Name: Murine lymphocytaire par étiquetage 64 Cu-anticorps du récepteur de ciblage pour In Vivo Le trafic cellulaire par PET / CT (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Découvrez le marquage des lymphocytes murins par anticorps monoclonal radiomarqué au cuivre-64 pour le suivi in vivo par imagerie TEP/CT. Cette technique permet d'étudier la distribution cellulaire et les mécanismes thérapeutiques.

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Les auteurs remercient le Dr Julia Mannheim, Walter Ehrlichmann, Ramona Stumm, Funda Cay, Daniel Bukala, Maren Harant ainsi que Natalie Altmeyer pour le soutien lors de l&#39;analyse des expériences et des données. Ce travail a été soutenu par Werner Siemens-Fondation, la DFG par le SFB685 (projet B6) et FORTUNE (2309-0-0).

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<li>Muranski, P., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+immunotherapy+of+cancer+using+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive immunotherapy of cancer using CD4+ T cells.</a> Curr. Opin. Immunol. 21 (2), 200-208 (2009).</li>
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<li>Huang, J., Lee, C. C. I., Sutcliffe, J. L., Cherry, S. R., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiolabeling+Rhesus+Monkey+CD34%2B+Hematopoietic+and+Mesenchymal+Stem+Cells+with+64Cu-Pyruvaldehyde-Bis%28N4-Methylthiosemicarbazone%29+for+MicroPET+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Radiolabeling Rhesus Monkey CD34+ Hematopoietic and Mesenchymal Stem Cells with 64Cu-Pyruvaldehyde-Bis(N4-Methylthiosemicarbazone) for MicroPET Imaging.</a> Mol. Imaging. 7 (1), (2008).</li>
<li>Griessinger, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Tracking+of+Th1+Cells+by+PET+Reveals+Quantitative+and+Temporal+Distribution+and+Specific+Homing+in+Lymphatic+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">In Vivo Tracking of Th1 Cells by PET Reveals Quantitative and Temporal Distribution and Specific Homing in Lymphatic Tissue.</a> J Nucl Med. 55 (2), 301-307 (2014).</li>
<li>Griessinger, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((64Cu+antibody-targeting+of+the+T-cell+receptor+and+subsequent+internalization+enables+in+vivo+tracking+of+lymphocytes+by+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">64Cu antibody-targeting of the T-cell receptor and subsequent internalization enables in vivo tracking of lymphocytes by PET.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (4), 1161-1166 (2015).</li>
<li>McCarthy, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+of+high+specific+activity+64Cu+using+a+biomedical+cyclotron%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient production of high specific activity 64Cu using a biomedical cyclotron.</a> Nucl. Med. Biol. 24 (1), 35-43 (1997).</li>
<li>Kalkhof, S., Sinz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chances+and+pitfalls+of+chemical+cross-linking+with+amine-reactive+N-hydroxysuccinimide+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chances and pitfalls of chemical cross-linking with amine-reactive N-hydroxysuccinimide esters.</a> Anal. Bioanal. Chem. 392 (1), 305-312 (2008).</li>
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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Ce protocole présente une méthode fiable et facile à radiomarquer de manière stable des cellules pour le suivi in vivo par TEP. En utilisant cette méthode, les cellules Cova-TH1, isolé et élargi in vitro à partir de souris donneuses, pourrait être radiomarqués avec 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb et leur prise d&#39; origine a été suivi pour les ganglions pulmonaires et périthymique en tant que sites de présentation dans une Cova Cova induite par DTHR des voies aériennes aiguës. <p class="jove_con...

