Analyses Cell Lineage et des études de fonction de gènes à l'aide Twin-tache marcm
2 mars 2017
Ici, nous présentons un protocole pour une technique de marquage mosaïque qui permet la visualisation des neurones dérivées d'une cellule progénitrice commune en deux couleurs distinctes. Ceci facilite l'analyse de la lignée neuronale avec la capacité des neurones individuels naissance à jour et de la fonction du gène à étudier dans les mêmes neurones de différents individus.
L’objectif global de ce protocole MARCM à deux points est d’effectuer des analyses de lignage cellulaire à haute résolution et de meilleures études de la fonction des gènes. Le tissu cérébral est composé d’un grand nombre de neurones différents, il est difficile d’étudier le mécanisme sous-jacent à la façon dont les neurones s’assemblent au cours du développement. Le principal avantage de cette technique est d’étiqueter les neurones dérivés de progéniteurs de neurones communs en deux couleurs distinctes.
Qui permettent de récupérer la naissance de l’information des neurones individuels. Par conséquent, cette technique peut aider les chercheurs à explorer le mécanisme cellulaire et moléculaire sous-jacent au développement neuronal. La démonstration de la procédure d’aujourd’hui sera Pei-Chi Chung.
Un technicien du laboratoire du professeur Yu. Commencez par combiner des mâles et des femelles prêts à deux points MARCM dans un flacon de nourriture pour mouches avec de la levure fraîche dans le flacon. Maintenez les mouches MARCM croisées à 25 degrés Celsius pendant deux jours pour augmenter les chances d’accouplement avant de collecter les œufs fécondés.
Pour éviter l’encombrement lors de l’éclosion des larves, tapotez les mouches prêtes MARCM croisées à deux points et transférez-les dans des flacons fraîchement levés. Cultivez la progéniture à deux points de MARCM, jusqu’à ce qu’elle atteigne le stade de développement souhaité. Ici, les mouches au stade larvaire seront choquées par la chaleur pour induire l’expression de la flippase.
Transférez les flacons de mouches dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 10, 20, 30, 40 et 50 minutes pour déterminer le choc thermique optimal pour l’expression de la flippase. Générer les clones MARCM à deux points d’intérêt. Le moment du choc thermique détermine l’étape de génération des dégagements, tandis que la période de choc thermique définit le nombre de dégagements qui seront générés.
Cultivez les animaux MARCM à deux points choqués par la chaleur à 25 degrés Celsius, jusqu’au stade de développement souhaité. Procédez ensuite à la coloration et au montage. Ajoutez du PBS dans les boîtes de protection des pinces.
Et ensuite, transférez les animaux MARCM à deux points dans les plats. Tout en regardant à travers un microscope de dissection, utilisez des pinces pour disséquer le cerveau des animaux MARCM à deux points. Tout d’abord, retirez la tête du corps de la mouche.
Ensuite, retirez doucement la cuticule sans endommager le cerveau. Ensuite, retirez soigneusement les trachées qui apparaissent comme des fibres de couleur blanche. Transférez les cerveaux dans une plaque de verre, contenant 4 % de formaldéhyde et de PBS.
Et fixez à température ambiante pendant 20 minutes. Commencez la procédure de coloration en rinçant la cervelle des mouches trois fois avec 1 % de PBT. Et puis laver avec 1 % de PBT trois fois.
En secouant pendant 30 minutes à chaque fois. Incuber le cerveau des mouches avec un mélange d’anticorps primaires pendant la nuit à quatre degrés Celsius ou pendant quatre heures à température ambiante. Rincez et lavez la cervelle des mouches trois fois chacune avec 1 % de PBT, en secouant comme précédemment.
Ensuite, incubez les cerveaux de mouches avec un mélange d’anticorps secondaires pendant quatre heures à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Après avoir rincé et lavé les cerveaux comme précédemment, montez les cerveaux sur une microlame avec un réactif anti-trempe. Et puis placez un verre de couverture pour couvrir et protéger la cervelle des mouches.
