Polydiméthylsiloxane-polycarbonate dispositifs microfluidiques pour cellulaire Migration Studies Sous Perpendiculaire chimique et Dégradés d'oxygène

L'objectif général de cette expérience est de mettre en place un dispositif microfluidique en polydiméthylsiloxane-polycarbonate afin d'étudier la migration de cellules de mammifères sous diverses combinaisons de gradients chimiques et d'oxygène perpendiculaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les études sur la migration cellulaire chez les mammifères, notamment les effets de ces gradients sur la migration de différents types de cellules ou de cellules présentant des gènes modifiés. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que l'ensemble du dispositif expérimental peut être utilisé dans une étuve classique, offrant ainsi des conditions optimales de culture cellulaire, sans installation fastidieuse ni instrumentation encombrante.

Les implications de cette technique s'étendent au diagnostic de la capacité de métastase des cellules cancéreuses, car la motilité cellulaire et les divers gradients liés aux paramètres physiologiques peuvent être caractérisés à l'aide du dispositif microfluidique. Cette méthode peut fournir des informations sur la migration des cellules de mammifères. Elle peut également être appliquée à d'autres études cellulaires, telles que les tests pharmacologiques in vitro fondés sur les cellules, portant sur des combinaisons de concentrations de médicaments et de tensions en oxygène.

Transférez deux grammes de polydiméthylsiloxane, ou prépolymère de PDMS, sur le moule présentant les motifs de canaux fluidiques de la couche supérieure afin d'obtenir une fine couche de PDMS. Ensuite, placez le moule dans un dispositif sous vide pour dégazer le PDMS pendant 60 minutes. Après le dégazage, laissez le moule toute la nuit dans un four à 60 degrés Celsius pour la polymérisation du PDMS.

Veillez à ce que le moule soit dans un plan horizontal. Après avoir refroidi le moule à température ambiante, versez 13 grammes supplémentaires de prépolymère de PDMS sur le moule, puis dégazez le PDMS dans l'ensemble dessiccateur pendant 60 minutes. Incorporez lentement un film de polycarbonate d'un millimètre d'épaisseur, ou film PC, dans la couche fraîche de PDMS afin de servir de barrière à la diffusion des gaz.

Expulsez toutes les bulles éventuelles. Ensuite, placez le moule dans l’étuve à 60 degrés Celsius pendant toute la nuit. Assurez-vous que le moule est positionné sur un plan horizontal.

Après avoir refroidi le PDMS polymérisé à température ambiante, découpez le dispositif à l’aide d’un scalpel sur une surface d’environ 5,5 par cinq centimètres carrés, suffisante pour couvrir tous les motifs de canal. Ensuite, décollez le labo en PDMS du moule. Puis, percez des trous pour les entrées et sorties à l’aide d’un poinçon biopsique de deux millimètres de diamètre.

Conserver la couche supérieure en PDMS-PC fabriquée à l'abri de la poussière ambiante en vue d'un assemblage ultérieur. Pour assembler le dispositif, placer d'abord la couche supérieure en PDMS-PC fabriquée et la tranche munie de la membrane en PDMS codée par centrifugation dans une machine de traitement de surface au plasma d'oxygène, les surfaces de collage étant orientées vers le haut. Traiter les surfaces en PDMS avec un plasma d'oxygène de 90 watts pendant 40 secondes.

Assembler la couche supérieure sur la membrane en PDMS immédiatement après le traitement de surface au plasma d'oxygène. Placer un poids sur le dessus des couches assemblées et les introduire dans une étuve à 60 degrés Celsius pendant toute la nuit pour favoriser l'adhésion. Une fois les couches assemblées refroidies à température ambiante, découper la membrane liée à la couche supérieure à l’aide d’un scalpel selon une surface d’environ 5,5 sur cinq centimètres carrés.

Détachez la structure assemblée du wafer de silicium et percez des trous aux entrées et sorties du canal de gradient chimique à l’aide d’un poinçon de biopsie de deux millimètres de diamètre. Ensuite, placez la couche supérieure avec la membrane assemblée et la couche inférieure en PDMS fabriquée dans l’appareil de traitement de surface au plasma d’oxygène, les surfaces d’assemblage orientées vers le haut. Pour activer les surfaces de PDMS, utilisez le plasma à 90 watts pendant 40 secondes.

Assemblez les couches supérieure et inférieure immédiatement après le traitement de surface pour assurer l'adhésion. Placez un poids sur l'ensemble du dispositif assemblé et laissez-le toute la nuit dans un four à 60 degrés Celsius. Le lendemain, retirez l'ensemble du dispositif fabriqué du four et laissez-le refroidir à température ambiante.

Commencez l'essai de migration cellulaire microfluidique par la préparation des cellules dans le dispositif, comme décrit dans le protocole écrit. Au jour deux, aspirez le milieu des cellules qui ont été cultivées depuis le jour zéro et lavez les cellules deux fois avec cinq millilitres de DPBS. Aspirez le DPBS et ajoutez deux millilitres de trypsine-EDTA, puis incubez les cellules dans l’incubateur pendant cinq minutes afin de détacher les cellules de la surface du flacon.