Le suivi des cellules non-invasive est un outil polyvalent pour surveiller la fonction cellulaire, la migration et homing in vivo. De récentes études de suivi de cellules se sont concentrées sur mésenchymateuses 1, 2 ou cellules souches dérivées de la moelle osseuse 3 dans le cadre de la médecine régénérative, les globules blancs périphériques autologues dans l&#39; inflammation ou des lymphocytes T dans des thérapies cellulaires adoptifs contre le cancer 3, 4. L&#39;élucidation des sites d&#39;action et les principes biologiques sous-jacents des thérapies à base de cellules est d&#39;une importance énorme. CD8 + lymphocytes T cytotoxiques, récepteur de l&#39; antigène chimère génétiquement modifiées (CAR) des cellules T ou des lymphocytes infiltrant les tumeurs (TIL) ont été largement considéré comme l&#39;étalon-or. Cependant, les cellules TH1 spécifiques de l&#39; antigène associé à la tumeur se sont révélés être une option de traitement alternative efficace 4, &lt;/ sup&gt; 5, 6, 7. Comme les principaux acteurs dans l&#39; inflammation, les maladies auto - immunes spécifiques d&#39;organes (par exemple, la polyarthrite rhumatoïde ou d&#39; asthme bronchique), et les cellules de grand intérêt pour l&#39; immunothérapie du cancer, il est important de caractériser les modes de distribution et de homing temporelles des cellules TH1. L&#39; imagerie in vivo non invasive par TEP présente une quantitative, une méthode très sensible 8 pour examiner les schémas de migration des cellules, dans la prise d&#39; origine in vivo, et les sites d&#39;action des lymphocytes T et des réponses au cours de l&#39; inflammation, les allergies, les infections ou le rejet de la tumeur 9, 10, 11. Cliniquement, 111 In-oxine est utilisé pour la scintigraphie des leucocytes pour la discrimination de l&#39; inflammation et de l&#39; infection 12, tandis que le 2-désoxy-2- (18F) fluoro-D-glucose (18 F-FDG) est couramment utilisé pour les études de suivi des cellules en PET 3, 13. Un inconvénient majeur de ce traceur PET, cependant, est la courte demi-vie du radionucléide 18 F à 109,7 min et la faible stabilité intracellulaire qui empêche l&#39; imagerie aux points de temps plus tard transfert post cellulaire adoptive. Pour plus long terme in vivo des études de suivi de cellules par PET, bien instable dans les cellules, 64 Cu-PTSM est fréquemment utilisé pour étiqueter de façon non spécifique des cellules 14, 15 avec des effets néfastes réduits au minimum sur la viabilité des cellules T et la fonction 16. Ce protocole décrit un procédé pour réduire davantage les effets désavantageux sur la viabilité cellulaire et la fonction à l&#39;aide d&#39;un récepteur de cellule T (TCR) de mAb radiomarquée spécifique de. Premièrement, la production du radio - isotope 64 Cu, la conjugaison du mAb avec KJ1-26 ee chélateur DOTA, et le 64 Cu-radiomarquage ultérieur sont présentés. Dans une deuxième étape, l&#39;isolement et l&#39; expansion de cellules Cova-TH1 de souris donneuses DO11.10 et le radiomarquage avec sont décrits en détail 64 mAb conjugué DOTA-Cu chargé KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26). L&#39;évaluation des valeurs absorption et l&#39; efflux de la radioactivité avec un calibrateur de dose et par y-comptage, respectivement, ainsi que l&#39;évaluation des effets de 64 Cu-radiomarquage sur la viabilité des cellules par exclusion au bleu trypan et de fonctionnalité avec ELISA de IFN-y sont présentés . Pour les non-invasive dans le suivi des cellules in vivo, le déclenchement d&#39;un modèle de souris de DTHR voies aériennes aiguë induite par Cova et l&#39; acquisition d&#39; image par PET / CT après le transfert cellulaire adoptive sont décrits. De plus, cette approche de l&#39;étiquetage peut être transférée à différents modèles de la maladie, les cellules T de souris avec différentes cellules ou RLT d&#39;intérêt général avec les récepteurs liés à la membrane ou l&#39;expression markers membrane continue qui sous - tend la navette 17.

