Name: Mesure de cellules T alloréactivité basés sur limagerie cytométrie en flux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Découvrez la mesure de l'alloréactivité des cellules T par cytométrie en flux d'imagerie pour l'immunologie des greffes. Cette méthode permet d'analyser les synapses immunitaires à haut débit et d'améliorer la prédiction des résultats de transplantation.

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SCJ a été soutenu par une société internationale de coeur et de bourses de recherche de transplantation pulmonaire et un Collège royal des médecins et chirurgiens du Canada Detweiler Fellowship.SM a été soutenu en partie par une Société internationale de transplantation cardiaque et pulmonaire bourse de perfectionnement professionnel (à SCJ). SS a été soutenue par les National Institutes of Biomedical Research Oxford Health Research Centre.JH est le récipiendaire d&#39;un rein Research UK Senior Fellowship non-clinique. Ce travail a été financé par les subventions suivantes à AB et KW: une subvention du programme Wellcome Trust (082519Z07Z), un programme de British Heart Foundation Grant (PG / 10 / 62,28504) et le programme-cadre de l&#39;UE 7 (une étude, BioDRIM). Les auteurs tiennent à remercier Michael Parsons et le Fonds de base à l&#39;cytométrie en flux Lunenfeld Research Institute-Tanenbaum, du système de santé Sinai, Toronto pour fournir l&#39;accès et le soutien à l&#39;instrument Mark X ImageStream.

