Name: Développement de Metarhizium anisopliae En tant que myco-insecticide: de lisolement au rendement sur le terrain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: Découvrez le développement d'un mycoinsecticide efficace à partir de souches indigènes de Metarhizium anisopliae pour le contrôle biologique des ravageurs agricoles. Cette méthode offre une alternative durable aux pesticides synthétiques.

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Les auteurs reconnaissent la contribution des collaborateurs du programme de collaboration Indo-Suisse en biotechnologie (ISCB) du Département de la biotechnologie, de New Delhi et de la Direction du développement et de la coopération à Berne (Suisse). Les contributions des étudiants du projet et du personnel impliqués dans le développement du mycoinsecticide, y compris Vandana Ghormade, Pallavi Nahar, Priya Yadav, Shuklangi Kulkarni, Manisha Kapoor, Santosh Chavan, Ravindra Vidhate, Shamala Mane et Abhijeet Lande, sont reconnues. EKP et SGT remercient la Commission des subventions universitaires, l&#39;Inde et le Conseil de la recherche scientifique et industrielle (CSIR), en Inde, respectivement, pour les bourses de recherche. MVD reconnaît le soutien du Conseil de recherche industrielle et scientifique, New Delhi pour le Emeritus Scientist Scheme. Les auteurs sont reconnaissants au ministère de la Biotechnologie, à New Delhi, en Inde pour le soutien financier dans le cadre des programmes ISCB et SBIRI. Nous remercionsCritiques pour leurs contributions.

1. Isolation des champignons entomopathogènes <ol><li> Méthode de dilution du sol <ol><li> Recueillir les échantillons de sol et les insectes mycosés de différents champs de cultures ( tableau 1 ). Isoler les champignons entomopathogènes des échantillons de sols en utilisant la méthode de dilution du sol 8 . Note: Dans cette étude, des échantillons ont été prélevés sur les Pune (18 ° 31&#39;13&#39;&#39;N, 73 ° 51&#39;24&#39;&#39;E) et Buldhana (19 ° 58&#39;36&#39;&#39;N 76 ° 30&#39;30&#39;&#39;E ) Districts, Maharashtra, Inde. </li><li> Peser 10 g de chaque échantillon de sol et les ajouter séparément à 90 ml de Tween-80 stérile à 0,1% (p / v). </li><li> Mélanger soigneusement les échantillons en utilisant un agitateur magnétique pendant 60 minutes pour libérer les spores adhérant aux particules du sol. </li><li> Après mélange, étaler des aliquotes de 100 à 200 μL de chaque échantillon sur un milieu sélectif contenant (g / L): de la peptone, 10; Glucose, 20; Agar, 18; Streptomycine, 0,6; Tétracycline, 0,05; CycLohexamide, 0,05; Et la dodine, 0,1 ml; PH 7,0 9 . Incuber les plaques à 28 ° C pendant 3 à 7 jours. </li><li> Sélectionnez et sous-culturez les colonies sporulantes individuelles sur le même milieu pour obtenir des cultures pures. </li></ol></li><li> Des insectes mycosés <ol><li> Recueillez les insectes mycosés du champ. Note: Un corps larvaire difficile est susceptible d&#39;être infecté par un champignon entomopathogène. Avec une infection bactérienne ou virale, le corps d&#39;insecte mort est doux. </li><li> Recueillez des insectes vivants avec des comportements anormaux, une mauvaise coordination et des mouvements brusques. </li><li> Gardez les insectes jusqu&#39;à la mort, puis transférez-les dans des chambres humides pour plus de mycoses et de sporulation, le cas échéant, à 28 ° C et 70-80% HR. </li><li> Étaler les spores des cadavres sporulés sur le milieu sélectif susmentionné et obtenir des cultures pures en subissant davantage de sous-culture 2-3 fois sur le même milieu. </li></ol></li><li> Méthode d&#39;appât <ol><li> Dans unUn flacon (3,85 x 6,0 cm) contenant 60 g d&#39;échantillon de sol, ajouter 4 larves de pyrale ( Corcyra cephalonica ) et garder les flacons à 25 ± 2 ° C pendant une période de 14 jours. </li><li> Retournez tous les jours les flacons à l&#39;envers. Après 14 jours, filtrer les échantillons de sols pour la présence de larves de mites de riz mycosées. Isoler le champignon entomopathogène en étalant les spores des cadavres sporulés sur un milieu sélectif. </li><li> Après avoir obtenu des cultures pures, transférez les isolats à l&#39;agar de dextrose de pomme de terre (PDA) et incupez à 28 ° C et 70-80% d&#39;HR pendant 7 jours pour permettre la sporulation. Après la sporulation, maintenir les cultures de la mère à 8 ° C jusqu&#39;à l&#39;utilisation. </li></ol></li></ol> 2. Identification des champignons entomopathogènes <ol><li> Identifier les champignons entomopathogènes en observant les caractéristiques morphologiques ( c.