Scellez les bords du verre de protection et du microslide à l’aide d’un vernis à ongles transparent. Enfin, capturez des images fluorescentes de clones MARCM à deux points à partir des échantillons à l’aide du système de microscopie confocale de votre choix. Cette figure montre les résultats du clone MARCM à deux points, un neurone de projection olfactive antéro-dorsal VL2p dérivé de l’induction de la flippase.
Pour médier la recombinaison mytotique dans le blaste neurophonique adPN au stade embryonnaire. Ce premier schéma montre le schéma de neurogenèse. Dans cette image au microscope confocal du cerveau, les adPN VL2p sont représentés en vert et sont associés aux adPN multicellulaires neuroblastiques en magenta.
Cette image montre les cellules de la corne latérale. La morphologie neuronale du lobe antennaire est observée ici. Cette image montre les données des adPN DL1.
Comme on le voit ici, les adPN DL1 apparaissent plus tard dans le développement que les adPN VL2p. L’induction de clones MARCM à deux points de DC3 adPN démontre que ce type neuronal apparaît plus tard dans le développement. Cette image montre que l’événement MARCM à deux points se produit dans un neurone négatif GAL4 au sein de la lignée adPN.
Une fois maîtrisée, cette technique peut aider les chercheurs à analyser la lignée neuronale et à fournir différents marqueurs pour distinguer les neurones du clone de neuroblaste. De plus, le MARCM à deux points peut produire des clones mutants homozygotes pour explorer les mécanismes moléculaires. Dans un patrimoine génétique hétérozygote.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cet article présente un protocole MARCM à deux marques conçu pour des analyses de lignage cellulaire à haute résolution et des études de fonction génique dans les neurones. En marquant les neurones issus de cellules progénitrices communes avec deux couleurs distinctes, les chercheurs peuvent suivre efficacement le développement et la datation de naissance de neurones individuels.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Biologie du développement
Contexte
- Le tissu cérébral est composé d'une grande variété de neurones.
- La compréhension de l'assemblage des neurones pendant le développement est complexe.
- Les techniques actuelles peuvent ne pas offrir une résolution suffisante pour le traçage de lignage.
- Ce protocole vise à relever ces défis.
Objectif de l'étude
- Effectuer des analyses détaillées des lignées cellulaires.
- Améliorer les études sur la fonction des gènes dans les neurones.
- Faciliter l'exploration des mécanismes cellulaires et moléculaires du développement neural.
Méthodes utilisées
- Protocole Twin-spot MARCM pour l'étiquetage des neurones.
- Utilisation de marqueurs colorés distincts pour le traçage des lignées.
- Techniques d'imagerie haute résolution.
- Analyse du développement neuronal et de la fonction des gènes.
Résultats principaux
- Marquage réussi des neurones issus de progéniteurs communs.
- Capacité à récupérer les informations sur la date de naissance de neurones individuels.
- Compréhension améliorée de la lignée neuronale et du développement.
- Applications potentielles dans l'étude de la fonction des gènes chez différents individus.
Conclusions
- Le protocole twin-spot MARCM est un outil précieux pour la recherche en neurosciences.
- Il permet une analyse détaillée de la lignée neuronale et de la fonction des gènes.
- Cette technique peut faire progresser de manière significative notre compréhension du développement neural.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La compréhension de la lignée neuronale et de la fonction des gènes chez les organismes modèles fournit des connaissances fondamentales pour la validation ciblée en développement de neurothérapeutiques. La technique twin-spot MARCM permet une cartographie à haute résolution de l'ordre de naissance des neurones et une analyse phénotypique de neurones génétiquement identiques entre individus, contribuant ainsi à l'atténuation mécanistique des risques en phase initiale de découverte. Cette approche renforce la fiabilité prédictive en reliant les mécanismes développementaux aux résultats fonctionnels dans des systèmes pertinents pour la maladie.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en traçant la lignée neuronale à partir de progéniteurs communs afin d'évaluer la fonction des gènes dans des populations cellulaires définies.
