Polydiméthylsiloxane-polycarbonate dispositifs microfluidiques pour cellulaire Migration Studies Sous Perpendiculaire chimique et Dégradés d'oxygène

L’objectif global de cette expérience est d’établir un dispositif microfluidique polydiméthylsiloxane-polycarbonate pour la migration des cellules de mammifères sous diverses combinaisons de gradients chimiques et d’oxygène perpendiculaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les études sur la migration des cellules de mammifères, y compris les effets de ces gradients sur la migration de différents types de cellules ou de cellules avec des gènes ote. Le principal avantage de cette technique est que l’ensemble du dispositif expérimental peut être mené dans un incubateur conventionnel pour des conditions de culture cellulaire optimales sans configuration fastidieuse et instrumentation encombrante.

Les implications de cette technique se sont étendues au diagnostic de la capacité de métastases des cellules cancéreuses, car la motilité cellulaire et les divers gradients physiologiques peuvent être caractérisés à l’aide du dispositif microfluidique. Cette méthode peut fournir des informations sur la migration des cellules de mammifères. Il peut également être appliqué à d’autres études cellulaires telles que les tests de médicaments in vitro sur cellules sur les combinaisons de concentrations de médicaments et de tensions d’oxygène.

Transférez deux grammes de polydiméthylsiloxane, ou prépolymère PDMS sur le moule avec les motifs de canaux fluidiques de la couche supérieure pour former une fine couche de PDMS. Ensuite, placez le moule dans une configuration de dessiccateur pour dégazer le PDMS pendant 60 minutes. Après le dégazage, placez le moule pendant la nuit dans un four à 60 degrés Celsius pour le durcissement PDMS.

Assurez-vous que le moule est dans un plan horizontal. Après avoir refroidi le moule à température ambiante, versez 13 grammes supplémentaires de prépolymère PDMS sur le moule, puis dégazez le PDMS dans la configuration du dessiccateur pendant 60 minutes. Incorporez lentement un film de polycarbonate ou de PC d’un millimètre d’épaisseur dans la couche PDMS fraîche comme barrière de diffusion de gaz.

Expulsez toutes les bulles présentes. Ensuite, placez le moule dans le four à 60 degrés Celsius pendant la nuit. Assurez-vous que le moule est sur un plan horizontal.

Après avoir refroidi le PDMS durci à température ambiante, coupez l’appareil avec un scalpel à une zone d’environ 5,5 centimètres carrés sur cinq centimètres carrés qui peut couvrir tous les modèles de canaux. Ensuite, démoulez le laboratoire PDMS. Ensuite, percez des trous pour les entrées et les sorties à l’aide d’un poinçon de biopsie de deux millimètres de diamètre.

Stockez la couche supérieure PDMS-PC fabriquée à l’abri de la poussière ambiante pour un assemblage ultérieur. Pour assembler le dispositif, placez d’abord la couche supérieure PDMS-PC fabriquée et la plaquette avec la membrane PDMS codée en spin dans une machine de traitement de surface à plasma d’oxygène, les surfaces de liaison vers le haut. Traitez les surfaces PDMS avec 90 watts de plasma d’oxygène pendant 40 secondes.

Collez la couche supérieure sur la membrane PDMS immédiatement après le traitement de surface au plasma d’oxygène. Placez un poids sur le dessus des couches collées et mettez-les dans un four à 60 degrés Celsius pendant la nuit pour favoriser la liaison. Une fois que les couches collées ont refroidi à température ambiante, coupez la membrane collée à la couche supérieure avec un scalpel sur une zone d’environ 5,5 centimètres carrés sur cinq.

Écaillez la structure collée de la plaquette de silicium et percez des trous aux entrées et sorties du canal à gradient chimique à l’aide d’un poinçon de biopsie de deux millimètres de diamètre. Ensuite, placez la couche supérieure liée à la membrane et la couche inférieure PDMS fabriquée dans la machine de traitement de surface au plasma d’oxygène, les surfaces de liaison vers le haut. Pour activer les surfaces PDMS, utilisez le plasma à 90 watts pendant 40 secondes.

Fixez les couches supérieure et inférieure ensemble pour le collage immédiatement après le traitement de surface. Placez le poids sur l’ensemble de l’appareil collé et laissez-le passer la nuit dans un four à 60 degrés Celsius. Le lendemain, sortez l’ensemble de l’appareil fabriqué du four et refroidissez-le à température ambiante.

Commencer l’essai de migration cellulaire microfluidique en préparant les cellules dans le dispositif comme décrit dans le protocole textuel. Le deuxième jour, aspirez le milieu des cellules qui ont été cultivées depuis le jour zéro et lavez les cellules avec cinq millilitres de DPBS deux fois. Aspirez le DPBS et ajoutez deux millilitres de trypsine-EDTA, puis incubez les cellules dans l’incubateur pendant cinq minutes pour détacher les cellules de la surface du ballon.

Une fois les cellules détachées et suspendues dans la solution, ajoutez huit millilitres de milieu sans sérum dans le ballon. Transférez tous les liquides dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez-le à 140 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Après la centrifugation, aspirez le surnageant et ajoutez une quantité appropriée de milieu sans sérum pour une densité cellulaire finale d’un million de cellules par millilitre.