-à-d. La taille et la forme asexué des spores et l&#39;agencement des spores sur les conidiophores); Isolats de 3 genres principaux, Metarhizium , Beauv<html> Eria et Nomuraea , peuvent être identifiés. </li><li> Pour l&#39;identification moléculaire des souches de Metarhizium , extraire l&#39;ADN génomique de la biomasse mycéliale en utilisant un kit d&#39;isolement d&#39;ADN; Suivez les instructions du fabricant (voir la table des matières ). Vérifier la qualité de l&#39;ADN génomique en réalisant une électrophorèse sur un gel d&#39;agarose à 0,8%. <ol><li> PCR-amplifier la région ARDNA ITS1-5.8S-ITS2 et 26S. Utilisez l&#39;ADN génomique en tant que modèle, avec les amorces ITS1 en avant (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) et ITS4 inverse (TCCTCCGCTTATTGATATGC) 10 . </li><li> Gel-elute et purifier les amplicons de taille attendue en utilisant un kit d&#39;extraction de gel; Suivez les instructions du fabricant (voir la table des matières ). Quantifier l&#39;amplicon purifié et la séquence. </li><li> Lisez et modifiez les séquences à l&#39;aide du logiciel et effectuez une recherche BLAST des séquences de nucléotides dans la bibliothèque de données NCBI GenBank pour analyser l&#39;homologie étroite= &quot;Xref&quot;&gt; 11. </li><li> Déposez les séquences d&#39;isolats entamopathogènes identifiés dans la base de données NCBI GenBank pour récupérer les numéros d&#39;accès. </li></ol></li></ol> 3. Criblage d&#39;isolats de Metarhizium contre H. armigera <ol><li> L&#39;élevage d&#39;insectes <ol><li> Établir la culture initiale de H. armigera en recueillant des larves saines et des pupes de l&#39;insecte du champ. </li><li> Pour l&#39;élevage, cultiver les larves individuellement dans des flacons de polypropylène stériles (3,85 x 6,0 cm, capacité de 50 ml) contenant des morceaux de okra désinfectés avec 0,5% (v / v) d&#39;hypochlorite de sodium pendant 10 min 12 . </li><li> Recueillir les œufs d&#39;insectes posés pendant l&#39;élevage et les stériliser avec un hypochlorite de sodium à 0,5% (v / v). </li><li> Maintenir les larves à 25 ± 2 ° C et 65 ± 5% HR. </li></ol></li><li> Bioessai d&#39;insectes Note: Pour l&#39;essai biologique des insectes, la production de spores,Et les études de performance sur le terrain, les premières sous-cultures de souches de Metarhizium provenant de larves mycosées de H. armigera ont été utilisées, sauf indication contraire. <ol><li> Pour les essais biologiques d&#39;insectes, utilisez des larves III-stade de H. armigera . </li><li> Trempez un ensemble de 30 larves en trois fois individuellement dans une suspension de spores de 10 mL d&#39;isolats de Metarhizium (1 x 10 7 spores / mL, sauf mention contraire, viabilité&gt; 90%) pendant 5 s. </li><li> Après traitement, transférez chaque larve individuellement dans un flacon stérile séparé pour éviter le cannibalisme. Dans chaque flacon, ajouter le papier filtre N ° 1 humide Whatmann et un morceau de okra désinfecté en tant qu&#39;alimentation. Changez le papier et passez les jours alternatifs. </li><li> Garder les larves à 25 ± 2 ° C, 65 ± 5% HR et 16: 8 lumière: sombre pendant 14 jours ou jusqu&#39;à leur mort. </li><li> Transférer les larves mortes dans des plaques de Petri stériles contenant des écouvillons de coton humides et les conserver à 28 ° C et 70-80% d&#39;HR pendant 3-7 jours pour permettre les mycéliums et les sporesFormation sur les cadavres. </li><li> Pour un contrôle, traiter un ensemble de 30 larves en triple avec 0,1% (p / v) de Tween-80 dans de l&#39;eau distillée stérile. </li><li> Effectuer toutes les expériences en trois exemplaires en utilisant des suspensions de spores fraîchement préparées. Collectez et regroupez les données sur le pourcentage de mortalité de trois expériences pour obtenir des valeurs moyennes. Calculer le pourcentage de mortalité corrigé en utilisant la formule 13 d&#39; Abbott. </li><li> Effectuez les expériences en utilisant une mise en page de conception de bloc complet aléatoire (RCBD), chaque traitement contenant un ensemble de 30 larves en trois exemplaires. Basé sur le pourcentage de mortalité contre H. armigera , sélectionnez les isolats de Metarhizium pour un nouveau dépistage du meilleur isolat pour la production commerciale. </li><li> Sélectionnez les isolats démontrant&gt; 90% de mortalité contre les larves de H. armigera III-instar. Note: Ici, 12 isolats ont été sélectionnés. </li><li> Déterminer le LT 50 de ces isolats et sélectionner le démon isoléClasser le meurtre le plus rapide (en moins de temps). Note: Ici, 5 isolats ont été choisis parmi les 12 isolats les plus puissants. </li><li> Déterminer les valeurs LC 50 des isolats sélectionnés en utilisant quatre concentrations différentes (c.