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<li>Strober, S., Benike, C., Krishnaswamy, S., Engleman, E. G., Grumet, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+transplantation+tolerance+twelve+years+after+prospective+withdrawal+of+immunosuppressive+drugs%3A+studies+of+chimerism+and+anti-donor+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Clinical transplantation tolerance twelve years after prospective withdrawal of immunosuppressive drugs: studies of chimerism and anti-donor reactivity.</a> Transplantation. 69 (8), 1549-1554 (2000).</li>
<li>Fussell, S. T., Donnellan, M., Cooley, M. A., Farrell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocyte+precursor+frequency+does+not+correlate+with+either+the+incidence+or+severity+of+graft-versus-host+disease+after+matched+unrelated+donor+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocyte precursor frequency does not correlate with either the incidence or severity of graft-versus-host disease after matched unrelated donor bone marrow transplantation.</a> Transplantation. 57 (5), 673-676 (1994).</li>
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<li>Halloran, P. F., Famulski, K. S., Reeve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+assessment+of+disease+states+in+kidney+transplant+biopsy+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Molecular assessment of disease states in kidney transplant biopsy samples.</a> Nat Rev Nephrol. 12 (9), 534-548 (2016).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+common+blood+gene+signatures+for+the+diagnosis+of+renal+and+cardiac+acute+allograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of common blood gene signatures for the diagnosis of renal and cardiac acute allograft rejection.</a> PLoS One. 8 (12), e82153(2013).</li>
<li>Khatri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+rejection+module+%28CRM%29+for+acute+rejection+across+multiple+organs+identifies+novel+therapeutics+for+organ+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A common rejection module (CRM) for acute rejection across multiple organs identifies novel therapeutics for organ transplantation.</a> J Exp Med. 210 (11), 2205-2221 (2013).</li>
<li>Halloran, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+diagnosis+of+antibody-mediated+rejection+in+kidney+transplant+biopsies%3A+an+international+prospective+study+%28INTERCOM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Microarray diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney transplant biopsies: an international prospective study (INTERCOM).</a> Am J Transplant. 13 (11), 2865-2874 (2013).</li>
<li>Mastoridis, S., Issa, F., Wood, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+biomarkers+and+functional+assays+to+monitor+cell-therapy-induced+tolerance+in+organ+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Novel biomarkers and functional assays to monitor cell-therapy-induced tolerance in organ transplantation.</a> Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 64-71 (2015).</li>
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<li>Dustin, M. L., Bromley, S. K., Kan, Z., Peterson, D. A., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+receptor+engagement+delivers+a+stop+signal+to+migrating+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Antigen receptor engagement delivers a stop signal to migrating T lymphocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (8), 3909-3913 (1997).</li>
<li>Goldsmith, M. A., Weiss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+signal+transduction+by+the+antigen+receptor+without+commitment+to+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Early signal transduction by the antigen receptor without commitment to T cell activation.</a> Science. 240 (4855), 1029-1031 (1988).</li>
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<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li>
<li>Francis, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+transplantation+tolerance+converts+potential+effector+T+cells+into+graft-protective+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of transplantation tolerance converts potential effector T cells into graft-protective regulatory T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (3), 726-738 (2011).</li>
<li>Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+induction+of+transplantation+tolerance+with+a+nondepleting+anti-Cd4+monoclonal+antibody+and+donor-specific+transfusion+before+transplantation.+A+critical+period+of+time+is+required+for+development+of+immunological+unresponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness.</a> Transplantation. 61 (11), 1642-1647 (1996).</li>
<li>Faust, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+T+cell+TGFbeta+signaling+and+IL-17+in+allograft+acceptance+and+fibrosis+associated+with+chronic+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of T cell TGFbeta signaling and IL-17 in allograft acceptance and fibrosis associated with chronic rejection.</a> J Immunol. 183 (11), 7297-7306 (2009).</li>
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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Écoulement d&#39;imagerie a été utilisée pour démontrer la cytométrie de formation de la synapse immune entre les cellules T et les APC ou monoclonaux en présence de superantigènes 24, 25, 26, 27, 28. Ce procédé tire parti du fait que , après un contact de cellule T-APC productive, la cellule T réarrange son cytosquelette d&#39;actine, il polarisant vers le site de contact 21. Cette réorganisation ne se produit pas sans signalisation TCR, et il est donc un corrélat début de l&#39; activation des lymphocytes T 19, 20, 21. La méthode présentée ici adapte cette approche à la mesure de la fréquence allo des lymphocytes T dans les populations polyclonaux T-cellules. En tant que tel, il peut servir à l&#39;avenir comme base pour le développement de tests pour Réactifs des donateurs<html> ty dans la transplantation clinique. Bien que les comparaisons directes n&#39;ont pas encore été fait, la détection des allo synapses immunitaires semble avoir une puissance supérieure prédictive que le MLR classique. Par exemple, des travaux antérieurs ont montré que, dans le protocole décrit ci - dessus tolérisation, les résultats d&#39;une MLR ne parviennent pas à établir une corrélation entre de manière fiable avec le résultat de la greffe 2. Un certain nombre d&#39;essais ont été mis au point pour l&#39;état opérationnel de tolérance chez l&#39; homme 9, 10, 11, bien que ceux - ci ne mesurent pas la fonction des cellules effectrices en réponse à alloantigène. En revanche, l&#39; IFNy ELISPOT dosages 8 mesure effecteur fonction des cellules T mais ne peut pas capturer le spectre complet de la sécrétion de cytokines qui peuvent être pertinentes pour le rejet d&#39;allogreffe aigu et chronique, telle que l&#39; IL-17 38,&gt; 39. L&#39;essai de dilution limite 4, qui est un travail intensif, et le test trans-vivo 6, ce qui nécessite des souris, ont des limites pratiques importantes qui entraveraient leur application dans un cadre clinique. Les récentes améliorations sur l&#39;analyse des cellules qui prolifèrent en utilisant l&#39; analyse de la séquence TCR des lymphocytes T répondant dans le MLR peuvent être utiles, mais comme l&#39;analyse présentée ici, il faudra une validation plus poussée dans les études cliniques 18, 40. Poursuite du développement du test de détection de synapse exigera qu&#39;un certain nombre de questions importantes répondre. Tout d&#39;abord, l&#39;essai tel que développé ne mesure alloréactivité directe. La voie directe comporte la présentation de complexes CMH / peptide sur les APC allogéniques dérivées du donneur. Ces derniers sont généralement éliminés rapidement après la transplantation, et encore la présentation allo est carried par les APC de destinataire présentant intact donneur de CMH (voie semi-directe) ou des antigènes du donneur traités sur l&#39;autonomie du CMH (voie indirecte). La voie indirecte est un important facteur de rejet d&#39;allogreffe chronique 33, 41. En principe, il devrait être possible de détecter synapses indirecte immunitaire en utilisant ce test, mais indirectement allo les lymphocytes T ont une fréquence beaucoup plus faible que les 42, 43 directs, ce qui signifie que l&#39;analyse d&#39;un plus grand nombre d&#39;événements sera nécessaire. Une deuxième considération est que nous avons seulement testé ce test en utilisant des cellules T CD4 +, tandis que les cellules CD8 + T sont également un élément important de la réponse anti-donneur. Encore une fois, il devrait être possible de détecter synapses T CD8 + cellules APC à l&#39; aide de cette méthode. Une autre limitation est que la méthode nécessite l&#39;examen manuel et l&#39;analyse des images de cellules dans la memb finaleporte de contact Rane, et nous travaillons actuellement sur l&#39;automatisation de cette étape. Enfin, la méthode nécessite des tests et le développement chez les sujets humains, et des études préliminaires avec des échantillons humains sont actuellement en cours d&#39;exécution. Une analyse plus poussée du sous - ensemble des lymphocytes T phénotypiques (c. -à- effecteur, de la mémoire, de régulation, etc.) en combinaison avec la détection des synapses immunitaires chez les transplantés représenterait une approche puissante pour caractériser le répertoire des cellules T allo et sera un point important pour travail futur.