Ensuite, sortez le dispositif microfluidique préparé le premier jour comme décrit dans le protocole texte. Utilisez une seringue d’un millilitre avec une aiguille émoussée de calibre 14 pour injecter le milieu sans sérum par la sortie du canal à gradient chimique jusqu’à ce que le milieu s’écoule des deux aiguilles à l’entrée. Ensuite, injectez 200 microlitres de suspension cellulaire à partir de la sortie du canal à gradient chimique.

Observez la chambre de culture cellulaire de l’appareil au microscope pour confirmer que les cellules ont été introduites dans le canal microfluidique. Ensuite, placez l’appareil dans un récipient humide et conservez-le dans un incubateur de culture cellulaire pendant cinq heures pour favoriser l’adhésion des cellules sur la surface de l’appareil. Pendant ce temps, préparez le produit chimique à la concentration souhaitée dans un milieu sans sérum.

Prélevez le milieu sans sérum avec et sans le produit chimique dans deux seringues distinctes de trois millilitres reliées à la tubulure de haute pureté. Ensuite, installez les seringues sur un tire-seringue avec un débit d’un microlitre par minute pour une utilisation ultérieure. Ensuite, préparez 15 millilitres d’une solution d’hydroxyde de sodium d’une molaire et 15 millilitres de solution de pyrogallol de 200 milligrammes par millilitre.

Aspirez la solution d’hydroxyde de sodium dans une seringue de 15 millilitres reliée à un tube PFTE de haute pureté et aspirez la solution de pyrogallol dans une seringue de 15 millilitres reliée à un tube de haute pureté. Installez les seringues sur une pompe à seringue avec un débit de cinq microlitres par minute pour une utilisation ultérieure. Après l’incubation de cinq heures, retirez l’ensemble de l’appareil et placez-le sur une boîte de Pétri de 15 centimètres de diamètre.

Fixez l’appareil dans la boîte de Pétri à l’aide d’un mastic adhésif, puis transférez la boîte de Pétri dans un microscope d’imagerie à cellules vivantes dans un incubateur. Connectez le tube des seringues aux entrées du canal de gradient chimique pour la génération du gradient chimique. Ensuite, connectez la sortie au tube qui mène à un réservoir de déchets.

Allumez le pousse-seringue avec les seringues pour la génération de gradient chimique. Ensuite, connectez le tube de haute pureté des seringues contenant du chlorure de sodium et du pyrogallol aux entrées du canal de gradient d’oxygène. Connectez le tube à la sortie pour collecter les déchets et allumez le pousse-seringue avec les seringues pour la génération de gradient d’oxygène.

Ajoutez environ 15 millilitres d’eau doublement distillée dans la boîte de Pétri pour garder l’appareil hydraté. Ensuite, installez le microscope d’imagerie à cellules vivantes pour la capture d’images en accéléré et prenez une image toutes les 15 minutes. Effectuer la collecte et l’analyse de données ainsi que la caractérisation des gradients comme décrit dans le protocole texte.

Voici des résultats représentatifs des gradients chimiques générés dans le dispositif microfluidique pour la migration cellulaire. Le résultat de la simulation numérique concorde bien avec la caractérisation expérimentale utilisant une solution de fluorescéine comme produit chimique. Les gradients d’autres produits chimiques tels que la chimiokine SDF-1 alpha peuvent également être estimés à l’avance à l’aide de la simulation.

Les gradients d’oxygène générés à l’intérieur du dispositif peuvent être caractérisés expérimentalement à l’aide d’un colorant de fluorescence sensible à l’oxygène. En règle générale, des gradients d’oxygène de 1 % en amont à 16 % en aval peuvent être établis de manière stable à l’intérieur du dispositif. Voici des images typiques recueillies au cours des expériences à l’aide d’un microscope imageur à cellules vivantes.

Après l’analyse de l’image, les trajectoires de migration des cellules A549 et leurs mouvements moyens peuvent être calculés. En l’absence de gradients, les cellules présentent une migration aléatoire et le mouvement moyen est proche de zéro. Avec seulement un gradient de chimiokines alpha SDF-1, les cellules présentent un comportement chimiotactique et migrent vers la direction à gradient de chimiokines élevé comme prévu.

Avec seulement un gradient d’oxygène, les cellules se déplacent vers la direction à faible teneur en oxygène, montrant un comportement aérotactique qui n’a pas été bien étudié pour les cellules de mammifères. Il est intéressant de noter qu’avec les gradients de chimiokines et d’oxygène, les cellules se déplacent vers le gradient de faible teneur en oxygène, ce qui montre que le gradient d’oxygène a des effets dominants. Cette observation nécessite une étude plus approfondie.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de bien niveler le dispositif pendant la fabrication et d’éliminer les bulles d’air dans la configuration du dispositif microfluidique pendant l’expérience de migration cellulaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation d’un dispositif microfluidique PDMS-PC et de la configuration des expériences pour étudier la migration des cellules de mammifères sous des combinaisons de gradients chimiques et d’oxygène.