-à-d. 1 × 10 3 , 1 × 10 5 , 1 × 10 7 et 1 × 10 9 spores / mL) de suspension de spores. </li><li> Déterminer la LC 50 des isolats de Metarhizium contre les larves de III-stade de H. armigera afin d&#39;augmenter la possibilité d&#39;identifier la différence de virulence des isolats avec des valeurs de mortalité élevées qui pourraient ne pas être détectés si une seule dose est utilisée. </li></ol></li></ol> 4. Production de spores d&#39;un isolat Metarhizium pour études sur le terrain <ol><li> Production de spores de Metarhizium par SSF <ol><li> Pour SSF, préparer l&#39;inoculum en ajoutant 2 x 10 7 spores des isolats Metarhizium à200 ml de YPG (0,3% d&#39;extrait de levure, 0,5% de peptone et 1,0% de glucose) de milieu. Incuber les flacons à 28 ° C avec agitation (180 tr / min) pendant 48 h. </li><li> Pour la production en masse de spores par SSF, utiliser le riz comme substrat, sauf indication contraire. </li><li> Pour SSF, remplissez les sacs en autoclave (type 14 avec un seul filtre microvente de 0,5 μm, 2 kg de capacité, 64 × 36 cm) avec 2 kg de riz. Ajouter 1 000 ml d&#39;eau distillée au riz dans les sacs et tremper durant la nuit 14 . Autoclavez les sacs avec le riz trempé à 121 ° C pendant 45 minutes 15 . </li><li> Inoculer les sacs avec un inoculum mycélien de 48 h (10% d&#39;inoculum, 200 mL pour 2 kg de riz) et incuber à 28 ° C et 70-80% d&#39;HR pendant 14 jours. </li><li> Récolter les spores par extraction liquide avec 0,1% de Tween-80. Pour cela, ajouter le contenu du sac à 0,1% de Tween-80 (3 L par 1 kg de riz), bien mélanger, séparer les spores du liquide par centrifugation et sécher à 37 ° C pendant 2 jours. &lt;<html> / Li&gt; <li> Alternativement, sécher les sachets contenant du riz avec les spores et des mycéliums à 37 ° C pendant 2 jours pour réduire la teneur en humidité (&lt;20%). Récoltez les spores à l&#39;aide d&#39;un myco-harvester ou vibro-sifter. </li></ol></li><li> Études de viabilité <ol><li> Déterminer le pourcentage de viabilité des spores récoltées en utilisant différentes méthodes 15 . Pour cela, préparer les suspensions de spores dans Tween-80 à 0,1% (p / v) et ajuster le nombre à 1 × 10 3 spores / mL. </li><li> Répartir les suspensions de spores (0,1 ml) sur des plaques de PDA en trois exemplaires et incuber à 28 ° C et 70 à 80% d&#39;HR pendant 72 h. </li><li> Comptez manuellement les colonies isolées et déterminez le nombre total viable de l&#39;échantillon respectif. </li></ol></li><li> Taux de sédimentation des spores <ol><li> Pour un dosage uniforme, la suspension homogène de spores est requise; Déterminer les taux de sédimentation des spores pour les isolats de Metarhizium comme décrit&quot;Xref&quot;&gt; 16. Vérifier les taux de sédimentation des spores dans du sulfate d&#39;ammonium 0,2 M et 0,1% de Tween-80. </li><li> Ajustez le nombre de la suspension de spores à ~ 7 × 10 7 spores / mL pour obtenir une absorbance initiale de 0,6 à 540 nm. Permettre aux cuvettes de rester intactes pendant 6 h pour les spores à régler. </li><li> Enregistrez l&#39;absorbance jusqu&#39;à 6 h. Exprimez le taux de sédimentation en pourcentage et calculez le temps requis pour une sédimentation à 50% (ST 50 ). Répétez l&#39;expérience trois fois en utilisant des suspensions de spores fraîchement préparées. </li></ol></li></ol> 5. Études de la performance sur le terrain de la capacité de l&#39;isolat de M. anisopliae sélectionné pour contrôler H. armigera dans les pigeons <ol><li> Formulation en poudre mouillable de M. anisopliae M 34412 spores <ol><li> Préparer la formulation en poudre mouillable de 2,5 à 5% en mélangeant les spores avec du talc. </li><li> Ajustez le compte final viable (TVC) à 1 x 10 12 spoRes par kg de formulation. </li></ol></li><li> Études de performance sur le terrain de M. anisopliae M 34412 spores <ol><li> Pour les études de performance sur le terrain de la capacité de l&#39;isolat de M. anisopliae sélectionné pour contrôler l&#39;infestation par H. armigera chez les pois choux, utilisez un RCBD avec quatre répétitions. Note: ici, interprété à Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth (MPKV), Rahuri (19.3927 ° N, 74.6488 ° E). </li><li> Utilisez deux formulations de pulvérisation différentes, une formulation d&#39;huile de spores (5 x 10 12 spores / 3 L de diesel: huile de tournesol, 7: 3) et une formulation aqueuse dans Tween-80 (0,1%). Pulvériser la formulation d&#39;huile avec un pulvérisateur ultra-faible volume (ULV) (70 min; 3 L / ha), la formulation aqueuse avec un pulvérisateur à sac à dos (5 x 10 12 spores, 500 L / ha). Note: Ici, les populations de larves ont été enregistrées un jour avant la pulvérisation et 3 et 7 jours après l&#39;application de chaque pulvérisation à 5 plantes sélectionnées au hasard. La population totale était tRansformé à la racine carrée de n + 1 pour l&#39;analyse statistique. <ol><li> Selon les pratiques agricoles pour la culture du pois pigeon, effectuez la première pulvérisation entre 10 et 15 jours après la ponte et 2 fois de plus avec un intervalle de 14 jours. Effectuer la pulvérisation entre 16:00 et 18:00 h IST. Surveillez la direction du vent et, si nécessaire, utilisez des rideaux en tissu pour éviter la dérive des spores sur les parcelles voisines. </li></ol></li><li> À titre de comparaison, pulvériser les insecticides chimiques avec un pulvérisateur rotatif à main. </li><li> Déterminer la persistance de l&#39;inoculum