Biosensing Potentiel de membrane de neurones moteurs dans les embryons vivants de zébrés

L'objectif général de cette procédure est d'étudier les propriétés électriques des cellules excitable dans des conditions physiologiques non invasives en utilisant des embryons de poisson zèbre associés à un indicateur génétique de voltage basé sur la FRET. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la biologie des cellules excitable, telles que les neurones. Par exemple, cette méthode peut être utilisée pour analyser le rôle de l'excitabilité dans la pathogenèse des troubles neurologiques.

Cette approche utilise des embryons de zebrafish transparents exprimant des indicateurs génétiquement codés de potentiel basés sur la FRET. Elle permet de mesurer les propriétés électriques des cellules in vivo de manière non invasive. Ainsi, cette méthode peut fournir des informations sur l'excitabilité des neurones de la moelle épinière chez les embryons de zebrafish.

Il peut également être appliqué à d'autres systèmes in vitro ou in vivo compatibles avec des études d'imagerie. Pour commencer cette procédure, préparez le mélange de PCR afin d'amplifier la séquence codante du biocapteur Mermaid. Chauffez le mélange de PCR pendant 15 secondes à 95 degrés Celsius.

Préchauffez-le pendant 15 secondes à 50 degrés Celsius, puis allongez-le pendant quatre minutes à 72 degrés Celsius, pour un total de 35 cycles. Ensuite, purifiez sur gel le produit PCR contondant spécifique à l’aide d’un kit commercial de purification sur gel. Puis, clonez l’insert d’ADN dans le vecteur contondant pCMV-SC et linéarisez le plasmide positif pour Mermaid à l’aide de l’enzyme de restriction SmaI, afin d’insérer le promoteur HuC.

Préparez la réaction de restriction dans un volume total de 20 microlitres et incubez la réaction à 25 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, purifiez le plasmide digéré par électrophorèse sur gel à l’aide d’un kit commercial de purification de gel. Puis, amplifiez par PCR le promoteur HuC en utilisant la polymérase PFU et l’ADN génomique de poisson zèbre comme matrice.

Préparez le mélange de PCR. Après une étape initiale de deux minutes à 95 degrés Celsius, chauffez le mélange de PCR pendant 15 secondes à 95 degrés Celsius. Amorcez-le pendant 15 secondes à 50 degrés Celsius et allongez-le pendant quatre minutes à 72 degrés Celsius, pour un total de 35 cycles.

Ensuite, purifiez par électrophorèse sur gel le produit PCR contondant spécifique. Liguez une quantité équimolaire du pCMV-SC Mermaid purifié et de l'ADN pHuC en utilisant un microlitre de ligase T4 de l'ADN et un microlitre du tampon spécifique 10x dans un volume total de 10 microlitres. Incubez ensuite la réaction pendant 16 heures à quatre degrés Celsius.

Transformer un aliquot de cellules compétentes avec cinq microlitres de la réaction de ligation. Sélectionner les clones positifs pour pHuC avec le promoteur inséré dans l'orientation correcte par une double digestion CEL1-EcoRV. Transférer les clones dans des tubes de 15 millilitres et les incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit.

Ensuite, extraire le plasmide des cellules et préparer la double réaction de restriction CEL1-EcoRV en incubant à 37 degrés Celsius pendant une heure. Puis, faire migrer les réactions sur un gel d'agarose. Dans cette procédure, transférer les œufs fécondés obtenus à partir de zebrafish adultes de type sauvage ou sod1G93R vers une boîte de Pétri de 10 millimètres.

Rincez les embryons dans de l’eau froide pour poissons. Ensuite, injectez-les immédiatement par microinjection dans le vitellus avec 200 picogrammes de plasmide pHuC-Mermaid. Puis transférez les embryons dans une boîte de Pétri et incubez-les dans de l’eau pour poissons à 28 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade de développement souhaité pour les analyses suivantes.

Pour une analyse de l'enroulement spontané de la queue, transférez les embryons dans une boîte de Pétri ronde de 90 millimètres remplie d'eau pour poisson contenant 0,2 % de DMSO. Décortiquez-les manuellement à l'aide de deux paires de pinces de bijoutier à extrémités pointues ou d'aiguilles. Incubez ensuite les embryons pendant cinq minutes à 28 degrés Celsius.

