Fabrication de dispositifs microfluidiques à base de papier en trois dimensions pour les immunoessais

L'objectif général de ce protocole est de démontrer notre procédé de fabrication de dispositifs tridimensionnels à base de papier, que nous utilisons comme plateforme pour développer des immunodosages au point d’intervention. Cette méthode fournit une plateforme de microfluidique sur papier dotée d’un procédé de fabrication fiable, permettant ainsi de consacrer le temps et les efforts au développement des dosages plutôt qu’à la conception des dispositifs. Le principal avantage de notre technique est qu’elle permet de préparer simultanément un grand nombre de dispositifs, en quantité adaptée aux projets de recherche académique.

En général, les nouveaux utilisateurs éprouveront des difficultés avec cette méthode, car de nombreuses variables doivent être prises en compte lors de la fabrication des dispositifs, comme l'alignement correct des couches. Des erreurs peuvent entraîner des dispositifs qui ne fonctionnent pas correctement. Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car l'assemblage peut être difficile à imaginer uniquement à partir des détails fournis dans les articles scientifiques.

Tout d'abord, préparez des couches de papier filtre qualitatif en découpant une feuille d'origine en une taille standard pour faciliter le tracé à l'aide d'une imprimante à cire. Chargez une feuille découpée dans le bac de l'imprimante. Ensuite, imprimez les couches précédemment conçues.

Ensuite, découpez une rangée standard de membrane en nylon en feuilles à l'aide d'une guillotine de bureau, en prenant grand soin de manipuler la membrane de nylon afin de préserver son intégrité et d'éviter les déchirures. Conservez tout matériau inutilisé dans une armoire dessiccateur, car les membranes en nylon sont sensibles à l'humidité. À l'aide d'une imprimante à cire, imprimez un motif de couche de capture sur une feuille de papier ordinaire, puis fixez-la avec du ruban adhésif sur une tablette lumineuse afin de servir de guide pour positionner la membrane en nylon.

Ensuite, placez une feuille propre de papier copie sur la feuille déjà imprimée. Fixez la feuille propre de papier sur la boîte lumineuse, mais n’assemblez pas les deux feuilles avec du ruban adhésif. Placez maintenant une feuille découpée de membrane en nylon sur la feuille propre de papier copie, en veillant à ce que la membrane recouvre entièrement la zone imprimée de la couche inférieure de papier copie.

Collez les quatre côtés de la membrane en nylon sur une feuille propre de papier copie. Insérez une feuille de membrane en nylon, soutenue par le papier copie auquel elle est fixée, dans le bac d'alimentation manuel de l'imprimante. Ensuite, imprimez une feuille de membrane en nylon à la fois.

Fixez avec du ruban adhésif les couches imprimées sur un cadre en acrylique afin d'assurer un chauffage uniforme par le haut et par le bas de la couche lorsqu'il est placé dans un four à convection naturelle. Placez ensuite les couches dans le four à 150 degrés Celsius pendant 30 secondes, jusqu'à ce que la cire fonde et pénètre l'épaisseur du papier. Après avoir retiré le papier du four, vérifiez que la cire a bien traversé toute l'épaisseur du papier en le retournant et en examinant d'éventuelles imperfections dans le motif.

Retirez le papier et la membrane en nylon du cadre en acrylique. Ensuite, retirez la membrane en nylon de la feuille de support en papier copie à l’aide d’un coupe-papier. Découpez des feuilles doubles de films adhésifs selon un motif à l’aide d’un traceur de découpe robotisé et des fichiers de conception préalablement préparés.

Ensuite, fixez avec du ruban adhésif une couche de papier, qui doit être doublée d'un adhésif, sur une boîte lumineuse, côté imprimé vers le bas. Retirez un côté du film protecteur du feuillet adhésif. Appliquez fermement le feuillet adhésif sur la couche de papier.

Ensuite, placez le dispositif partiellement assemblé dans une gaine protectrice. Puis, faites passer l'assemblage à deux couches résultant dans un laminateur automatique afin de comprimer complètement l'adhésif et le papier ensemble, éliminant ainsi toutes les poches d'air entre les couches assemblées. Fixez une couche de conjugué sur un cadre en acrylique de sorte que la zone hydrophile à traiter soit suspendue et ne soit pas en contact avec le cadre.

Ajouter 2,5 µL de BSA et un X PBS dans la zone hydrophile de la couche de conjugué. Après avoir laissé sécher l'échantillon à température ambiante pendant deux minutes, le faire sécher à 65 °C pendant cinq minutes. Ensuite, ajouter 5 µL de nanoparticules d'or colloïdal à 5 OD conjuguées à un anticorps anti-β-hCG, puis répéter le processus de séchage.