sur le terrain en recueillant les larves de H. armigera 0, 3, 5, 7 et 14 jours après la pulvérisation. </li><li> Gardez ces larves sous observation pendant une période de 14 jours et après la mort, transférez-les dans un flacon en plastique contenant du papier filtre humide. Incuber à 25 ± 2 ° C et 70 ± 10% HR pour observer la mycose. </li><li> Déterminer la persistance de l&#39;inoculum sur la population larvaire basée sur la p<html> Les données sur la mortalité des larves recueillies sur le terrain après la pulvérisation. </li><li> Évaluez les études sur le terrain en fonction du pourcentage d&#39;efficacité 17 , des dommages causés par les pod et du rendement en pourcentage 18 . Remarque: Ici, les données pour les paramètres, telles que la température, l&#39;humidité, la vitesse du vent (km / h), l&#39;ensoleillement (h), les précipitations (mm), les jours pluvieux et l&#39;évaporation (mm) ont été enregistrées lors d&#39;un essai à un Université agricole (Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth, Rahuri, 19.3927 ° N, 74.6488 ° E). </li></ol></li><li> Programme participatif des agriculteurs <ol><li> Sélectionnez le nombre d&#39;agriculteurs pour les essais de démonstration. Fournir les graines de pois chiches (BSMR - 736) ainsi que des engrais aux agriculteurs. Note: Dans cette étude, 20 agriculteurs ont été impliqués. Village: Deolali Pravara, (19.473 ° N 74.6 ° E). </li><li> Utilisez les mêmes formulations de pulvérisation et le nombre de sprays que dans l&#39;étape 5.2. </li></ol></li></ol>Tle &quot;&gt; 6. Effet sur les organismes non visés <ol><li> Observez l&#39;effet de la pulvérisation de mycoinsecticide, le cas échéant, sur les feuilles de pois de pigeon. </li><li> Recueillir les arthropodes résiduaires du sol et les insectes habités par les feuilles 1 jour après chaque traitement dans les parcelles non traitées et dans les parcelles traitées avec M. anisopliae . </li><li> Recueillir les arthropodes résiduaires du sol avec des pièges pièges dans les 24 h après le traitement et collecter les insectes habités par les feuilles avec un filet de balayage le matin suivant le traitement ( c.- à-d. 15 à 18 heures après le traitement). </li><li> Conservez-les individuellement dans des boîtes en plastique cylindriques de diamètre 3,5 cm et des hauteurs de 4,0 cm. Vérifiez quotidiennement les insectes et les nourrissez avec les aliments appropriés. </li><li> Notez la présence de M. anisopliae , si vous le souhaitez, et isolez le champignon. </li></ol> 7. Identification des paramètres de contrôle de la qualité <ol><li> Vérifier la viabilité des spores en mesurant la germination des spores sur PDA à 28 °; C. </li><li> Mesurez les activités de l&#39;enzyme de dégradation des cuticules, telles que la chitinase, la chitine désacétylase, la chitosanase, la protéase et la lipase, produites dans les milieux YPG et chitine, comme décrit précédemment 15 . </li><li> Déterminer le pourcentage de mortalité de H. armigera dans un essai biologique de laboratoire 15 . </li><li> Utiliser des marqueurs moléculaires, comme un modèle PCR-RFLP de Chitinases ( Chit 1 , 2 et 4 ) et des gènes de protease ( Pr1A ), comme attributs de virulence pour M. anisopliae . <ol><li> Extraire l&#39;ADN génomique de la biomasse du mycélium en utilisant un kit d&#39;isolement d&#39;ADN 15 . PCR-amplifier les fragments de gène Chit1 et Chit2 à l&#39;aide d&#39;ADN génomique en tant que modèle, avec les paires d&#39;amorces Chit1F / Chit1R (CTCTGCAGGCCACTCTCGGT / AGCCATCTGCTTCCTCATAT) et Chit2F / Chit2R (GACAAGCACCCGGAGCGC / GCCTTGCTTGACACATTGGTAA). Pour Chit4 , utilisez la paire d&#39;amorces Chit4F / Chit4R (ATCCGGAGAGCACGGCTAC / CTTGGATC CGTCCCAGTTG). </li><li> Pour l&#39;amplification du gène Pr1A, utilisez la paire d&#39;amorces METPR2 et METPR5 (AGGTAGGCAGCCAGACCGGC / TGCCACTATTGGCCGGCGCG). </li><li> Effectuer la digestion de restriction 19 du gène Chit1 avec BsaJI, BstUI et ScrFI; du gène Chit2 avec AluI, HpyCH4IV, et HpyCH4V et du gène Chit4 avec BstUI, HaeIII, et Mbol. Pour la digestion du gène PR1A, utilisez Rsa, Ddel et MspI 20. </li><li> Observer le modèle de polymorphisme de longueur de fragment de restriction (RFLP) sur 1,5% de gel d&#39;agarose par électrophorèse pour chaque gène pour la plupart des souches virulentes (&gt; 90% de mortalité); Cela peut être utilisé comme marqueur de virulence pour la sélection de M. anisopliae . </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

<html> Au cours des années 1880, la première tentative a été faite pour utiliser Metarhizium pour contrôler le scarabée, Anisoplia austriaca et le curculio de betterave à sucre, Cleonis punctiventris 21 . Dans ce protocole, l&#39;une des conditions préalables était d&#39;isoler une souche virulente, soit du sol, soit d&#39;insectes infectés. En effet, d&#39;autres paramètres, tels que LC 50 , LT 50 et ST 50 , ont contribué de manière sign...

