Isolement et enrichissement du foie progénitrices sous-ensembles identifiés par une combinaison de marqueurs de surface Novel

Les objectifs généraux de ce protocole de digestion hépatique sont d'évaluer les différents sous-ensembles de progéniteurs hépatiques par cytométrie en flux et d'isoler ces cellules avec une grande pureté à l'aide d'un nouveau cocktail de marqueurs de surface pour des analyses ultérieures. Cette méthode peut aider à répondre à diverses questions concernant la biologie des cellules progénitrices du foie, par exemple, quelles sont leurs caractéristiques spécifiques à chaque sous-ensemble et quelles sont leurs fonctions à distance lors d'une lésion hépatique. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet l'isolement de cellules progénitrices avec une haute pureté et viabilité, ce qui est essentiel pour l'analyse in vitro.

Bien que cette technique de digestion permette d'obtenir des informations sur la biologie des cellules progénitrices, elle peut en réalité être utilisée pour l'isolement de populations de cellules hématopoïétiques et endothéliales. Pour préparer une suspension de cellules uniques à partir d'un foie de souris, transférez les lobes sur une boîte de Pétri sèche et utilisez un scalpel pour découper les tissus en cubes homogènes d'environ deux millimètres cubes. Transférez les morceaux dans deux tubes coniques de centrifugation de 15 millilitres par foie, contenant chacun 2,5 millilitres de tampon de digestion.

Et placer les échantillons dans un bain-marie à 37 degrés Celsius avec agitation douce aux temps de cinq et dix minutes. Après 15 minutes de digestion, utiliser une pipette de 1 000 microlitres avec une pointe coupée pour titrer délicatement les morceaux de foie. Puis remettre les tubes dans le bain et laisser les morceaux se déposer pendant deux minutes.

Ensuite, filtrez deux aliquots d'environ 700 microlitres du surnageant à travers un tamis de 100 microns préhumidifié avec 800 microlitres de tampon de collecte. Remplacez le surnageant éliminé par du tampon de digestion frais. Lorsque le tissu hépatique n'est plus visible, faites passer tout le surnageant des tubes de digestion à travers le filtre.

Et recueillir toutes les cellules par centrifugation. Resuspendre les culots dans un millilitre de tampon de lyse au chlorure d'ammonium et potassium à température ambiante, en arrêtant la lyse avec cinq millilitres de tampon de collecte frais après une minute. Recueillir les cellules par une autre centrifugation.

Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant sans perturber le culot lâche. Resuspendez ensuite les cellules dans quatre millilitres de tampon de collecte frais sur de la glace. Pour déterminer le nombre de cellules dans l'échantillon de foie par cytométrie en flux, mélangez d'abord 20 microlitres de la suspension cellulaire hépatique avec 174 microlitres de PBS dans un tube polystyrène de 1,5 millilitre et six microlitres d'iodure de propidium.

Ajouter des billes de comptage permettant la quantification cellulaire et charger le mélange de billes et de cellules sur le cytomètre en flux. Effectuer la sélection en fonction de la diffusion latérale par rapport aux paramètres de diffusion avant afin d'éviter les débris. Exclure les doubles par une porte basée sur la hauteur de diffusion avant versus la surface de diffusion avant, ainsi que les cellules mortes positives au propidium iodure.

Ensuite, chargez un échantillon de 30 microlitres sur le cytomètre en flux et enregistrez les événements. Pour colorer les cellules hépatiques en vue d'une analyse cytométrique des sous-populations de progéniteurs, transférez des aliquotes de 2x10^5 cellules dans des tubes de réaction de 1,5 millilitre. Et récupérez les cellules sous forme de culot par centrifugation.

Resuspendre les culots dans le bloc Fc pendant une incubation de cinq minutes sur de la glace. Ensuite, ajouter 50 microlitres du cocktail d'anticorps d'intérêt pour la coloration de surface cellulaire aux tubes appropriés, puis incuber pendant 20 minutes sur de la glace, à l'abri de la lumière. À la fin de l'incubation, laver les échantillons avec 400 microlitres de tampon de coloration par échantillon.