<table><tbody><tr><td>HCl, Suprapur</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>1.00318</td><td>64Cu</td></tr><tr><td>production Méthanol, Suprapur</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>1.06007</td><td>64Cu</td></tr><tr><td>production Isopropanol, Suprapur</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>1.0104</td><td>64Cu production</td></tr><tr><td>Pt/Ir (90/10) plaque</td><td>&Ouml ; gussa</td><td>Custom made</td><td>64Cu production</td></tr><tr><td>Chambre PEEK</td><td>WKL</td><td>Custom made</td><td>64Cu production</td></tr><tr><td>64Ni</td><td>Chemotrade</td><td></td><td>64Cu</td></tr><tr><td>production Polygramme SIL G/UV 254 plaque</td><td>Macherey-Nagel</td><td>805021</td><td>64Cu</td></tr><tr><td>production Échange d’ions colonne</td><td>BioRad</td><td>AG1-X8</td><td>64Cu</td></tr><tr><td>production Système de cible à semi-conducteurs pour la production PETtrace</td><td>WKL</td><td>costum made</td><td>64Cu production</td></tr><tr><td>64Cu module de travail</td><td>WKL</td><td>costum made</td><td>64Cu</td></tr><tr><td>production Calibrateur de dose</td><td>Capintec</td><td>CRC-25R</td><td></td></tr><tr><td>PETtrace cyclotron</td><td>General Electric Medical Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOTA-NHS</td><td>Macrocycliques</td><td>B-280</td><td>Immuno-conjugaison DOTA</td></tr><tr><td>Anti-cOVA-TCR (KJ1-26)</td><td></td><td>Isolé de la culture cellulaire d’hybridome</td><td>Conjugaison DOTA</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71633</td><td>DOTA-conjugaison</td></tr><tr><td>H+ Chelex 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td> Unité de <td></td></tr><tr><td>filtration Amicon Ultra-15</td> à conjugaison DOTA <td>Merck Millipore</td><td>UFC910008</td><td>Conjugaison DOTA</td></tr><tr><td>Eau ultrapure Rotipuran</td><td>Carl</td><td>Roth HN68.3</td><td>Conjugaison DOTA</td></tr><tr><td>Acétate d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32301</td><td>Conjugaison DOTA</td></tr><tr><td>Université de</td><td>Tübingen</td><td></td><td>Conjugaison DOTA</td></tr><tr><td>Micro Bio-spin Colonne P-6</td><td>Laboratoires Bio-Rad</td><td>7326221</td><td>DOTA-conjugaison</td></tr><tr><td>Citrate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71497</td><td>DOTA-conjugaison</td></tr><tr><td>Cyclone Plus PhosphorImager&nbsp ;</td><td>Perkin-Elmer</td><td>L2250116</td> DMEM<td>, conjugaison DOTA,</td></tr><tr><td></td><td>Merck Millipore</td><td>102568</td><td>ingrédient pour le milieu des lymphocytes T.</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Merck Millipore</td><td>S0115/1004B</td><td>ingrédient pour milieu cellulaire T&nbsp ;</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Merck Millipore</td><td>L0473</td><td>ingrédient pour milieu de cellules T&nbsp ;</td></tr><tr><td>Acides aminés MEM</td><td>Merck Millipore</td><td>K0293</td><td>ingrédient pour milieu de cellules T&nbsp ;</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp ;</td><td>Merck Millipore</td><td>L 1613</td><td>ingrédient pour milieu de cellules T&nbsp ;</td></tr><tr><td>&nbsp ; Pénicilline/Streptomycine</td><td>Merck Millipore</td><td>A2212</td><td>ingrédient pour milieu cellulaire T&nbsp ;</td></tr><tr><td>0,05 mM 2-&beta ;-mercaptoéthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>ingrédient pour milieu de cellules T&nbsp ;</td></tr><tr><td>DO11.10</td><td></td><td>souris élevage maison</td><td>culture cellulaire TH1</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>TH1 culture cellulaire</td></tr><tr><td>Passoire 40 &micro ; m&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>TH1 culture cellulaire</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>TH1 culture cellulaire</td></tr><tr><td>CD4 Microbilles, souris</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-097-145</td><td>TH1 culture cellulaire Séparateur</td></tr><tr><td>QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-976</td><td>TH1 culture cellulaire</td></tr><tr><td>LS colonne</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td>TH1 culture cellulaire</td></tr><tr><td>anticorps