Une fois les cellules détachées et en suspension dans la solution, ajoutez huit millilitres de milieu sans sérum au flacon. Transférez tous les liquides dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez à 140 ×g pendant cinq minutes à température ambiante. Après la centrifugation, aspirez le surnageant et ajoutez une quantité appropriée de milieu sans sérum pour obtenir une densité cellulaire finale d'un million de cellules par millilitre.

Ensuite, sortez le dispositif microfluidique préparé le premier jour, tel que décrit dans le protocole textuel. Utilisez une seringue d'un millilitre munie d'une aiguille 14-ga suffisamment large pour injecter le milieu sans sérum à travers la sortie du canal de gradient chimique, jusqu'à ce que le milieu s'écoule par les deux aiguilles situées aux entrées. Ensuite, injectez 200 microlitres de la suspension cellulaire par la sortie du canal de gradient chimique.

Observer la chambre de culture cellulaire dans le dispositif sous un microscope afin de confirmer que les cellules ont été introduites dans le canal microfluidique. Ensuite, placer le dispositif dans un récipient humide et le maintenir dans une étuve de culture cellulaire pendant cinq heures pour favoriser l'adhérence des cellules à la surface du dispositif. Pendant ce temps, préparer le produit chimique à la concentration souhaitée dans un milieu sans sérum.

Prélevez le milieu sans sérum, avec et sans le produit chimique, dans deux seringues séparées de trois millilitres reliées à un tube de haute pureté. Ensuite, placez les seringues sur une pompe à seringue avec un débit de un microlitre par minute pour une utilisation ultérieure. Préparez ensuite 15 millilitres d'une solution d'hydroxyde de sodium à un molaire et 15 millilitres d'une solution de pyrogallol à 200 milligrammes par millilitre.

Aspirez la solution d'hydroxyde de sodium dans une seringue de 15 mL reliée à un tube en PFTE de haute pureté, et aspirez la solution de pyrogallol dans une seringue de 15 mL reliée à un tube de haute pureté. Placez les seringues sur une pompe à seringue avec un débit de 5 µL/min pour une utilisation ultérieure. Après l'incubation de cinq heures, retirez entièrement le dispositif et placez-le sur une boîte de Petri de 15 cm de diamètre.

Fixez le dispositif dans la boîte de Petri à l’aide d’une pâte adhésive, puis placez la boîte de Petri sous un microscope d’imagerie en temps réel équipé d’une enceinte d’incubation. Connectez les tubes provenant des seringues aux entrées du canal de gradient chimique afin de générer le gradient chimique. Ensuite, reliez la sortie au tube menant à un réservoir de déchets.

Activez la pompe à seringue munie des seringues destinées à la génération du gradient chimique. Ensuite, reliez le tube de haute pureté provenant des seringues contenant du chlorure de sodium et du pyrogallol aux entrées du canal de gradient d'oxygène. Connectez un tube à la sortie afin de recueillir les déchets, puis activez la pompe à seringue équipée des seringues destinées à la génération du gradient d'oxygène.

Ajoutez environ 15 millilitres d'eau doublement distillée dans la boîte de Pétri pour maintenir l'hydratation du dispositif. Ensuite, configurez le microscope d'imagerie en temps réel pour la capture d'images en laps de temps et prenez une image toutes les 15 minutes. Effectuez la collecte et l'analyse des données ainsi que la caractérisation des gradients comme décrit dans le protocole textuel.

Voici des résultats représentatifs de gradients chimiques générés dans le dispositif microfluidique pour la migration cellulaire. Le résultat de la simulation numérique correspond bien à la caractérisation expérimentale utilisant une solution de fluorescéine comme produit chimique. Les gradients d'autres composés chimiques, tels que la chimioattractine SDF-1 alpha, peuvent également être estimés préalablement à l'aide de la simulation.

Les gradients d'oxygène générés dans le dispositif peuvent être caractérisés expérimentalement à l'aide d'un colorant fluorescent sensible à l'oxygène. Typiquement, des gradients d'oxygène allant de 1 % en amont à 16 % en aval peuvent être stablement établis dans le dispositif. On observe ici des images typiques prises à intervalles de temps réguliers pendant les expériences, à l’aide d’un microscope d’imagerie de cellules vivantes.

Après l'analyse des images, les trajectoires de migration des cellules A549 et leurs déplacements moyens peuvent être calculés. En l'absence de gradients, les cellules présentent une migration aléatoire et le déplacement moyen est proche de zéro. En présence d'un gradient uniquement en chimiokine SDF-1 alpha, les cellules montrent un comportement chimiotactique et migrent vers la direction du gradient élevé en chimiokine, comme attendu.

Avec uniquement un gradient d'oxygène, les cellules migrent vers la zone à faible teneur en oxygène, manifestant un comportement aérotactique qui n'a pas été largement étudié chez les cellules de mammifères. Fait intéressant, en présence de gradients de chimiokine et d'oxygène, les cellules se déplacent vers la zone à faible concentration en oxygène, ce qui indique que le gradient d'oxygène exerce un effet prédominant. Cette observation nécessite des études supplémentaires.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien niveler l'appareil pendant la fabrication et d'éliminer les bulles d'air dans le dispositif microfluidique pendant l'expérience de migration cellulaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer un dispositif microfluidique en PDMS-PC et configurer les expériences afin d'étudier la migration des cellules de mammifères sous l'effet combiné de gradients chimiques et d'oxygène.