Fabrication de dispositifs microfluidiques à base de papier en trois dimensions pour les immunoessais

L’objectif global de ce protocole est de démontrer notre processus de fabrication de dispositifs tridimensionnels sur papier, que nous utilisons comme plate-forme pour développer des immunoessais au point de service. Cette méthode fournit une plate-forme microfluidique sur papier avec un processus de fabrication fiable, de sorte que le temps et les efforts peuvent être consacrés au développement de tests plutôt qu’à la conception de dispositifs. Le principal avantage de notre technique est qu’elle permet de préparer de nombreux appareils en parallèle et à une quantité souhaitable pour des projets de recherche académique.

En général, les nouveaux utilisateurs auront du mal à utiliser cette méthode car il y a de nombreuses variables à prendre en compte lors de la fabrication de dispositifs, comme l’alignement correct des couches. Les erreurs peuvent entraîner un dysfonctionnement des appareils. Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car l’assemblage peut être difficile à imaginer en utilisant uniquement les détails fournis dans les manuscrits.

Tout d’abord, préparez des couches de papier filtre qualitatif en découpant une feuille de papier dans un format de papier standard pour faciliter le motif à l’aide d’une imprimante à cire. Chargez une feuille de papier découpée dans le bac de l’imprimante. Imprimez ensuite les couches précédemment conçues.

Ensuite, coupez une rangée de membrane en nylon en feuilles à l’aide d’un coupe-papier de table, en prenant grand soin de manipuler la membrane en nylon pour maintenir son intégrité et la protéger contre les déchirures. Rangez tout matériau inutilisé dans une armoire à dessiccateur, car les membranes en nylon sont sensibles à l’humidité. À l’aide d’une imprimante à cire, imprimez un motif de couche de capture sur un morceau de papier à copier et collez-le sur une boîte à lumière pour servir de guide pour le positionnement de la membrane en nylon.

Ensuite, placez une feuille de papier propre sur la feuille de papier précédemment imprimée. Collez la feuille de papier propre sur la boîte à lumière, mais ne collez pas les deux feuilles ensemble. Maintenant, placez une feuille découpée de membrane en nylon sur la feuille de papier propre, en vous assurant que la membrane couvre la zone imprimée de la couche inférieure de papier de copie.

Collez les quatre côtés de la membrane en nylon sur la feuille de papier propre. Chargez une feuille de membrane en nylon soutenue par le papier de copie qui y est fixé dans le bac de l’imprimante à alimentation manuelle. Imprimez ensuite une feuille de membrane en nylon à la fois.

Collez les couches imprimées sur un cadre en acrylique pour un chauffage uniforme au-dessus et en dessous de la couche lorsqu’elle est placée dans un four à convection par gravité. Maintenant, placez les couches dans le four à 150 degrés Celsius pendant 30 secondes jusqu’à ce que la cire fonde dans l’épaisseur du papier. Après avoir sorti le papier du four, vérifiez que la cire a imprégné l’épaisseur du papier en le retournant et en vérifiant les imperfections du motif.

Retirez le papier et la membrane en nylon du cadre en acrylique. Retirez ensuite la membrane en nylon de la feuille de support du papier à copier à l’aide d’un coupe-papier. Modélisez des feuilles recto-verso de films adhésifs à l’aide d’un traceur à couteau robotisé avec des fichiers de conception préalablement préparés.

Ensuite, collez une couche de papier à motif qui doit être recouverte d’adhésif sur une boîte lumineuse avec le côté imprimé vers le bas. Décollez un côté de la doublure protectrice de la feuille de motif d’adhésif. Appuyez sur la feuille de motif d’adhésif et la couche de papier ensemble.

Placez ensuite l’appareil partiellement assemblé dans une gaine de protection. Ensuite, passez l’assemblage à deux couches résultant dans une plastifieuse automatisée pour presser complètement l’adhésif et le papier ensemble, en éliminant toutes les poches d’air des couches adjacentes. Collez une couche conjuguée sur un cadre en acrylique de sorte que la zone hydrophile à traiter soit suspendue et non en contact avec le cadre.

Ajoutez 2,5 microlitres de BSA et un X PBS à la zone hydrophile sur la couche conjuguée. Après avoir laissé sécher l’échantillon à température ambiante pendant deux minutes, séchez-le à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez cinq microlitres de cinq nanoparticules d’or colloïdal OD conjuguées à un anticorps anti-bêta hCG, puis répétez le processus de séchage.