- Valeur opérationnelle : Facilite la détection biologique des risques grâce à l'analyse phénotypique de clones mutants homozygotes dans des lignées hétérozygotes, réduisant ainsi l'ambiguïté mécanistique.
- Valeur prédictive : Soutient le tri du portefeuille en fournissant des données quantitatives sur la lignée qui corrélaient avec les mécanismes des maladies neurodéveloppementales.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Produit des systèmes neuronaux validés, codés par couleur, adaptés au criblage de composés dans des circuits neuronaux pertinents pour la maladie.
- Valeur opérationnelle : Assure la standardisation et la reproductibilité des tests grâce à une génération clonale inductible et spécifique à chaque stade, contrôlée par la durée du choc thermique.
- Extensibilité : Permet la réutilisation de la plateforme pour plusieurs sous-types neuronaux (par exemple, lignées adPN) afin de réaliser des criblages phénotypiques comparatifs.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur translationnelle : Permet la modélisation de systèmes pertinents pour la maladie en facilitant l'analyse de l'ordre de naissance des neurones impliqués dans les troubles du développement neurologique.
- Réduction des risques mécanistiques : Autorise l'analyse phénotypique de neurones identiques chez différents animaux afin de distinguer la variabilité génétique de la variabilité stochastique dans les études de fonction génique.
- Continuité préclinique : Assure un lien entre découverte et validation en fournissant des données résolues au niveau de la lignée pour les études d'engagement ciblé et de modulation des voies biologiques.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode twin-spot MARCM s'intègre dans le continuum de découverte, depuis la validation précoce de cibles jusqu'aux études mécanistiques précliniques, en particulier pour les indications neurodéveloppementales où l'origine neuronale et les connexions sont critiques.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies en associant la perturbation génique à des phénotypes neuronaux spécifiques aux lignées.
- Écrans : Fournit des préparations neuronales prêtes à l'essai et reproductibles, avec des résultats quantitatifs fondés sur le moment clonal de naissance et l'expression de marqueurs.
- Analytique : Permet une analyse comparative de la morphologie neuronale et de l'expression génique au cours des stades de développement à l'aide de lectures bicolores.
- Recherche translationnelle : S'intègre à la validation préclinique en fournissant des modèles alignés sur les lignées pour la modulation ciblée alignée sur les biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Fonctionne comme une capacité réutilisable pour générer des cohortes neuronales standardisées à travers différents projets et systèmes modèles.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant les biais liés à la lignée dans les études sur la fonction des gènes.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation grâce à une induction clonale contrôlée et à des protocoles standardisés de coloration et de montage.
- Valeur stratégique : Permet de mieux décider de poursuivre ou non un projet en permettant la détection précoce d'effets phénotypiques spécifiques à une lignée, réduisant ainsi les risques biologiques en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Favorise l'avancement ajusté au risque en apportant une clarté mécanistique sur les cibles neuronales dans les tissus hétérogènes.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en génétique de Drosophila, en techniques d'étiquetage clonal et en microscopie confocale pour une interprétation précise des lignées cellulaires.
- Dépend d'instruments tels que l'appareil de choc thermique, les microscopes de dissection et les systèmes d'imagerie confocale pour l'induction et la visualisation des clones.
- Exige une standardisation inter-équipes du moment du choc thermique, des protocoles de coloration et des paramètres d'imagerie afin d'assurer la cohérence des clones entre différents utilisateurs.
- Implique des adaptations à envisager lors de l'application de la méthode à d'autres lignées neuronales ou à des stades de développement différents de celui du modèle adPN présenté.
- Comprend des limites pratiques telles que la dépendance de l'efficacité clonale à la durée du choc thermique et la nécessité d'une optimisation spécifique à chaque lignée ciblée, comme indiqué dans le protocole.