une transplantation d&#39;organe solide a transformé la prise en charge des patients atteints de maladies en phase terminale du rein, le foie, le cœur et les poumons. En raison des disparités dans les grands et petits antigènes d&#39;histocompatibilité, cependant, allogreffes sont rapidement rejetées par lymphocytes T du receveur si les médicaments immunosuppresseurs ne sont pas utilisés. Ces agents ont de nombreux effets indésirables, y compris les risques pour le cancer et le dysfonctionnement des organes. Un objectif majeur clinique est donc de réduire la dose d&#39;immunosuppression au niveau minimum requis pour éviter le rejet d&#39;allogreffe. Ce niveau est susceptible de varier en fonction du degré d&#39;activation du système immunitaire inné; le degré de non-concordance de alloantigène donneur-receveur; et les différences inter-patient dans la fonction immunitaire, la pharmacocinétique, la pharmacodynamique et. Malheureusement, les cliniciens de transplantation n&#39;ont pas des outils pour évaluer avec précision la réactivité des donateurs individuels chez les patients 1. le mélangeréaction leucocytaire (MLR) peut détecter la réactivité des donateurs, mais il ne parvient pas à prédire de façon fiable les résultats de la greffe 2, 3. Limiter les essais de dilution, ELISPOT cytokines, et le dosage trans-vivo , soit de mesurer une gamme limitée de réponses ou ne sont pas 4 pratique, 5, 6, 7, 8 profils d&#39;expression .Gene ont révélé les signatures liées à la tolérance opérationnelle 9, 10, 11, 12 et le rejet 13, 14, 15, mais ceux - ci ne sont pas toujours généralisables au sein des populations 16 et peut en fin de compte ont une utilité limitée chez les patients individuels. analy basée sur la séquenceSSE du récepteur des cellules T (TCR) des cellules T dans le sang périphérique 17 ou proliférer dans la MLR 18 ont également été mis au point , mais nécessitent une validation supplémentaire. Conceptuellement, il serait souhaitable d&#39;avoir un test qui détecte les premières étapes requises dans les pays bénéficiaires activation des lymphocytes T par un antigène du donneur. Depuis la mise en culture des cellules sur plusieurs jours (comme dans le MLR) peut introduire des objets, un tel test ne nécessite pas idéalement la mesure des événements en aval, tels que la prolifération ou la fonction effecteur. De même, cependant, il serait également souhaitable que le test dépend de certains éléments de la fonction des cellules T, étant donné que des évaluations purement descriptives (Par exemple, le séquençage TCR) peut être incapable de faire la distinction entre les cellules T anergiques et fonctionnelles. De nombreuses études ont montré que le contact prolongé T-APC est nécessaire pour la formation d&#39;une synapse immunitaire, qui est une première essentiellepas dans la réponse des cellules T 19, 20, 21, 22. Nous avons récemment rapporté que, lors dynamique en imagerie laps de temps vitro, environ 5 - 10% des souris des cellules T CD4 + forment des contacts de longue durée avec des cellules dendritiques dérivées de moelle osseuse allogénique (BMDC) 23. La fréquence de contact prolongé a été augmenté chez les animaux qui ont rejeté une greffe, alors que chez les souris préalablement rendue tolérante aux mêmes antigènes, elle est restée à des niveaux observés chez les souris untransplanted 23. Interactions prolongées ont été réduites en présence du bénéficiaire Tregs et augmenté en leur absence, et nous avons observé des phénomènes similaires utilisant des cellules T humaines et allogéniques DCs dérivées de monocytes (MoDCs) 23. Cependant, l&#39;énumération des contacts prolongés effectué dans un populatio polyclonale des lymphocytes Tn prend du temps et de main-d&#39;œuvre. Nous avons donc fait usage cytométrie de flux d&#39;imagerie pour examiner la formation de synapse allogénique. flux d&#39;imagerie intègre cytométrie les capacités d&#39;acquisition et d&#39;analyse des données multiparamétriques de flux classique cytométrie avec les capacités d&#39;imagerie cellulaire unique de microscopie à fluorescence. Cette technique a été utilisée par d&#39; autres chercheurs pour étudier la formation des synapses immunitaire par des cellules T monoclonales 24, 26, 27 ou en présence de 28 superantigènes. Dans un tel contexte, cependant, la fréquence des cellules T répondantes varie de 30 à 100%, tandis que les cellules T alloréactives sont généralement estimées pour représenter 15.5% du répertoire total de cellules T 29, 30, 31, 32. Il est important, nous avons montré que la cytométrie de flux d&#39;imagerie peut produire avery de mesure comparable de alloréactifs fréquence des lymphocytes T 23 et que les changements de fréquence de synapse au sein d&#39; une population polyclonale de cellules T sont prédictifs de l&#39; issue de la greffe 23. À l&#39; heure actuelle, cette approche a été optimisée pour mesurer la alloréactivité directe des cellules T CD4 +, mais, en principe, il pourrait également être développé pour examiner les cellules T CD8 + et la voie indirecte. Alloréactivité indirecte est considérée de plus en plus pertinent parfois plus post-transplantation 33. Nous développons actuellement cette méthode pour utiliser les cellules humaines, ce qui permettra de tester chez les patients. Ainsi, à l&#39;avenir, l&#39;approche globale peut être utile pour l&#39;évaluation fonctionnelle des réponses des lymphocytes T chez les transplantés avant la transplantation; immédiatement après la transplantation; et à long terme, lorsque la réduction de la drogue devient un objectif important.