<html> À partir de l&#39;introduction de pesticides organochlorés dans les années 40 en Inde, l&#39;utilisation de pesticides a augmenté de plusieurs fois 1 , les ravageurs de cultures coûtent toujours des milliards de roupies 2 par année en termes de perte de rendement dans la production agricole. L&#39;utilisation répandue et non judicieuse des pesticides synthétiques constitue une menace permanente pour l&#39;environnement et la santé humaine 1 . L&#39;utilisation indiscriminée de pesticides conduit à des résidus dans le sol et à l&#39;épuisement des prédateurs naturels de parasites. Il sert également de puissante pression de sélection pour modifier la composition génétique d&#39;une population de nuisibles, ce qui conduit au développement de la résistance 1 . Malgré les énormes avantages de la révolution verte, qui nécessitait des intrants élevés, comme les engrais et les pesticides, les ravageurs continuent d&#39;être une contrainte biologique majeure. Une estimation générale des pertes annuelles enregistrées en Inde et dans le monde est de 12 milliards USDEf&gt;&gt; 2 et USD 2,000 milliards 3 , respectivement. Lorsque les pesticides chimiques ont des effets néfastes lorsqu&#39;ils sont utilisés pour contrôler les insectes nuisibles, il devient impératif de rechercher d&#39;autres méthodes écologiquement rationnelles, fiables, économiques et durables. Le contrôle biologique offre une alternative appropriée et comprend l&#39;utilisation de parasites, de prédateurs et de pathogènes microbiens 4 . Les champignons, par exemple, sont connus pour infecter une large gamme d&#39;insectes nuisibles, y compris les lépidoptères, les hyménoptères, les coléoptères et les diptères, entraînant souvent des épizooties naturelles. En outre, contrairement à d&#39;autres agents de lutte contre les insectes bactériens et viraux, le mode d&#39;action des champignons pathogènes d&#39;insectes est par contact 5 . Ces champignons comprennent un groupe hétérogène de plus de 100 genres, avec environ 750 espèces signalées chez différents insectes. Les agents pathogènes fongiques importants sont: Metarhizium sp., Beauveria sP. Nomuraea rileyi , Lecanicillium lecanii et Hirsutella sp., Pour n&#39;en citer que 6 . M. anisopliae (Metchnikoff) Sorokin est le deuxième champignon entomopathogène le plus utilisé dans le contrôle biologique. Il est connu d&#39;attaquer plus de 200 espèces d&#39;insectes 7 . Dans cette étude, les différents stades impliqués dans le développement fondé sur le savoir d&#39;un mycopesticide utilisant M. anisopliae sont présentés. Cela comprend: 1) l&#39;identification d&#39;une source ( c&#39;est-à-dire des insectes moustiques ou du sol) pour les entomopathogènes virulents, 2) l&#39;identification et la sélection de l&#39;entomopathogène, 3) des stratégies pour maintenir leur nature et leur efficacité virulentes dans l&#39;essai biologique du laboratoire et sur le terrain 4 ) La formulation rentable des propagules infectieuses, 5) le développement de paramètres de contrôle de qualité uniques pour la préparation virulente, et 6) la bioprospection et l&#39;ajout de valeur.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Hi-Media</td><td>RM666</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>Sulfate d’ammonium&nbsp ;</td><td>Thomas Baker</td><td>11645</td><td>Analyseur</td></tr><tr><td>d’ADN</td> réactif<td>Biosystème appliqué</td><td>prisme ABI 3730&nbsp ; &nbsp ;</td><td>instrument</td></tr><tr><td>Kit d’isolement de l’ADN</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>Dodine</td><td>Sigma</td><td>45466</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>Kit d’extraction de gel</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Hi-Media</td><td>GRM077</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>Knapsac sparyer</td><td>Kaypee</td><td>HY-16L (1004)</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Hi-Media</td><td>RM006-500G</td><td></td></tr><tr><td>Réactif Flacons en polypropylène&nbsp ;</td><td>Laxbro</td><td>SV-50</td><td>Plasticware</td></tr><tr><td>Gélose à la pomme de terre au dextrose (PDA)&nbsp ;</td><td>Hi-Media</td><td>M096-500G</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>SRL</td><td>28940</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>Sparyer Ultra faible volume</td><td>Matabi</td><td>INSECDISK</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Unicorn-bags&nbsp ;</td><td>Licorne</td><td>UP-140024-SMB</td><td>Sac autoclavabe pour</td></tr><tr><td>extrait de levure</td> SSF <td>Hi-Media</td><td>RM027-500G</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>Chromas 2.1</td><td></td><td></td><td>logiciel</td></tr></tbody></table>

développement de<em&gt; metarhizium anisopliae</em&gt; en tant que myco-insecticide: de l&#39;isolement au rendement sur le terrain

Development of Metarhizium anisopliae as a Mycoinsecticide: From Isolation to Field Performance