anti-CD4 (Gk1.5)</td><td></td><td>Isolé à partir d’une culture cellulaire d’hybridome</td><td>Culture cellulaire TH1</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD8 (5367.2)</td><td></td><td>Isolé d’une culture cellulaire d’hybridome</td><td>Culture cellulaire TH1</td></tr><tr><td>Anticorps anti-rat (MAR18.5)</td><td></td><td>Isolé d’une culture cellulaire d’hybridome</td><td>Culture cellulaire TH1</td></tr><tr><td>Complément de lapin MA</td><td>tebu-Bio</td><td>CL3221</td><td>TH1 culture cellulaire</td></tr><tr><td>Anti-IL-4 anticorps (11B11)</td><td></td><td>Isolé à partir d’une culture cellulaire d’hybridome</td><td>Culture cellulaire TH1</td></tr><tr><td>cOVA 323-339-peptide&nbsp ;</td><td>Micro-collections CEM</td><td>Commande sur mesure</td><td>Culture cellulaire TH1</td></tr><tr><td>CPG1668-oligonucléotides</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td>Commande sur mesure</td><td>Culture cellulaire TH1 IL-2</td></tr><tr><td></td><td>Novartis</td><td>65483-116-07</td><td>Culture cellulaire TH1</td></tr><tr><td>Plaques à 96 puits</td><td>Greiner&nbsp ;</td><td>655180</td><td>TH1 culture cellulaire 24</td></tr><tr><td>plaques</td><td>Greiner&nbsp ;</td><td>662160</td><td>TH1</td></tr><tr><td>Fiole de culture cellulaire</td><td>Greiner&nbsp ;</td><td>660175</td><td>Plaques de culture cellulaire TH1</td></tr><tr><td>à 48 puits</td><td>Greiner&nbsp ;</td><td>677 180</td><td>étiquetage de cellules</td></tr><tr><td>Gammacell 1000</td><td>Best Theratronics</td><td>via enquête&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Gulmay RT225</td><td>Gulmay</td><td>via enquête&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Merck Millipore</td><td>L6323</td><td>in vitro évaluation</td></tr><tr><td>Souris IFN-&gamma ; ELISA</td><td>BD Biosciences</td><td>558258</td><td>in vitro évaluation</td></tr><tr><td>PE Annexine V Kit de détection de l’apoptose&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>559763</td><td>in vitro évaluation</td></tr><tr><td>Tube 5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>55.476</td><td>in vitro évaluation</td></tr><tr><td>Tubes à fond rond&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>352008</td><td>in vitro</td></tr><tr><td>évaluation Assistant &gamma ;-compteur</td><td>Perkin-Elmer</td><td>2480-0010</td><td>in vitro évaluation</td></tr><tr><td>ELISA Lecteur MultiscanEX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51118177</td><td>in vitro évaluation</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td>via enquête&nbsp ;</td><td>in vitro évaluation</td></tr><tr><td>BD LSRII&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>via enquête&nbsp ;</td><td>in vitroévaluation</td></tr><tr><td>souris BALB/c</td><td>Charles River</td><td>028</td><td>in vivo trafic cellulaire</td></tr><tr><td>Gel d’aluminium</td><td>Serva Électrophorèse</td><td>12261.01</td><td>in vivo trafic cellulaire</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer HealthCare</td><td>Commandé via Hôpital universitaire</td><td>in vivo trafic cellulaire</td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>Ratiopharm</td><td>Commandé via Hôpital universitaire</td><td>in vivo trafic cellulaire</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>CP-Pharma</td><td>Commandé via University hospital</td><td>in vivo trafic cellulaire</td></tr><tr><td>30 G aiguille</td><td>BD Biosciences</td><td>304000</td><td>in vivo trafic cellulaire</td></tr><tr><td>Seringue</td><td>BD Biosciences</td><td>11612491</td><td>in vivo Trafic cellulaire</td></tr><tr><td>Capillaires 10 &micro ; L</td><td>VWR</td><td>612-2439</td><td></td></tr><tr><td>Inveon PET scanner</td><td>Siemens Healthineers</td><td>n’est plus disponible</td><td>in vivo trafic cellulaire, sociétés alternatives : Bruker, Mediso&nbsp ;</td></tr><tr><td>Scanner Inveon SPECT/CT</td><td>Siemens Healthineers</td><td>n’est plus disponible</td><td>in vivo trafic cellulaire</td></tr><tr><td>Inveon Research Workplace</td><td>Siemens Healthineers</td><td></td><td>analyse d’images, logiciel alternatif : Pmod</td></tr></tbody></table>