<table><tbody><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Divers</td><td>Varie</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediamenetétraacétique, solution 0,5 M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Détergent non ionique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Bêta-mercaptoéthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Diméthyl sulfoxyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>La solution de formaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td> est composée à <td>37 % de formaldéhyde et doit donc être diluée 25 fois pour une solution à 1,5 %.</td></tr><tr><td> m taille des pores</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Isothiocyanate de phalloïdine-fluorescéine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5282</td><td></td></tr><tr><td>7-aminoactinomycine D</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1310</td><td>Reconstituer dans le DMSO</td></tr><tr><td>Anti-souris conjugué à l’allophycocyanine CD90.2</td><td>eBioscience</td><td>17-0902</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris conjugué au bleu du Pacifique CD11b</td><td>eBioscience</td><td>48-0112</td><td>Le bleu Pacifique a été remplacé par eFluor 450</td></tr><tr><td>Anti-souris biotinylé CD3</td><td>eBioscience</td><td>13-0032</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris biotinylé CMH classe II</td><td>eBioscience</td><td>13-5321</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris biotinylé B220</td><td>eBioscience</td><td>13-0452</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris biotinylé CD8</td><td>eBioscience</td><td>13-0081</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylée anti-souris CD19</td><td>eBioscience</td><td>13-0193</td><td></td></tr><tr><td>Microbilles anti-biotine</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>LS colonnes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS séparateur de cellules</td><td>magnétique MIltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>souris recombinante GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>TGF&bêta humain recombinant ; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>Humain TGF&beta ; 1 a une activité sur les cellules de souris</td></tr><tr><td>Amnis ImageStream X Mark II</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>Cytomètre en flux d’imagerie ; détails disponibles sur http://www.emdmillipore.com/</td></tr> <tr><td>IDEAS Software</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>Téléchargement gratuit (inscription requise) : https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20</td></tr><tr><td>Milieu de culture cellulaire&nbsp ;</td><td>Divers</td><td>Varie</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Divers</td><td>Varie</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire</td><td>Divers</td><td>Varie</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure de cellules t alloréactivité basés sur l&#39;imagerie cytométrie en flux