Une préoccupation majeure lors du développement de mycoinsecticides commerciaux est la vitesse de destruction par rapport à celle des insecticides chimiques. Par conséquent, l&#39;isolement et le dépistage pour la sélection d&#39;un champignon entomopathogène hautement virulent à action rapide sont des étapes importantes. Les champignons entomopathogènes, tels que Metarhizium, Beauveria et Nomurea , qui agissent par contact, sont mieux adaptés que Bacillus thuringiensis ou le virus de la nucléopolisée (VAN), qui doit être ingéré par l&#39;insecte nuisible. Dans le présent travail, nous avons isolé 68 souches de Metarhizium d&#39;insectes infectés en utilisant une méthode de dilution et d&#39;appât du sol. Les isolats ont été identifiés par l&#39;amplification et le séquençage de la région d&#39;ADNr ITS1-5.8S-ITS2 et 26S. La souche la plus virulente de Metarhizium anisopliae a été sélectionnée en fonction de la concentration létale médiane (LC 50 ) et du temps (LT 50 ) obtenue dans des essais biologiques d&#39;insectes contre les larves III-stade de Helicoverpa armigera.La production en masse de spores par la souche sélectionnée a été effectuée avec une fermentation à l&#39;état solide (SSF) en utilisant le riz comme substrat pendant 14 jours. Les spores ont été extraites de la biomasse sporulée en utilisant 0,1% de tween-80 et différentes préparations de spores ont été préparées. Des essais sur le terrain des formulations pour le contrôle d&#39;une infestation par H. armigera chez des pois pigeons ont été réalisés selon la conception du bloc aléatoire. Les niveaux de contrôle d&#39;infestation obtenus avec des formulations huileuses et aqueuses (78,0% et 70,9%, respectivement) étaient meilleurs que les 63,4% obtenus avec un pesticide chimique.

Au cours des recherches, différentes souches de Metarhizium, Beauveria et Nomuraea ont été isolées par divers procédés d&#39;isolement (données non présentées) 6 , 14 Comme les souches de Metarhizium étaient plus efficaces pour contrôler H. armigera , un ravageur terrible dans les légumineuses 6 , 14 , D&#39;autres isolations ont été ciblées pour isoler les souches de ...

Ici, nous signalons les différentes étapes impliquées dans le développement fondé sur la connaissance d&#39;un mycoinsecticide efficace, y compris l&#39;isolement, l&#39;identification, le dépistage et la sélection du champignon entomopathogène &quot;meilleur ajustement&quot;, Metarhizium anisopliae , pour le contrôle des insectes nuisibles en agriculture .

Développement de<em&gt; Metarhizium anisopliae</em&gt; En tant que myco-insecticide: de l&#39;isolement au rendement sur le terrain

A major concern when developing commercial mycoinsecticides is the kill speed compared to that of chemical insecticides. Therefore, isolation and ...

L'utilisation non judicieuse des pesticides de synthèse constitue une menace continue pour l'environnement et la santé humaine. La lutte biologique à l'aide de bactéries, de virus et de champignons représente une alternative appropriée pour contrôler divers ravageurs insectes en agriculture. Contrairement aux bactéries et aux virus, les champignons entomopathogènes sont efficaces par contact.Metarhizium spp. est l'un des champignons pathogènes d'insectes les plus efficaces. Il est connu pour attaquer plus de 200 espèces d'insectes nuisibles. Nous avons mis au point un mycoinsecticide utilisant des spores d'isolats indigènes de Metarhizium.Ce vidéo vous montrera les protocoles d'isolement et d'identification d'isolats fongiques locaux, de bioessai sur insectes afin de sélectionner les souches les plus efficaces, de production de spores des souches sélectionnées de Metarhizium, ainsi que le protocole permettant d'élaborer une formulation économique de mycoinsecticide destinée aux applications sur le terrain. Les mesures de contrôle qualité à appliquer lors de la production commerciale seront également abordées. L'isolement des champignons entomopathogènes peut être réalisé selon trois méthodes.Tout d'abord, à partir des sols. Metarhizium est un champignon naturellement présent dans la plupart des sols. Pour obtenir une grande variété d'isolats, des échantillons de sol sont prélevés dans des champs cultivés avec différents types de cultures et provenant de régions géographiquement éloignées.L'échantillon de sol est prélevé à une profondeur de quatre à six pouces sous la surface. Les échantillons provenant du terrain sont recueillis dans des sachets étiquetés, puis, ultérieurement au laboratoire, 10 grammes de chaque échantillon sont transférés dans des vials. Metarhizium est isolé par la méthode de la plaque de dilution du sol.10 grammes de l'échantillon de sol sont transférés dans 90 ml de Tween 80 stérile à 0,1 %. La suspension est agitée avec un agitateur magnétique pendant 60 minutes. Pendant ce temps, des aliquotes de 900 microlitres de Tween 80 sont préparées pour des dilutions filiales.Le surnageant provenant de la suspension est maintenant dilué de façon sériée dans des aliquotes de Tween 80. Une aliquote de cent microlitres provenant de chaque échantillon est étalée sur le milieu décrit par Keller et autres. Les boîtes sont incubées à 28 degrés pendant trois à sept jours.Les colonies sporulées individuelles sont ultérieurement sous-cultivées sur le même milieu afin d'obtenir des cultures pures. Pour isoler un champignon pathogène pour les insectes, des insectes morts sont collectés sur le terrain. Les spores provenant des cadavres mycosés sont séparées en les transférant dans du Tween 80, puis en vortexant.La suspension de spores est ensuite étalée sur une boîte de Petri contenant de l'agar. Des cultures pures sont obtenues