murine lymphocytaire par étiquetage<sup&gt; 64</sup&gt; cu-anticorps du récepteur de ciblage pour<em&gt; in vivo</em&gt; le trafic cellulaire par pet / ct

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Ce protocole illustre la production de 64 Cu et la conjugaison chélateur / radiomarquage d&#39;un anticorps monoclonal (mAb) , suivie d&#39; une culture de cellules de lymphocytes murins et 64 récepteur Cu-anticorps ciblant des cellules. Dans l&#39; évaluation in vitro du radiomarqueur et non-invasive dans le suivi des cellules in vivo dans un modèle animal d&#39;une voie aérienne d&#39; hypersensibilité retardée réaction (DTHR) par PET / CT sont décrites. Dans le détail, la conjugaison d&#39;un anticorps monoclonal avec l&#39;agent chélatant acide 1,4,7,10-tétraazacyclododécane-1,4,7,10-tétraacétique (DOTA) est représenté. Suite à la production de 64 radioactif Cu, le radiomarquage de l&#39;anticorps monoclonal DOTA-conjugué est décrite. Ensuite, l&#39;expansion de l&#39; ovalbumine de poulet (COVA) CD4 + interféron spécifique de (IFN) -γ-production de cellules T auxiliaires (Cova-TH1) et la radiomarquage subséquente des cellules Cova-TH1 sont représentés. Diverses techniques in vitro sont présentées pour évaluer l&#39;effets de 64 Cu-radiomarquage sur les cellules, telles que la détermination de la viabilité des cellules par exclusion au bleu trypan, la coloration de l&#39; apoptose avec l&#39; Annexine V pour la cytométrie en flux, et l&#39;évaluation de la fonctionnalité par un dosage immuno-enzymatique IFN-γ (ELISA) . En outre, la détermination de l&#39;absorption radioactive dans les cellules et la stabilité de l&#39;étiquetage sont décrites en détail. Ce protocole décrit en outre comment effectuer des études de suivi de cellules dans un modèle animal pour une DTHR des voies respiratoires et, par conséquent, l&#39;induction de DHTR aiguë des voies aériennes induite par COVA dans des souris BALB / c est inclus. Enfin, un flux de travail TEP / CT robuste comprenant l&#39;acquisition d&#39;image, la reconstruction, et l&#39;analyse est présentée. Le 64 récepteur de Cu-anticorps approche de ciblage avec l&#39; internalisation du récepteur ultérieur fournit une spécificité élevée et la stabilité, réduit la toxicité cellulaire, et de faibles taux d&#39;efflux par rapport au PET traceurs communs pour le marquage cellulaire, par exemple 64 Cu-pyruvaldehyde bis (N4-méthylthiosemicarbazone) (64 Cu-PTSM). Enfin, notre approche permet non-invasive in vivo suivi des cellules en PET / CT avec un rapport optimal signal-sur-fond pendant 48 heures. Cette approche expérimentale peut être transférée à différents modèles animaux et types de cellules avec les récepteurs liés à la membrane qui sont internalisés.

La figure 1 résume le marquage des cellules Cova-TH1 avec le 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb et la conception expérimentale pour l&#39;in vitro et in vivo traitées dans ce protocole. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55270/55270fig1.jpg" /> Figure 1: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb étiquetage Process &amp; Experimental design. (A) Représentati...

Suite à la préparation d&#39;un 64 anticorps monoclonal Cu-modifié de liaison à un récepteur de cellule T murine transgénique, les cellules T sont radiomarqué in vivo, une analyse de la viabilité, la fonctionnalité, la stabilité du marquage et de l&#39; apoptose, et par transfert adoptif dans des souris avec une voie aérienne d&#39;hypersensibilité de type retardé réaction pour l&#39;imagerie non invasive par tomographie par émission de positons / tomodensitométrie (PET / CT).

Murine lymphocytaire par étiquetage<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-anticorps du récepteur de ciblage pour<em&gt; In Vivo</em&gt; Le trafic cellulaire par PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

