Isolement et enrichissement du foie progénitrices sous-ensembles identifiés par une combinaison de marqueurs de surface Novel

Les objectifs globaux de ce protocole de digestion hépatique sont d’évaluer les différents sous-ensembles de progéniteurs hépatiques par cytométrie en flux et d’isoler ces cellules à une grande pureté à l’aide d’un nouveau cocktail de marqueurs de surface pour une analyse plus poussée en aval. Cette méthode peut aider à répondre à diverses questions sur la biologie des cellules progénitrices du foie, par exemple, quelles sont leurs caractéristiques spécifiques de sous-ensemble et quelle est leur cause lointaine lors de lésions hépatiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’isoler les cellules progénitrices pour une pureté et une viabilité élevées, ce qui est important pour l’analyse in vitro.

Bien que cette technique de digestion donne un aperçu de la biologie des cellules progénitrices, elle peut en fait être utilisée pour l’isolement des populations de cellules hématopoïétiques et endothéliales. Pour préparer une préparation de cellule unique à partir d’un foie de souris, transférez les lobes sur une boîte de Pétri séchée et utilisez un scalpel pour couper les tissus en cubes homogènes d’environ deux millimètres cubes. Transférez les morceaux dans deux tubes à centrifuger coniques de 15 millilitres par foie contenant chacun 2,5 millilitres de tampon de digestion.

Et placez les échantillons dans un bain-marie à 37 degrés Celsius avec une légère agitation à cinq et 10 minutes. Après 15 minutes de digestion, utilisez une pipette de 1 000 microlitres avec une pointe coupée pour titrer doucement les morceaux de foie. Remettez ensuite les tubes dans le bain et laissez les morceaux se déposer pendant deux minutes.

Ensuite, filtrez deux aliquotes d’environ 700 microlitres du surnageant à travers une crépine de 100 microns pré-humidifiée avec 800 microlitres de tampon de collecte. Et remplacez le surnageant éliminé par un tampon de digestion frais. Lorsque le tissu hépatique n’est plus visible, faites passer tout le surnageant des tubes de digestion à travers le filtre.

Et collecter toutes les cellules par centrifugation. Remettez les pastilles en suspension dans un millilitre de tampon de lyse de chlorure d’ammonium et de potassium à température ambiante, en arrêtant la lyse avec cinq millilitres de tampon de collecte fraîche après une minute. Récupérez les cellules avec une autre centrifugation.

Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille lâche. Et mettez les cellules en suspension dans quatre millilitres de tampon de collecte frais sur de la glace. Pour déterminer le nombre de cellules de l’échantillon de foie par cytométrie en flux, mélangez d’abord 20 microlitres de suspension de cellules hépatiques avec 174 microlitres de PBS dans un tube de polystyrène de 1,5 millilitre et six microlitres de propidium iodé

Ajoutez des billes de comptage qui permettent la quantification cellulaire et chargez le mélange de billes et de cellules sur le cytomètre en flux. Gate sur la diffusion latérale par des paramètres de diffusion vers l’avant pour éviter les débris. Exclusion des doublets via une hauteur de diffusion vers l’avant par rapport à une porte de zone de diffusion vers l’avant et les cellules mortes positives au propidium iode.

Ensuite, chargez un échantillon de 30 microlitres sur le cytomètre en flux et enregistrez les événements. Pour colorer les cellules hépatiques en vue de l’analyse cytométrique en flux des sous-ensembles progéniteurs, transférez 2x10^5 aliquotes des cellules dans des tubes réactionnels de 1,5 millilitre. Et granulez les cellules par centrifugation.

Remettre les granulés en suspension dans le bloc Fc pour une incubation de cinq minutes sur de la glace. Ajoutez ensuite 50 microlitres du cocktail d’anticorps de coloration de surface cellulaire d’intérêt dans les tubes appropriés pour une incubation de 20 minutes sur de la glace à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, laver les échantillons dans 400 microlitres de tampon de coloration par échantillon.