par des sous-cultures supplémentaires sur le même milieu. Pour isoler les champignons entomopathogènes présents dans le sol, on utilise des larves de malt de riz.Quatre larves de malt de riz sont ajoutées à un flacon contenant un échantillon de sol de 60 grammes. Les flacons sont incubés à 28 degrés. Ces larves pénètrent normalement en profondeur dans le sol ; par conséquent, les flacons sont retournés quotidiennement pendant jusqu'à 14 jours afin de faciliter le contact entre les larves et les spores fongiques présentes dans le sol.Les larves mortes sont retirées de temps en temps et conservées pour la sporulation dans un incubateur humide. Le processus d'isolement du champignon est identique à celui utilisé pour les cadavres d'insectes. Après obtention de cultures pures, les isolats sont maintenus sur des pentes de PDA, et les cultures mères sont conservées à huit degrés centigrades jusqu'à leur utilisation.Pour l'identification des champignons, l'ADN génomique est extrait de la biomasse mycélienne. Pour l'identification des isolats de Metarhizium, les amorces utilisées sont cinq prime, trois prime, ITS1 et ITS4. Les amplicons de taille attendue sont extraits sur gel, quantifiés et séquencés.Les séquences ont ensuite été vérifiées à l’aide de la base de données NCBI GenBank afin d’identifier les isolats au niveau des espèces. Des échantillons de sol et des insectes morts collectés dans les districts de Pune et de Buldana, dans le Maharashtra, en Inde, ont permis d’obtenir 68 isolats distincts de Metarhizium. Parmi ceux-ci, 58 ont été isolés à partir des sols et 10 à partir d’insectes.55 étaient Metarhizium anisopliae, huit étaient Metarhizium flavoviridae et cinq, Metarhizium robertsii. Les spores provenant des pentes sont ajoutées à 10 ml de Tween 80 et vortexées. Pour le bioessai sur insectes, le nombre de spores est mesuré à l’aide d’un hématimètre.Et la concentration est ajustée à 10 élevés à la puissance sept spores par ml. Un ensemble de 30 larves, en triplicata, est trempé individuellement dans une suspension de 10 ml de spores de chaque isolat de Metarhizium pendant cinq secondes. Des larves de deuxième stade tardif ou de troisième stade précoce de Helicoverpa armigera sont utilisées pour les bioessais sur insectes.Après le traitement, chaque larve est transférée dans un tube stérile contenant du papier filtre Whatman numéro un humidifié et un morceau d'okra désinfecté en guise de nourriture. Un groupe de 30 larves, en triplicat, traité avec 0,1 % de Tween 80 dans de l'eau distillée stérile sert de témoin. Les larves sont maintenues jusqu'à leur mort et observées pendant un maximum de 14 jours.Ces étapes ont été répétées pour les 68 isolats. Le pourcentage de mortalité est calculé en comptant les larves mortes et vivantes. Les larves mortes sont transférées dans des boîtes de Petri stériles, contenant surtout des cotons-tiges, puis conservées à 28 degrés Celsius et à une humidité relative de 70 à 80 % pendant trois à sept jours afin d'observer la mycose et la sporulation.Les données sur le pourcentage de mortalité issues de trois expériences sont regroupées afin d'obtenir des valeurs moyennes, puis corrigées à l'aide de la formule d'Abbott. Douze isolats de Metarhizium ayant montré une mortalité supérieure à 90 % ont été sélectionnés pour déterminer le temps létal médian contre les larves de troisième stade de Helicoverpa armigera. Sur la base des valeurs de LT50, cinq isolats plus rapides dans la destruction des insectes ont été identifiés.Les concentrations létales médianes pour les cinq isolats identifiés ont été déterminées à l'aide de quatre concentrations différentes de suspension de spores. Sur la base des valeurs de CL50, trois isolats de Metarhizium ont été sélectionnés pour la production de spores par fermentation à l'état solide. Le milieu YPD est préparé et stérilisé par autoclavage à 121 degrés Celsius pendant 20 minutes.Les spores provenant des pentes sont transférées dans du Tween 80 à 0,1 %. Les suspensions de spores des trois isolats de Metarhizium sélectionnés sont ajoutées au milieu YPD. Les flacons sont ensuite incubés sous agitation.Des sachets Unicorn stérilisables remplis de deux kilogrammes de riz sont trempés toute une nuit dans un litre d'eau distillée, puis stérilisés à l'autoclave à 121 degrés Celsius pendant 45 minutes. La fermentation à l'état solide a été testée sur des substrats tels que le riz, le sorgho, le maïs et le blé. Parmi les substrats testés, le riz a permis la sporulation maximale des isolats de Metarhizium.Les sacs sont inoculés avec une biomasse mycélienne de 10 % âgée de 48 heures. Ce mélange est bien homogénéisé et incubé pendant 14 jours. Les spores peuvent être récoltées selon différentes méthodes.Pour l'isolement à l'aide du Mycoharvester et du Vibrosifter, les sachets contenant le mycélium sporulé sont séchés à 37 degrés Celsius pendant deux jours afin de réduire la teneur en humidité à moins de 20 %. L'extraction liquide est une méthode plus efficace. Le riz contenant les spores est placé dans de grands récipients. Du Tween 80 à 0,1 % est versé dans les récipients, puis le mélange est bien agité.Le surnageant est filtré pour éliminer toute particule de riz. Les spores sont concentrées et séparées par centrifugation. Les spores sont