Fixez une couche de canal latéral sur un cadre en acrylique de manière à ce que la zone hydrophile à traiter soit suspendue et ne soit pas en contact avec le cadre. Ajoutez 10 microlitres d'agent de blocage pour traiter le canal latéral, puis répétez le même processus de séchage utilisé pour la couche de conjugué. Ensuite, fixez une couche de capture sur un cadre en acrylique de manière à ce que la zone hydrophile à traiter soit suspendue et ne soit pas en contact avec le cadre.

Traitez la couche de capture avec cinq microlitres d'anticorps anti-hCG alpha. Après avoir laissé sécher l'échantillon à température ambiante pendant deux minutes, faites-le sécher à 65 degrés Celsius pendant huit minutes. Ajoutez deux microlitres d'agent bloquant, puis répétez le même processus de séchage utilisé pour la couche de capture.

Fixez la couche de lavage sur la boîte lumineuse avec le côté imprimé tourné vers le haut. Si des trous d'alignement sont utilisés, retirez-les des couches suivantes à l'aide d'un perforateur manuel. Retirez le film protecteur à l'arrière de la couche de capture afin d'exposer l'adhésif.

Alignez la couche de capture au-dessus de la couche de lavage en utilisant les trous d'alignement comme guide, puis appuyez fermement les deux couches l'une contre l'autre tout en évitant de toucher les zones hydrophiles afin de minimiser la contamination ou les dommages au dispositif. Ensuite, retirez le film protecteur à l'arrière de la couche d'incubation pour exposer l'adhésif. Alignez la couche d'incubation au-dessus de la couche de capture et appuyez-les ensemble.

Continuez à ajouter des couches de cette manière jusqu'à ce que toutes les couches actives soient assemblées. Placez maintenant le dispositif partiellement assemblé dans une gaine protectrice et fixez fermement les couches ensemble à l'aide d'un plastifieur. Retirez le film protecteur situé à l'arrière de la couche de lavage et fixez la couche de transfert à la partie inférieure du dispositif.

Après la stratification pour terminer l'assemblage du dispositif microfluidique tridimensionnel à base de papier, découper le nombre souhaité de dispositifs dans des feuilles de dispositifs entièrement assemblés à l'aide de ciseaux. Ajouter 20 microlitres d'un échantillon témoin positif de tampon hCG dans la zone hydrophile située au-dessus du dispositif. Une fois que l'échantillon a été entièrement absorbé par capillarité dans le dispositif, ajouter 15 microlitres de tampon de lavage.

Une fois que la première aliquote de tampon de lavage a complètement pénétré dans le dispositif, ajoutez une seconde aliquote de 15 microlitres de tampon de lavage. Pour révéler les résultats du test, retirez à l’aide de pinces les trois couches supérieures du dispositif afin d’exposer la couche de capture. La méthode d’impression à la cire peut être utilisée pour créer des barrières hydrophobes dans des dispositifs microfluidiques à base de papier et produit des voies fluidiques aux dimensions reproductibles, ce qui est essentiel pour des tests offrant des performances et des durées constantes.

Les performances du test immunologique sur papier basé sur l'hCG ont été démontrées en réalisant 35 tests positifs et 35 tests négatifs en parallèle. Le coefficient de variation pour chaque jeu de données s'est révélé être de 1 % pour les tests effectués avec des échantillons négatifs et de 3 % pour les tests effectués avec des échantillons positifs. Un mauvais alignement entre les couches composant le canal d'incubation et la zone de capture peut entraîner l'apparition d'un motif irrégulier dans le signal positif, ce qui peut conduire à une interprétation erronée du signal qualitatif.

Si la cire n'est pas imprimée en quantité suffisante ou si elle n'est pas laissée assez longtemps pour fondre complètement à travers l'épaisseur du papier, l'intégrité des barrières hydrophobes résultantes peut être compromise et entraîner des fuites au sein du dispositif. Des tests qui prennent plus de temps que prévu pour s'achever peuvent indiquer un dysfonctionnement dans la fabrication d'un dispositif. Les dispositifs microfluidiques à base de papier offrent aux chercheurs une plateforme polyvalente pour développer des tests analytiques peu coûteux et destinés au diagnostic au point d'intervention.

Bien qu'un certain nombre d'applications existent, l'approche que nous démontrons ici conduit à une architecture générale de dispositif permettant de réaliser des immunoessais, essentiels en santé. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de vérifier la présence d'imperfections au cours du processus de fabrication et avant de traiter les couches avec des réactifs biochimiques coûteux. Une fois maîtrisée, cette méthode, de l'impression des couches à l'assemblage des couches traitées, peut être utilisée pour préparer une feuille d'immunoessais fonctionnels en deux heures.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de fabriquer des dispositifs tridimensionnels à base de papier, et être suffisamment à l'aise pour adapter cette plateforme à d'autres types de tests d'intérêt.