Et mettez à nouveau en suspension les granulés dans 100 microlitres du cocktail d’anticorps secondaires approprié pendant 20 minutes sur de la glace à l’abri de la lumière. Ensuite, lavez les cellules avec 400 microlitres supplémentaires de tampon de coloration. Et remettre les granulés en suspension dans 300 microlitres de tampon de coloration contenant de l’iodure de propidium.

Mesurez l’échantillon à l’aide d’un cytomètre en flux. Pour enrichir la population de cellules progénitrices par séparation à base de microbilles magnétiques, transférez 1,5 à 2 x 10^6 cellules dans le nombre approprié de tubes coniques de 15 millilitres et collectez les cellules par centrifugation. Remettre les granulés en suspension dans 400 microlitres de HBSS complété par du BSA.

Et ajoutez 40 microlitres de microbilles anti-CD31 et 30 microlitres de microbilles anti-CD45 pour une incubation de 15 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez les cellules dans cinq millilitres de HBSS plus BSA. Et mettez les granulés en suspension dans 100 microlitres de billes d’élimination des cellules mortes pour une incubation de 15 minutes à température ambiante.

Pendant que les cellules sont en incubation, équilibrez une colonne de sélection positive de taille appropriée par foie avec trois millilitres de HBSS plus BSA. Ajoutez ensuite 900 microlitres de HBSS plus BSA dans les cellules et filtrez les cellules à travers une maille filtrante en polyamide de 100 microns. Chargez les cellules filtrées incubées par des billes sur les colonnes collectant l’éluat dans le tube de centrifugation.

Lorsque toutes les cellules ont traversé la colonne, lavez les colonnes trois fois avec trois millilitres de HBSS plus BSA. Granulez les cellules par centrifugation et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 100 microlitres de tampon de rinçage et de bloc Fc. Tirez les pastilles cellulaires de quatre à six foies ou jusqu’à moins de 1x10^6 cellules sélectionnées négativement.

Après cinq minutes, étiquetez les cellules avec l’anticorps biotinylé anti-GP38 pendant 10 minutes sur de la glace. A la fin de l’incubation, prélever les cellules par centrifugation pour les remettre en suspension dans 400 microlitres de tampon de rinçage et cinq microlitres de microbilles anti-biotine. Après 15 minutes à quatre degrés Celsius, lavez immédiatement les cellules dans cinq millilitres de tampon de rinçage.

Et remettez le granulé en suspension dans un millilitre de tampon de rinçage frais. Placez les cellules remises en suspension sur une grille réfrigérée de 15 et démarrez la séparation magnétique automatique. Ensuite, centrifugez le flux continu et mettez les pastilles en suspension dans la solution appropriée pour l’analyse expérimentale en aval prévue.

En se concentrant sur les cellules qui sont négatives pour CD45, CD31 et l’asialoglycoprotéine, le récepteur One sélectionne les cellules progénitrices du foie, qui peuvent ensuite être regroupées en fonction de leur expression de glycoprotéine 38 et de CD133. Les cellules CD133 positives gp38 positives et les cellules CD133 positives gp38 négatives représentent les populations cellulaires les plus abondantes parmi les cellules CD45 négatives CD31 négatives ASGPR1 dans le foie de souris adultes saines, avec des différences apparentes dans leur expression de divers marqueurs de surface précédemment associés aux cellules progénitrices. L’isolement de ces cellules progénitrices à l’aide de microbilles magnétiques, comme nous venons de le démontrer, permet d’obtenir une pureté de plus de 90 % des cellules hépatiques avec un haut degré de viabilité.

Lorsque l’on tente d’isoler ces cellules rares, il est important de prendre en considération les enzymes utilisées lors des étapes de digestion du foie, car différentes enzymes peuvent produire de manière préférentielle des sous-populations progénitrices spécifiques et réduire considérablement les niveaux d’expression de CD133. Il est important de se rappeler que la pureté et le rendement des cellules dépendent de la préparation en douceur des suspensions de cellules uniques du foie. Et que la grande quantité de débris cellulaires et la contamination des cellules mourantes peuvent nuire au succès de ce protocole.