aide d'une RT-PCR quantitative. Enfin, pour récolter les cellules, ajoutez un millilitre de trypsine 0,05 % par puits et incubez les cellules.Ajoutez cinq millilitres de milieu MEF par puits pour neutraliser la trypsine. Centrifugez les cellules à 200 × g pendant cinq minutes et utilisez le culot cellulaire pour l'isolement de l'ARN. Grâce à cette technique, les changements morphologiques sont clairement observés.Les cellules du jour un de différenciation sont plus grandes que celles du jour zéro. Au fur et à mesure que la différenciation progresse, les cellules se divisent et s'étendent à partir du centre de la colonie, en croissant vers l'extérieur. Les colonies individuelles fusionnent d'ici le jour cinq de différenciation, les cellules se développant les unes sur les autres.L'analyse par RT-qPCR révèle que les niveaux d'expression relatifs du marqueur de pluripotence NANOG sont réduits de 75 % après un jour de différenciation lorsque les cellules sont cultivées avec la BMP4, et de 90 % en présence de BMP4/A/P. Au deuxième jour de différenciation, les niveaux de NANOG sont très faibles chez les cellules cultivées en présence de BMP4 seule ou de BMP4/A/P, comparés à ceux observés dans le milieu CM pour cellules souches embryonnaires humaines contenant le bFGF. Des transfections réalisées à l'aide d'un plasmide GFP introduit dans des cellules traitées par BMP4/A/P respectivement au premier et troisième jour de différenciation ont permis d'obtenir une efficacité de transfection comprise entre 30 et 50 %, 24 heures après la transfection.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de différencier les cellules pluripotentes humaines en cellules trophoblastiques in vitro et de la façon d'introduire des constructions d'ADN afin de manipuler l'expression des gènes.

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Dérivation de cellules souches de la souris Trophoblast à partir de blastocystes

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Le protocole actuel permet de récupérer des structures tubulaires formées dans l’essai classique d’angiogenèse-formation de tubes in vitro où les cellules, telles que les cellules trophoblastiques, s’organisent en structures capillaires sur une couche de matrice de membrane basale extracellulaire. Les structures récupérées sont utilisées pour l’isolement de l’ARN et des protéines pour diverses analyses biochimiques.

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Apprenez la différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en trophoblastes utilisant BMP4 et des inhibiteurs des voies Activin/Nodal. Cette méthode efficace permet d'étudier la formation placentaire et la biologie du développement.

In Vitro Différenciation des cellules souches pluripotentes humaines en cellules trophoblastiques

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