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

La mesure de la réactivité immunologique à des antigènes du donneur chez les receveurs de greffe est susceptible d&#39;être cruciale pour le succès réduction ou le retrait de l&#39;immunosuppression. La réaction leucocytaire mixte (MLR), limitant les essais de dilution, et le dosage trans-vivo d&#39; hypersensibilité retardée (DTH) ont tous été appliqués à cette question, mais ces méthodes ont une capacité prédictive limitée et / ou d&#39; importantes limitations pratiques qui réduisent leur utilité. écoulement d&#39;imagerie est une technique de cytométrie qui combine les puissances quantitatives multiparamétriques cytométrie en flux avec les capacités d&#39;imagerie de microscopie à fluorescence. Nous approche récemment fait usage d&#39;un de cytométrie de flux d&#39;imagerie pour définir la proportion de cellules T bénéficiaires capables de former des synapses immunitaires matures avec des cellules présentatrices d&#39;antigène donneur (DPR). En utilisant un modèle de greffe de cœur de souris bien caractérisé, nous avons montré que la fréquence des synapses immunitaires in vitro chez T-APC membrévénements de contact ane résultat allogreffe fortement prédit le rejet, la tolérance, et une situation où la survie de la greffe dépend des cellules T régulatrices induites. La fréquence des contacts T-APC augmentait avec les cellules T de souris au cours de rejet aigu et une diminution des cellules T provenant de souris rendues insensibles aux alloantigène. L&#39;addition de cellules T régulatrices dans le système in vitro réduit contacts T-APC prolongées. Critique, cet effet a également été vu avec polyclonale humaine élargie, d&#39;origine naturelle des cellules T régulatrices, qui sont connus pour contrôler le rejet des tissus humains dans les modèles de souris humanisées. La poursuite du développement de cette approche peut permettre une caractérisation plus profonde du compartiment des cellules T allo chez les receveurs de greffe. À l&#39;avenir, le développement et l&#39;évaluation de cette méthode en utilisant des cellules humaines peuvent constituer la base des tests utilisés pour sélectionner les patients pour minimiser immunosuppresseur, et il peut être utilisé pour mesurer l&#39;impact de tolérogèneic thérapies dans la clinique.