ensuite séchées à 37 degrés Celsius pendant deux jours.Ces spores peuvent être conservées à moins 80 degrés Celsius jusqu'à leur utilisation. Pour augmenter la durée de conservation pendant le stockage, du talc est ajouté et mélangé aux spores. Pour être efficaces, les spores doivent être viables ; il est donc nécessaire d'identifier l'isolat qui produit le nombre maximal de spores viables.Les suspensions de spores sont préparées dans du Tween 80 à 0,1 % et la concentration est ajustée à 10 élevés à la puissance sept spores par ml. Une suspension de 10 microlitres est répartie sur des lames de PDA en triplicat, puis incubée. Dans les 12 heures, les spores viables commencent à germer.Après 12 heures, les spores formant des tubes germinatifs sont comptées au microscope. L'hydrophilie des spores est importante pour que le champignon adhère au cuticule des insectes. Une suspension de spores dans du sulfate d'ammonium et du Tween 80 est prélevée dans une cuvette.L'autre, sans les spores, sert de témoin. La concentration de la suspension de spores est ajustée à environ sept à dix puissance sept spores par ml afin d'obtenir une absorbance initiale de 0,6 à 540 nanomètres. Les cuvettes sont laissées au repos pendant environ six heures pour permettre la sédimentation des spores.L'absorbance est enregistrée et le temps nécessaire pour 50 % d'alimentation est calculé. Sur la base des résultats, une souche a été sélectionnée pour des applications sur le terrain. Les deux autres ont servi de souches de secours.La performance sur le terrain des spores de l'isolat sélectionné de Metarhizium M34412 pour contrôler l'infestation de Helicoverpa armigera sur la culture de pois d'Inde a été évaluée selon un dispositif en blocs aléatoires avec quatre répétitions. Deux formulations différentes de pulvérisation sont utilisées. La formulation dans du Tween 80 à 0,1 % est pulvérisée à l'aide d'un pulvérisateur dorsal.Une formulation huileuse de spores est pulvérisée à l'aide d'un pulvérisateur à très faible volume. La pulvérisation est effectuée soit le matin, soit le soir. La première pulvérisation est réalisée pendant la phase de floraison et est répétée deux fois supplémentaires à un intervalle de 14 jours.Des Helicoverpa armigera sont collectés aux jours zéro, trois, cinq, sept et quatorze après le traitement et conservées dans une chambre d'humidité pour induire la mycose. Lors des essais sur le terrain visant à contrôler Helicoverpa armigera sur le pois d'Inde, une efficacité supérieure à 70 % a été obtenue avec Metarhizium anisopliae M34412. Les dégâts aux gousses dans les parcelles traitées avec Metarhizium anisopliae se sont révélés être les plus faibles par rapport aux parcelles traitées avec des pesticides chimiques et aux parcelles témoins non traitées.Les feuilles de pois d'Angole sont examinées afin de détecter tout effet dû à la formulation du mycoinsecticide à base d'huile de tournesol et de gasoil. Les arthropodes du sol et les insectes vivant sur les feuilles ont été collectés dans les parcelles traitées avec Metarhizium anisopliae. Aucun effet nocif n'a été observé sur les arthropodes non ciblés.Les essais de démonstration ont été menés dans un village, doo-lally-pra-va-da, avec la participation de 20 agriculteurs. La formulation est efficace contre d'autres ravageurs insectes tels que la noctuelle grasse, la pyrale maculée des gousses, les cochenilles farineuses, les pucerons laineux et les moustiques. Les expériences ont permis d'identifier les paramètres essentiels de contrôle de qualité dans la production de mycoinsecticides.La viabilité des spores, mesurée par le taux de germination, doit être supérieure à 90 % sur milieu PDA après 16 heures à 28 degrés Celsius et à une humidité relative de 70 à 80 %. La mortalité de Helicoverpa armigera doit être supérieure à 90 % avec 107 spores dans un bioessai en laboratoire. Lors de sous-cultivages répétés sur un milieu artificiel en laboratoire, l'organisme perd sa virulence.Après avoir cultivé le champignon dans un milieu contenant de la chitine pendant 72 heures, les activités des enzymes dégradant la cuticule, telles que la chitinase, la chitine désacétylase, la chitosanase, la protéase et la lipase, sont mesurées. Ces activités servent de marqueurs biochimiques de la virulence. Quatre jeux différents de trois enzymes de restriction ont été utilisés pour la digestion des gènes de chitinase.Les isolats présentant une mortalité supérieure à 90 % ont montré le profil spécifique pour les trois gènes. Ces profils présentent une corrélation significative avec les profils d'enzymes dégradant la cuticule produits de manière extracellulaire par les isolats de Metarhizium. Pour la première fois, nous proposons l'activité de l'enzyme chitinase et le profil PCR du gène de la chitinase comme marqueurs de virulence.Cela peut servir d'indicateurs de qualité pour une production à l'échelle commerciale. Pour rendre le produit plus rentable, nous pouvons utiliser la promotion de la racine de la plante par la biomasse du mycélium. Il peut également être utilisé pour l'isolement de la chitosanase à des fins d'application en santé.Ces produits à valeur ajoutée rendront ce mycoinsecticide à base de Metarhizium plus rentable.

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