À l'aide d'une caméra numérique montée sur un stéréomicroscope, détecter l'enroulement de la queue à température ambiante pendant un enregistrement vidéo d'une minute. Ensuite, acquérir la série temporelle avec une résolution temporelle de 30 images par seconde. Puis calculer la fréquence des enroulements spontanés de la queue en comptant le nombre de courbures par unité de temps.

Pour évaluer l'effet du médicament riluzole, transférez les embryons dans une nouvelle boîte de Pétri de 90 millimètres remplie d'eau pour poisson contenant cinq micromoles de riluzole. Incubez ensuite les embryons pendant cinq minutes à 28 degrés Celsius avant d'enregistrer une vidéo d'une minute et de procéder à l'analyse comportementale. Placez maintenant les embryons âgés de 20 à 24 hpf dans de l'agarose à point de fusion bas à un pour cent dans de l'eau pour poisson, à l'intérieur d'une boîte d'imagerie de 35 millimètres à fond en verre, à 37 degrés Celsius.

Placer les embryons sur le côté et attendre que l'agarose durcisse à température ambiante. Ensuite, transférer la boîte d'imagerie sur la platine d'un microscope confocal. Identifier les motoneurones exprimant le biocapteur en excitant le Umikinoko-Vert monomérique avec un laser à argon de 488 nanomètres.

Ensuite, réglez son émission entre 495 et 525 nanomètres et appuyez sur enregistrer. Pour une mesure FRET, excitez mUKG, le donneur de la paire FRET, à l’aide du laser de 488 nanomètres. Détectez simultanément à l’aide de deux photomultiplicateurs la fluorescence émise par le donneur et la fluorescence émise par l’accepteur monomérique Kusibira-Orange.

Au début de l'expérience, optimisez le gain et le décalage du photomultiplicateur un où la fluorescence mUKG est enregistrée, et maintenez-les constants tout au long de la session. Pour régler le décalage, modifiez la couleur de l'image en fonction des valeurs d'intensité en utilisant la table de correspondance Q. Lors de la numérisation avec le laser éteint, utilisez le curseur de décalage afin que les pixels du fond aient une intensité légèrement supérieure à zéro.

À l'aide de la même table de correspondance, allumez le laser. Pendant la numérisation, utilisez le curseur de gain pour maximiser le rapport signal/bruit, en prenant soin d'éviter les pixels saturés. Dans la fenêtre d'acquisition du logiciel, sélectionnez le mode d'acquisition xyt et une taille de champ d'image de 512 par 64 pixels dans le menu déroulant.

Ensuite, configurez l'enregistrement des variations du potentiel membranaire des neurones spinaux de l'embryon afin d'acquérir un seul plan XY toutes les 30 millisecondes pendant une minute. Pour évaluer l'effet de l'administration de riluzole sur la dépolarisation membranaire dans le même neurone, acquérez un nouveau jeu de données cinq minutes après l'ajout d'eau de poisson contenant 5 micromolaire de riluzole. Dans ce film, des flexions spontanées, réponses motrices constituées exclusivement d'une contraction du corps entier rapprochant l'extrémité de la queue de la tête, ont été enregistrées au stade de 20 à 24 hpf dans un milieu de poisson ordinaire.

Ce film montre les enroulements spontanés d'un embryon après incubation dans du riluzole à cinq micromolaire. Afin de tester si des modifications de l'activité électrique des motoneurones spinaux étaient à l'origine des changements induits par le riluzole dans la fréquence des enroulements spontanés, le potentiel membranaire des motoneurones spinaux de l'embryon a été étudié d'une manière entièrement non invasive en mesurant le rapport d'intensité de fluorescence de la paire FRET donneur-accepteur du biocapteur Mermaid. Les motoneurones spinaux primaires exprimant le biocapteur ont été identifiés et leurs activités spontanées de dépolarisation basale ont été enregistrées.

Conjointement à la réduction de la fréquence des mouvements de recourbement de la queue, l'administration de riluzole a diminué la fréquence des événements de dépolarisation spontanée. Une fois maîtrisée, cette approche permettra aux chercheurs d'étudier les propriétés électriques des réseaux neuronaux d'embryons intacts, préservant ainsi intégralement la complexité des interactions entre les cellules dans le système fonctionnel en développement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment l'activité électrique des neurones de la moelle épinière est corrélée à la fréquence des recourbements spontanés de la queue.