Cette méthode a été utilisée pour étudier CD4 + alloréactivité des cellules T chez des souris rendues tolérantes à des alloantigènes de donneur avant la transplantation hétérotopique d&#39;allogreffe cardiaque. Souris CBA (H-2 k) ont reçu un protocole inductrice de tolérance consistant en un donneur spécifique (H-2 B6, b) la transfusion sanguine associée à un anticorps CD4 non appauvrissant la couche d&#39; un mois avant la réception d&#39; une transplantation cardiaque B6. Ce protocole conduit à la survie de l&#39; allogreffe de longue durée qui dépend de Foxp3 + cellules T régulatrices 36, 37. Sept jours après la transplantation, la rate des cellules T CD4 + ont été obtenus à partir rendues tolérantes et destinataires non rendues tolérantes des allogreffes cardiaques B6 et ont été co-incubées avec B6 dérivées de moelle osseuse DC selon ce protocole. La figure 2 montre des données représentatives de cette expérience. La grille de contact de la membrane est représentée sur la Figure 2A, avec collimateur verts placés sur un événement synaptique (panneau de gauche, 1) et en un événement non-synaptique (panneau de droite). La figure 2B montre les canaux de fluorescence fond clair et pour cet événement. Pour réduire le biais, les données ont été analysées par un observateur aveugle à l&#39; affectation de traitement 23. Comme représenté sur plusieurs exemples dans la figure 3, à la fois non rendues tolérantes (Figure 3A-B) et rendues tolérantes (Figure 3C-D) destinataires ABC de coeurs B6, les synapses sont faciles à distinguer des contacts synaptiques non par la présence d&#39;une crête dense FITC-positif à l&#39;interface T-APC. Ces résultats montrent que la détection visuelle des synapses immunitaires faites par lymphocytes T du receveur des pistes avec le degré de alloréactivité chez le receveur. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55283/55283fig2.jpg" /> Figure 2. Identification des T-APC doublets avec membraneContact et création de la synapse. Événements dans la grille de doublet final (figure 1F) sont analysés. A. fluorescence du marqueur de cellules T dans le masque d&#39;objet APC est tracée en fonction de fluorescence du marqueur APC dans le masque d&#39;objet en courant continu. Certains événements ont un doublet APC et une cellule T sans contact entre cellules et apparaissent dans le coin inférieur gauche de la parcelle (images non représenté). Une grille de contact de la membrane peut donc être établie qui ne comprend que des doublets dans lequel les cellules T et les APC sont en contact. Les images de chaque événement dans cette porte sont passés en revue les preuves de réorganisation du cytosquelette d&#39;actine dans le canal phalloïdine-FITC et peuvent être étiquetés à l&#39;aide du logiciel d&#39;analyse. Le panneau de gauche indique un événement de synapse immunitaire (marqué 1 et désigné par réticule vert), alors que le panneau de droite indique un événement de contact avec la membrane, sans formation de la synapse immunologique (marquée 2 et indiqué par réticule vert). La détermination de la formation des synapses nécessite un examen manuel de cesimages, représenté sur B. B. La rangée supérieure montre des images en fond clair et canal de fluorescence pour un doublet avec une synapse immune (correspond à l&#39; événement 1 en A); la rangée du bas montre un doublet à membrane mais manquant de contact formation des synapses (ce qui correspond à l&#39;événement 2 en A). Les données ont été analysées de façon aveugle en ce qui concerne l&#39; affectation de traitement et sont d&#39;une expérience déjà publié 23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="figure 3" src="/files/ftp_upload/55283/55283fig3.jpg" /> Figure 3. Des exemples de formation Synapse T-APC. Souris CBA ont reçu des allogreffes cardiaques provenant de donneurs B6 après chaque pas de pré-traitement (AB) ou après l&#39; induction de tolérance avec du sang entier B6 sous le couvert d&#39;un anticorps anti-CD4 non-déplétant ( <st<html> rong&gt; CD). Au bout de 7 jours, spléniques cellules T CD4 + ont été testés pour la formation des synapses avec B6 contrôleurs de domaine. A. Trois exemples de doublets non-synaptiques avec membrane contact d&#39;un animal non rendues tolérantes. B. Trois exemples de synapses immunitaire d&#39;un animal non rendues tolérantes. C. Trois exemples de doublets non-synaptiques avec membrane de contact d&#39;un animal rendues tolérantes. D. Trois exemples de synapses immunitaire d&#39;un animal rendues tolérantes. Formation des synapses est indiquée par la présence d&#39;une arête vive, FITC-positif à l&#39;interface T-APC (CH03). Les données ont été analysées de façon aveugle en ce qui concerne l&#39; affectation de traitement et sont d&#39;une expérience déjà publié 23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> ays &quot;&gt; <tbody><tr><td> Anticorps / colorant </td><td> fluorochrome </td><td> Canal </td><td> Concentration </td></tr><tr><td> CD11c </td><td> eF450 </td><td> CH02 </td><td> 5 ug / mL, de manière empirique titrer </td></tr><tr><td> CD90.2 </td><td> APC </td><td> CH06 </td><td> 5 ug / mL, de manière empirique titrer </td></tr><tr><td> phalloidin </td><td> FITC </td><td> CH03 </td><td> 0,05 à 0,5 ug / mL </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td> - </td><td> CH05 </td><td> 25 ug / mL </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Anticorps et colorants utilisés dans cette étude. anticorps conjugué à un fluorochrome, les colorants, les fournisseurs et les concentrations recommandées sont présentées dans le tableau. Le flux d&#39;imagerie cytomètre de canal qui a été utilisé pour détecter chaque fluorochrome est également montré dans le tableau.

Le présent document décrit un procédé de mesure alloréactivité dans une population mixte de cellules T en utilisant la cytométrie de flux d&#39;imagerie.