L'objectif général de cette procédure est de marquer de façon stable des lymphocytes murins à l'aide d'un anticorps monoclonal radioactif modifié au cuivre afin de suivre in vivo la distribution temporelle et les schémas de migration des lymphocytes par TEP/TDM chez des modèles murins d'inflammation ou de cancer. Cette méthode peut aider à élucider les sites d'action ainsi que les principes biologiques fondamentaux clés des thérapies cellulaires, telles que les thérapies par cellules souches en médecine régénérative ou les immunothérapies anticancéreuses. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à permettre l'imagerie de la migration cellulaire sur une période de 48 heures, avec un contraste élevé et des effets néfastes minimes sur les cellules.Cette méthode peut être facilement transférée à tout type cellulaire d'intérêt possédant des récepteurs membranaires spécifiques et les anticorps monoclonaux correspondants. En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés avec la conjugaison de l'agent chélatant et les procédés de radiomarquage, ce qui entraîne une fraction immunoréactive plus faible et une activité cellule-spécifique réduite. Commencez par désinfecter une souris DO11.10 avec de l'éthanol à 70 %.Ensuite, fixez les membres avec du ruban adhésif et pratiquez une incision médiane le long de l'abdomen de l'animal. Écartez latéralement les deux bords de l'incision, séparez la peau du péritoine et repérez les ganglions lymphatiques cervicaux, axillaires, brachiaux et inguinaux. À l’aide de pinces contondantes, transférez les ganglions lymphatiques dans un récipient contenant du PBS avec 1 % de FCS.Ouvrir ensuite le péritoine, séparer la rate du pancréas et des tissus conjonctifs, puis conserver la rate avec les ganglions lymphatiques. Une fois tous les tissus collectés, transférer les échantillons sur un filtre de 40 microns dans un tube conique de 15 millilitres, et utiliser le piston d'une seringue pour macérer les tissus. Rincer ensuite le filtre avec 10 millilitres de FCS dans du PBS, et recueillir la suspension monocellulaire par centrifugation.Après lyse des globules rouges, resuspendre le culot de globules blancs dans du PBS frais additionné de FCS et de MicroBeads spécifiques du CD4, conformément aux instructions du fabricant. Après 20 minutes à quatre degrés Celsius, laver les cellules dans jusqu'à 50 millilitres de tampon PBS frais contenant du FCS, puis resuspendre les cellules dans le volume approprié de PBS avec FCS pour l'élution magnétique des populations cellulaires négatives pour le CD4. Appliquer les cellules sur une colonne de séparation magnétique, et recueillir l'écoulement direct dans un tube conique de 15 millilitres.À la fin de la séparation magnétique des cellules, utilisez le piston pour éjecter la population de cellules positives pour le CD4 dans un nouveau tube conique, puis ajustez la concentration de la suspension de lymphocytes T positifs pour le CD4 à un fois dix puissance six cellules par millilitre dans un milieu complet frais, pour un stockage à quatre degrés Celsius. Récupérez les cellules négatives pour le CD4 par centrifugation. Resuspendez le culot dans des anticorps monoclonaux anti-CD4, anti-CD8, souris anti-rat et du complément de lapin, puis incubez pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius.Après avoir récupéré les cellules par centrifugation, resuspendre le culot dans trois millilitres de milieu complet frais et irradier les cellules présentatrices d'antigène sélectionnées négativement à 30 gray. Ajuster la concentration des cellules présentatrices d'antigène à cinq fois dix puissance six cellules par millilitre dans du milieu complet frais, puis ajouter 100 microlitres de lymphocytes T CD4-positifs et 100 microlitres de cellules présentatrices d'antigène dans les puits expérimentaux appropriés d'une plaque 96 puits à fond plat. Ajouter ensuite les stimuli appropriés à chaque puit et transférer la plaque dans une étuve à culture cellulaire.Pour la radiomarquage des cellules TH1 spécifiques de l'ovalbumine de poulet, utilisez d'abord un calibrateur de dose pour prélever 37 mégabecquerels de l'anticorps radioactif spécifique des lymphocytes T d'intérêt dans une seringue sans volume mort. Ensuite, versez l'anticorps dans une cuve de réaction, puis mesurez et soustrayez la quantité restante de radioactivité dans la seringue de la quantité initialement prélevée. Ajoutez ensuite un millilitre de solution saline dans la cuve pour obtenir une solution à 37 mégabecquerels par millilitre.Ensuite, ajouter deux fois 106 cellules OVA-TH1 dans 0,5 millilitre de milieu complet dans chaque puits d'une plaque de 48 puits, suivi de 20 microlitres de la solution d'anticorps radiomarquée. Après 30 minutes dans un incubateur de culture cellulaire sécurisé contre les rayonnements, à 37 degrés Celsius et 7,5 % de dioxyde de carbone, rassembler les cellules radiomarquées dans un tube conique de 50 millilitres et effectuer deux lavages avec 10 millilitres de PBS à 37 degrés Celsius. Pour mesurer l'absorption et l'efflux de l'anticorps radiomarqué, transférer immédiatement après le deuxième lavage un million de cellules OVA-TH1 marquées