Collez une couche de canal latéral sur un cadre en acrylique de sorte que la zone hydrophile à traiter soit suspendue et non en contact avec le cadre. Ajoutez 10 microlitres d’agent bloquant pour traiter le canal latéral, puis répétez le même processus de séchage que celui utilisé pour la couche conjuguée. Ensuite, collez une couche de capture sur un cadre en acrylique de sorte que la zone hydrophile à traiter soit suspendue et non en contact avec le cadre.

Traitez la couche de capture avec cinq microlitres d’anticorps anti-alpha hCG. Après avoir laissé sécher l’échantillon à température ambiante pendant deux minutes, séchez-le à 65 degrés Celsius pendant huit minutes. Ajoutez deux microlitres d’agent bloquant, puis répétez le même processus de séchage que celui utilisé pour la couche de capture.

Collez la couche de lavage sur la boîte à lumière avec le côté imprimé vers le haut. Si des trous d’alignement sont utilisés, retirez-les des couches suivantes à l’aide d’un outil de perforation à main. Retirez le film protecteur à l’arrière de la couche de capture pour exposer l’adhésif.

Alignez la couche de capture au-dessus de la couche de lavage en utilisant les trous d’alignement comme guide, puis appuyez sur les deux couches ensemble et évitez de toucher les zones hydrophiles pour minimiser la contamination ou les dommages à l’appareil. Ensuite, retirez le film protecteur à l’arrière de la couche d’incubation pour exposer l’adhésif. Alignez la couche d’incubation au-dessus de la couche de capture et pressez-les ensemble.

Continuez à ajouter des couches de cette manière jusqu’à ce que toutes les couches actives soient assemblées. Maintenant, placez l’appareil partiellement assemblé dans une glissière de protection et fixez fermement les couches ensemble à l’aide d’une plastifieuse. Retirez le film protecteur à l’arrière de la couche de lavage et fixez la couche de tache au bas de l’appareil.

Après le laminage pour terminer l’assemblage du dispositif microfluidique tridimensionnel à base de papier, découpez le nombre souhaité d’appareils dans des feuilles d’appareils entièrement assemblés à l’aide de ciseaux. Ajoutez 20 microlitres d’un échantillon de contrôle positif de tampon hCG dans la zone hydrophile sur le dessus de l’appareil. Une fois que l’échantillon s’est complètement infiltré dans l’appareil, ajoutez 15 microlitres de tampon de lavage.

Une fois que la première aliquote de tampon de lavage s’est complètement infiltrée dans l’appareil, ajoutez une deuxième aliquote de 15 microlitres de tampon de lavage. Pour révéler les résultats du test, décollez les trois couches supérieures de l’appareil à l’aide d’une pince à épiler pour exposer la couche de capture. La méthode d’impression à la cire peut être utilisée pour former des barrières hydrophobes dans des dispositifs microfluidiques à base de papier, et produit des voies fluidiques aux dimensions reproductibles, ce qui est essentiel pour les tests avec des performances et des durées reproductibles.

La performance de l’immunodosage sur papier hCG a été démontrée en effectuant 35 tests positifs et 35 tests négatifs en parallèle. Le coefficient de variation pour chaque ensemble de données a été déterminé à 1 % pour les essais effectués à partir d’échantillons négatifs et à 3 % pour les essais effectués à partir d’échantillons positifs. Un désalignement entre les couches comprenant le canal d’incubation et la zone de capture peut provoquer le développement d’un motif irrégulier dans le signal positif, ce qui peut entraîner une mauvaise interprétation du signal qualitatif.

Si la cire n’est pas imprimée en quantité suffisante ou si elle ne fond pas complètement sur l’épaisseur du papier, l’intégrité des barrières hydrophobes résultantes peut être compromise et entraîner des fuites à l’intérieur de l’appareil. Des tests qui prennent plus de temps que prévu peuvent indiquer un dysfonctionnement dans la fabrication d’un dispositif. Les dispositifs microfluidiques sur papier offrent aux chercheurs une plate-forme polyvalente pour développer des tests analytiques à faible coût.

Bien qu’il existe un certain nombre d’applications, l’approche que nous démontrons ici aboutit à une architecture générale de dispositif pour effectuer des immunoessais, qui sont essentiels dans le domaine de la santé. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de vérifier les imperfections pendant le processus de fabrication et avant de traiter les couches avec des réactifs biochimiques coûteux. Une fois maîtrisée, cette méthode, de l’impression des couches à l’assemblage des couches traitées, peut être utilisée pour préparer une feuille d’immunodosages fonctionnels en deux heures.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la fabrication de dispositifs tridimensionnels sur papier et être suffisamment à l’aise pour adapter cette plate-forme à d’autres types d’intérêts de test.