Mesure de cellules T alloréactivité basés sur l&#39;imagerie cytométrie en flux

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer l'allo-réactivité des lymphocytes T à l'aide de la cytométrie de flux à imagerie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en immunologie des transplantations, telles que quelle proportion des lymphocytes T d'un receveur réagit aux alloantigènes du donneur. Cette technique combine les capacités quantitatives multiparamétriques de la cytométrie de flux avec les fonctionnalités d'imagerie de la microscopie fluorescente, permettant l'examen à haut débit des synapses entre lymphocytes T individuels et cellules présentatrices d'antigènes.La procédure sera démontrée par Sajad Moshkelgosha, un postdoctorant de mon laboratoire. Commencez par ensemencer 0,5 × 10⁶ cellules dendritiques dans chaque puits d'une plaque de culture cellulaire 96-puits, suivis de 1 × 10⁶ cellules T, et un volume final allant jusqu'à 50 µL de milieu de culture par puits.Incuber les cultures froides pendant quatre heures à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone. Ensuite, ajouter dans chaque puits un volume égal à trois fois le volume de culture d’un solution de formaldéhyde à 1,5 % dans du PBS, pendant 30 minutes à température ambiante. À la fin de la fixation, transférer les cellules de chaque puits dans un tube en polystyrène de cinq millilitres correspondant.Marquez les cellules avec les anticorps conjugués au fluorochrome approprié dans 100 microlitres de tampon de lavage pendant 30 minutes à température ambiante, à l'abri de la lumière. Ensuite, lavez les cellules dans un millilitre de tampon de lavage et remettez en suspension les culots dans du tampon perm/lavage contenant de la phalloïdine FITC. Après une nouvelle période de 30 minutes à température ambiante, à l'abri de la lumière, lavez les cellules dans un millilitre de tampon perm/lavage frais.Resuspendre les culots dans le colorant nucléaire d'intérêt dans du tampon de perméabilisation/lavage pour une incubation finale de 30 minutes à température ambiante, à l'abri de la lumière. Laver les cellules dans un millilitre de tampon de perméabilisation/lavage, suivi d'un lavage dans du tampon de lavage seul. Ensuite, resuspendre les cellules dans 50 à 100 microlitres de tampon de lavage frais.Transférez les cellules dans de petites tubes microcentrifuges bouchés. Pour analyser les interactions entre cellules, réservez d'abord un canal pour l'acquisition d'images en champ clair et chargez le premier tube témoin. Avec le canal de champ clair désactivé, dans la fenêtre de travail, créez un nouveau graphique de dispersion pour chaque canal utilisé, représentant le rapport d'aspect par rapport à la surface.Introduisez les événements simples dont le rapport d'aspect est proche de un. Pour chaque fluorochrome, vérifiez la population positive et ajustez la tension du laser dans la boîte d'illumination, selon les besoins. Dans la boîte des canaux, sélectionnez les canaux appropriés pour les fluorochromes utilisés lors de la coloration.Ensuite, cliquez sur enregistrer. Lorsque le nombre d'événements atteint le seuil spécifié, l'acquisition s'arrêtera automatiquement. Après avoir acquis tous les contrôles de coloration simple, chargez le premier tube d'échantillon expérimental et acquérez plusieurs dizaines de milliers d'événements dans les canaux d'analyse appropriés, y compris le canal de champ clair.Pour générer une matrice de compensation, chargez les fichiers de données des échantillons monochromatiques dans l'assistant de compensation et sélectionnez les canaux fluorescents appropriés pour l'expérience. Après avoir confirmé que les populations positives correctes ont été sélectionnées, double-cliquez sur une valeur dans la matrice et ajoutez le graphique à la zone d'analyse pour chaque canal. Cliquez sur Terminer pour enregistrer la matrice de compensation sous forme de fichier CTM.Chargez le fichier RIF dans le logiciel d'analyse approprié. Convertissez le fichier RIF en un fichier DAF pour l'analyse des données. Ouvrez le premier fichier d'échantillon.Tracer la racine carrée moyenne du taux de variation de l'intensité d'imagerie dans le canal champ clair. Ensuite, tracer le rapport d'aspect en fonction de la surface pour le marqueur de cellule présentatrice d'antigène. Sélectionner les doublets contenant une seule cellule présentatrice d'antigène.Tracer le rapport d'aspect en fonction de la surface pour le marqueur des cellules T. Sélectionner les doublets contenant une seule cellule T. Pour identifier les cellules en contact les unes avec les autres, utilisez sous le menu d'analyse l'option masques afin d'ouvrir le gestionnaire de masques, puis nommez le nouveau masque « masque d'objet cellule T ».Cliquez sur le bouton de fonction et, dans la boîte de dialogue, sélectionnez l'objet. Sélectionnez le canal dans lequel le marqueur de cellule T est détecté, puis cliquez sur OK. Créez un masque pour le marqueur de cellule présentant l'antigène dans le canal approprié, de la même manière. Représentez graphiquement l'intensité de fluorescence du marqueur de cellule T dans le masque d'objet de la cellule présentant l'antigène par rapport à l'intensité de fluorescence de la cellule présentant l'antigène dans le masque d'objet de la cellule T.Ensuite, dessinez une fenêtre ne comprenant que les cellules en contact les unes avec les autres. Enfin, examinez manuellement les images de phalloïdine marquée par la FITC des événements situés dans cette fenêtre afin de distinguer les synapses immunitaires matures des simples contacts cellule-à-cellule, en utilisant la fonction d'images de balisage pour marquer ces images. Ici, la fenêtre de contact membranaire est illustrée pour les cellules T CD4 positives spléniques obtenues à partir de receveurs tolérisés et non tolérisés de greffes cardiaques allogéniques de type B6, sept jours après la greffe, puis co-incubées avec des cellules dendritiques dérivées de moelle osseuse de type B6, comme indiqué.Avec les événements synaptiques et non synaptiques indiqués par les croix vertes. Les analyses en champ clair et en fluorescence permettent également de visualiser les événements synaptiques et non synaptiques individuels. En effet, les synapses provenant à la fois des receveurs CDA non tolérisés et tolérisés de cœurs B6 se distinguent facilement des contacts non synaptiques par la présence de crêtes denses positives au FITC à l'interface entre la cellule T et la cellule présentatrice d'antigène.Après un développement supplémentaire, cette technique pourrait être appliquée en milieu clinique, par exemple pour réduire ou supprimer l'immunosuppression, ou pour prédire le résultat du greffon chez les receveurs humains de greffes.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cet article décrit une technique simple pour induire l'anergie alloantigène spécifique dans les cellules mononucléées du sang périphérique. La technique peut être appliquée en clinique pour générer des cellules de donneurs non-alloréactifs. La perfusion de ces cellules pourrait améliorer la reconstitution immunitaire et réduire la toxicité après allogreffe de cellules souches hématopoïétiques.