par l'anticorps monoclonal dans un millilitre de milieu complet dans chacun de 10 tubes destinés au comptage gamma.Centrifuger les cellules pour former un culot, puis transférer les surnageants dans 10 nouveaux tubes de comptage gamma. Ensuite, laver les cellules avec un millilitre de milieu complet afin d'éliminer tout anticorps monoclonal marqué au radionucléide non lié, et transférer les surnageants dans 10 nouveaux tubes de comptage gamma. Puis ajouter un millilitre de milieu complet frais aux cellules, et mesurer les valeurs initiales d'incorporation à l'aide d'un compteur gamma.Pour l'imagerie TEP/TDM in vivo, immédiatement après le radiomarquage, ajuster la concentration des cellules OVA-TH1 à cinq fois 10 à la puissance sept cellules par millilitre dans du PBS, puis prélever 200 microlitres de cellules dans une seringue d'un millilitre équipée d'une aiguille de 30 gauge. Injecter les cellules par voie intrapéritonéale dans un animal malade présentant une réaction d' hypersensibilité de type retardé à l'ova, entre le quatrième et le cinquième mamelon. Ensuite, afin de faciliter la co-registration des images TEP et TDM durant l'analyse d'image, fixer des capillaires en verre contenant une solution d'anticorps radiomarquée sous le plateau d'accueil pour petit animal.Lorsque le niveau approprié de sédation est atteint, appliquez une pommade sur les yeux de l'animal et utilisez des cotons-tiges et du ruban chirurgical pour immobiliser la souris sur le plateau. Déplacez le plateau de la souris vers le scanner TEP et centrez le champ de vision en mettant l'accent sur les poumons afin d'acquérir une acquisition TEP statique de 20 minutes avec une fenêtre d'énergie comprise entre 350 et 650 kiloélectrons-volts. Transférez le plateau de la souris vers le scanner CT.À l'aide de la vue de repérage, centrer le champ de vision sur les poumons. Acquérir une image tomographique planaire par 360 projections au cours d'une rotation de 360 degrés en mode pas-à-pas, avec un temps d'exposition de 350 millisecondes et un facteur de binning de quatre. La dose radioactive appliquée de 0,7 mégabecquerels réduit la viabilité des cellules TH1 de seulement 8 %, tandis que des doses plus élevées montrent un effet encore plus marqué.Par rapport au marquage radioactif avec le cuivre-PTSM, aucun avantage significatif pour l'anticorps radiomarqué n'est observé. Les cellules TH1 marquées par un anticorps radioactif spécifique aux lymphocytes T ne présentent aucune perte de fonctionnalité, comme en témoigne la sécrétion d'interféron gamma, une efflux réduit de la radioactivité et une induction moindre de l'apoptose comparé aux cellules TH1 marquées au cuivre-PTSM. Ci-dessous, des images représentatives de tomographie par émission de positons (TEP) statiques à haute résolution et de tomodensitométrie (TDM) anatomique après transfert adoptif de cellules marquées par un anticorps monoclonal radiomarqué sont présentées, les images étant fusionnées en vue coronaire, axiale et sagittale à l'aide de capillaires en verre placés comme vient d'être démontré.Des volumes d’intérêt ont été délimités sur les ganglions lymphatiques pulmonaires et parathymiques sur les images TEP corrigées de la décroissance radioactive et normalisées afin de calculer le pourcentage de la dose injectée par centimètre cube. Le suivi de la migration des cellules OVA-TH1 vers les ganglions lymphatiques pulmonaires et parathymiques, sites de présentation de l’OVA lors d’une réaction d’hypersensibilité de type retardé au niveau des voies respiratoires, révèle que les signaux TEP in vivo provenant des cellules OVA-TH1 marquées par un anticorps monoclonal radiomarqué sont nettement plus élevés que les signaux provenant des cellules marquées au cuivre-PTSM. De plus, les valeurs d’incorporation des cellules OVA-TH1 étaient significativement augmentées chez les animaux atteints de réaction d’hypersensibilité de type retardé par rapport à leurs congénères témoins non traités.Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour étudier les rôles spécifiques et les sites d'action des cellules immunitaires dans des modèles animaux de maladies humaines. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que chaque type cellulaire peut réagir différemment aux radiations et d'ajuster en conséquence la quantité de radioactivité utilisée pour le marquage. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler et de cultiver des lymphocytes T spécifiques de l'antigène, de marquer ces cellules avec un anticorps radioactif, et d'imager leur distribution et leurs cinétiques de migration à l'aide de la TEP/TDM.N'oubliez pas que le travail avec des matières radioactives peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l'utilisation d'un blindage en plomb adéquat, la minimisation des durées d'exposition et l'augmentation au maximum de la distance par rapport à la source radioactive doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Dans cette vidéo, nous démontrons le radiomarquage intracellulaire des cellules T auxiliaires à l’aide d’anticorps monoclonaux conjugués aux isotopes radioactifs pour l’imagerie non invasive par tomographie par émission de positons.