Et resuspendre les culots dans 100 microlitres du cocktail d'anticorps secondaires approprié pendant 20 minutes sur de la glace, à l'abri de la lumière. Ensuite, laver les cellules avec 400 microlitres supplémentaires de tampon de marquage. Puis resuspendre les culots dans 300 microlitres de tampon de marquage contenant de l'iodure de propidium.

Mesurer l'échantillon à l'aide d'un cytomètre en flux. Pour enrichir la population de cellules progénitrices par séparation magnétique à l'aide de microbilles, transférer 1,5-2x10^6 cellules dans le nombre approprié de tubes coniques de 15 millilitres et recueillir les cellules par centrifugation. Remettre en suspension les culots dans 400 microlitres de HBSS supplémenté en BSA.

Ajouter 40 microlitres de microbilles anti-CD31 et 30 microlitres de microbilles anti-CD45, puis incuber pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, laver les cellules dans cinq millilitres de HBSS additionné de BSA. Resuspendre ensuite les culots dans 100 microlitres de billes de suppression des cellules mortes pendant une incubation de 15 minutes à température ambiante.

Pendant l'incubation des cellules, équilibrez une colonne de sélection positive de taille appropriée par foie avec trois millilitres de HBSS additionné de BSA. Ajoutez ensuite 900 microlitres de HBSS additionné de BSA aux cellules et filtrez les cellules à travers une maille de filtration en polyamide de 100 microns. Chargez les cellules incubées avec des billes filtrées sur les colonnes en récupérant l'éluat dans le tube de centrifugation.

Lorsque toutes les cellules ont traversé la colonne, lavez les colonnes trois fois avec trois millilitres de HBSS additionné de BSA. Récupérez les cellules par centrifugation et remettez en suspension le culot cellulaire dans 100 microlitres de tampon de rinçage et de blocage Fc. Rassemblez les culots cellulaires provenant de quatre à six foies ou jusqu’à moins de 1x10^6 cellules négativement sélectionnées.

Après cinq minutes, étiquetez les cellules avec l'anticorps biotinylé anti-GP38 pendant 10 minutes sur de la glace. À la fin de l'incubation, récupérez les cellules par centrifugation pour les resuspendre dans 400 microlitres de tampon de rinçage et cinq microlitres de Microbilles Anti-Biotine. Après 15 minutes à quatre degrés Celsius, lavez immédiatement les cellules dans cinq millilitres de tampon de rinçage.

Et resuspendre le culot dans un millilitre de tampon de rinçage frais. Placer les cellules resuspendues sur un porte-tubes refroidi de 15 mL et démarrer la séparation magnétique automatique. Ensuite, centrifuger l'écoulement et resuspendre les culots dans la solution appropriée pour l'analyse expérimentale ultérieure prévue.

Le tri des cellules négatives pour CD45, CD31 et le récepteur de l'asialoglycoprotéine 1 permet de sélectionner les cellules progénitrices hépatiques, qui peuvent ensuite être regroupées selon leur expression de la glycoprotéine 38 et de CD133. Les cellules gp38 positives CD133 positives et les cellules gp38 négatives CD133 positives représentent les populations cellulaires les plus abondantes parmi les cellules CD45 négatives, CD31 négatives et ASGPR1 négatives dans le foie de souris adulte sain, avec des différences apparentes dans leur expression de divers marqueurs membranaires précédemment associés aux cellules progénitrices. L'isolement de ces cellules progénitrices par microbilles magnétiques, comme vient d'être démontré, permet d'obtenir une pureté supérieure à 90 % des cellules hépatiques, avec un degré de viabilité élevé.

Lorsqu'on cherche à isoler ces cellules rares, il est important de prendre en compte les enzymes utilisées lors des étapes de digestion hépatique, car différentes enzymes peuvent produire de façon privilégiée des sous-populations spécifiques de progéniteurs et réduire fortement les niveaux d'expression de CD133. Il est essentiel de garder à l'esprit que la pureté et le rendement cellulaires dépendent de la préparation douce des suspensions uniques de cellules hépatiques. En outre, une forte quantité de débris cellulaires et une contamination par des cellules mourantes peuvent nuire négativement au succès de ce protocole.