Induction de l&#39;alloantigène spécifique anergie dans les cellules mononucléaires du sang périphérique par stimulation alloantigène avec blocage du signal de co-stimulation

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Radial Mobilité et cytotoxiques fonction de réplication rétrovirale Vector transduits, non-adhérent Alloresponsive lymphocytes T

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Nous présentons ici un protocole de cytométrie en flux pour identifier les CD4+ et CD8+ T cellules, cellules γδ T, lymphocytes B, les cellules NK et monocytes dans le sang périphérique humain en utilisant seulement deux fluorochromes au lieu de sept. Avec cette approche, cinq marqueurs additionnels peuvent être enregistrées sur la plupart des cytomètres.

Discrimination des sept sous-ensembles de cellules immunitaires par deux-fluorochrome cytométrie en flux

L’afflux de calcium, une mesure de la signalisation des lymphocytes T, est un moyen efficace d’analyser les réponses à la stimulation des récepteurs des lymphocytes T. Ce protocole de multiplexage d’Indo-1 avec des panels d’anticorps dirigés contre les molécules de surface cellulaire tire parti des capacités très flexibles de la cytométrie en flux à spectre complet.

Analyse de l’afflux de calcium induit par le récepteur des lymphocytes T dans les lymphocytes T murins primaires par cytométrie en flux à spectre complet

Le présent protocole décrit un flux de travail expérimental qui permet l’analyse ex vivo de la stimulation des lymphocytes T humains dans un système de co-culture allogénique avec des cellules tumorales prétraitées.

Analyse de l’activité des lymphocytes T humains dans un cadre de co-culture allogénique de cellules tumorales prétraitées

Découvrez la mesure de l'alloréactivité des cellules T par cytométrie en flux d'imagerie pour l'immunologie des greffes. Cette méthode permet d'analyser les synapses immunitaires à haut débit et d'améliorer la prédiction des résultats de transplantation.

Mesure de cellules T alloréactivité basés sur l'imagerie cytométrie en flux

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