Marquage des lymphocytes T auxiliaires murins à l’aide d’anticorps monoclonaux radiomarqués

Cette vidéo présente une technique impliquant un radio-immunoconjugué pour l’imagerie in vivo d’une tumeur dans un modèle murin. Lors de l’injection du radio-immunoconjugué, les anticorps du conjugué se lient à un antigène membranaire spécifique sur les cellules cancéreuses. Le radiotraceur du conjugué émet des positrons qui interagissent avec les électrons voisins pour produire de l’énergie, qui est détectée par un scanner de tomographie par émission de positons (TEP) pour créer une image de...

Une technique d’imagerie TEP in vivo pour détecter des tumeurs dans un modèle murin à l’aide d’anticorps radiomarqués

Nous décrivons un protocole général pour le suivi in vivo de cellules à l'aide de l'IRM dans un modèle de souris ex vivo avec des cellules marquées. Un protocole typique pour le marquage de cellules, le traitement d'acquisition d'image et la quantification est inclus.

In vivo 19 F IRM pour le suivi cellulaire

La cycloaddition de Diels-Alder bioorthogonale à demande d’électrons inverses a été exploitée pour créer une stratégie d’imagerie TEP préciblée efficace et modulaire pour le cancer. Dans ce protocole, les étapes de cette méthodologie sont décrites dans le contexte d’un système modèle utilisant l’anticorps ciblant le cancer colorectal huA33 et un radioligand marqué au Cu 64.

Exploiter la demande Bioorthogonal inverse Electron Diels-Alder Cycloaddition pour préalablement visées PET Imaging

Peptides dérivés d’origine virale, couplées à l’anticorps-conjugués (ACs) est une approche gagne du terrain en raison du risque de fournir des charges moléculaires avec accumulation de cellules de tumeur accrue. Utilisant des méthodes communes pour évaluer la conjugaison de peptide, AC et accumulation intracellulaire de charge utile et le ciblage de la tumeur, ce protocole permet aux chercheurs pendant les phases clés du développement initial.

Évaluation initiale des anticorps-conjugués modifié avec Peptides viraux dérivés pour accroître l’Accumulation cellulaire et améliorer le ciblage tumoral

Ce protocole décrit une méthode pour image résident-infiltration tumorale T CD8 cellules marquées avec des anticorps fluorescent couplés au sein de tranches de tumeur du poumon humain. Cette technique permet des analyses en temps réel de la migration des cellules T CD8 par microscopie confocale.

Ex Vivo Imagerie des Lymphocytes T CD8 résident dans des tumeurs du poumon humain tranches à l’aide de la microscopie confocale

Protocoles pour une évaluation quantitative de la chimiotaxie des lymphocytes et des migrations sont des outils importants pour la recherche de l’immunologie. Un protocole in vitro est décrit ici, que les permis en temps réel, multiplexés évaluation de la migration cellulaire, ainsi qu’un complémentaire en vivo technique propice suivi de cellules natives de rate.

Quantifier la chimiotaxie Monocyte humain In Vitro et lymphocytes murins traite In Vivo

Ici, nous montrons les méthodes in vivo la quantification d’évacuation de leucocytes de naïve, enflammée et peau murine maligne. Nous effectuons une comparaison entre deux modèles : transdermique FITC application et in situ photoconversion. En outre, nous démontrent l’utilité de photoconversion pour le suivi des sorties de leucocytes de tumeurs cutanées.

Quantification des leucocytes évacuation via les vaisseaux lymphatiques de peau Murine et tumeurs

Ce protocole décrit une technique pour imager différentes populations de cellules dans les ganglions lymphatiques drainants sans altérations dans la structure d'organe.

Visualisation de la structure des ganglions lymphatiques et de la localisation cellulaire à l'aide de la microscopie confocale ex-Vivo

Ce protocole décrit la méthodologie de suivi non invasif des lymphocytes T génétiquement modifiés pour exprimer les récepteurs d’antigènes chimériques in vivo avec une plate-forme cliniquement disponible.

Imagerie dynamique des lymphocytes T récepteurs de l’antigène chimérique avec [18F]Tomographie par émission de positons tétrafluoroborates/Tomodensitométrie

Cet article détaille la méthodologie de radiomarquage d’un anticorps monoclonal anti-CD19 spécifique à l’homme et comment l’utiliser pour quantifier les lymphocytes B dans le système nerveux central et les tissus périphériques d’un modèle murin de sclérose en plaques à l’aide d’approches d’imagerie TEP in vivo, de comptage gamma ex vivo et d’autoradiographie.

Imagerie des lymphocytes B CD19+ dans un modèle murin expérimental d’encéphalomyélite auto-immune à l’aide de la tomographie par émission de positons

Découvrez le marquage des lymphocytes murins par anticorps monoclonal radiomarqué au cuivre-64 pour le suivi in vivo par imagerie TEP/CT. Cette technique permet d'étudier la distribution cellulaire et les mécanismes thérapeutiques.

Murine lymphocytaire par étiquetage

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