Biosensing Potentiel de membrane de neurones moteurs dans les embryons vivants de zébrés

L’objectif global de cette procédure est d’étudier les propriétés électriques des cellules excitables dans des conditions physiologiques non invasives en utilisant des embryons de poisson-zèbre avec un GEVI basé sur FRET. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la biologie des cellules excitables telles que les neurones. Par exemple, ces méthodes peuvent être utilisées pour analyser le rôle de l’excitabilité dans la pathogenèse des troubles neurologiques.

Cette approche utilise des embryons de poisson-zèbre transparents exprimant des indicateurs de tension génétiquement codés basés sur le FRET. L’approche permet de mesurer les propriétés électriques des cellules in vivo de manière non invasive. Cette méthode peut donc donner un aperçu de l’excitabilité des neurones spinaux chez les embryons de poisson-zèbre.

Il peut également être appliqué à d’autres systèmes in-vitro ou in-vivo se prêtant à des études d’imagerie. Pour commencer cette procédure, préparez le mélange PCR afin d’amplifier la séquence codante du biocapteur de sirène. Chauffez le mélange PCR pendant 15 secondes à 95 degrés Celsius.

Amorcez-le pendant 15 secondes à 50 degrés Celsius et allongez-le pendant quatre minutes à 72 degrés Celsius pour un total de 35 cycles. Après ce gel, purifiez le produit PCR contondant spécifique à l’aide d’un kit de purification de gel commercial. Ensuite, clonez le fragment d’ADN dans le vecteur contondant pCMV-SC et linéarisez le plasmide positif à la sirène avec l’enzyme de restriction SmaI pour l’insertion du promoteur HuC.

Installez la réaction de restriction dans un volume total de 20 microlitres et incubez la réaction à 25 degrés Celsius pendant une heure. Par la suite, le gel purifie le plasmide digéré à l’aide d’un kit de purification de gel commercial. Ensuite, la PCR amplifie le promoteur HuC avec l’ADN polymérase PFU et l’ADN génomique du poisson-zèbre comme modèle.

Configurez le mélange PCR. Après une première étape de deux minutes à 95 degrés Celsius, chauffez le mélange PCR pendant 15 secondes à 95 degrés Celsius. Amorcez-le pendant 15 secondes à 50 degrés Celsius et allongez-le pendant quatre minutes à 72 degrés Celsius pour un total de 35 cycles.

Ensuite, le gel purifie le produit PCR émoussé spécifique. Comparez une quantité équimolaire de l’ADN purifié de la sirène pCMV-SC et du pHuC à l’aide d’un microlitre d’ADN ligase T4 et d’un microlitre du tampon Specific 10x dans un volume total de 10 microlitres. Ensuite, incubez la réaction pendant 16 heures à quatre degrés Celsius.

Transformer une aliquote de cellules compétentes avec cinq microlitres de réaction de ligature. Sélectionnez les clones pHuC-positifs avec le promoteur inséré dans la bonne orientation par une double digestion CEL1-EcoRV. Transférez les clones dans des tubes de 15 millilitres et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant la nuit.

Après cela, extrayez le plasmide des cellules et mettez en place la réaction de double restriction CEL1-EcoRV et incubez-le à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, exécutez les réactions sur un gel d’agarose. Dans cette procédure, transférez les œufs fécondés obtenus à partir du poisson zèbre adulte de type sauvage ou sod1G93R dans une boîte de Pétri de 10 millimètres.

Rincez les embryons dans de l’eau froide de poisson. Ensuite, micro-injectez-les immédiatement dans le jaune avec 200 picogrammes de plasmide pHuC-Mermaid. Ensuite, transférez les embryons dans une boîte de Pétri et incubez-les dans de l’eau de poisson à 28 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade de développement souhaité pour les analyses suivantes.

Pour une analyse spontanée de l’enroulement de la queue, transférez les embryons dans une boîte de Pétri ronde de 90 millimètres remplie d’eau de poisson contenant 0,2 % de DMSO. Et déchoionnez-les manuellement à l’aide de deux pinces de bijoutier à pointes pointues ou aiguilles. Ensuite, incubez les embryons pendant cinq minutes à 28 degrés Celsius.

À l’aide d’un appareil photo numérique monté sur un stéréomicroscope, détectez l’enroulement de la queue à température ambiante pendant un enregistrement vidéo d’une minute. Ensuite, acquérez la série chronologique à une résolution temporelle de 30 images par seconde. Calculez ensuite la fréquence des enroulements spontanés de la queue en comptant le nombre de courbures par unité de temps.

Pour évaluer l’effet du médicament riluzole, transférez les embryons dans une nouvelle boîte de Pétri de 90 millimètres remplie d’eau de poisson contenant cinq micromolaires de riluzole. Ensuite, incubez les embryons pendant cinq minutes à 28 degrés Celsius avant d’enregistrer une vidéo d’une minute et d’effectuer l’analyse comportementale. Montez maintenant les embryons de 20 à 24 hpf dans une agarose à bas point de fusion d’un pour cent dans de l’eau de poisson à l’intérieur d’une parabole d’imagerie à fond de verre de 35 millimètres à 37 degrés Celsius.

Orientez les embryons sur le côté et attendez que l’agarose se solidifie à température ambiante. Ensuite, transférez la parabole d’imagerie sur la platine d’un microscope confocal. Identifiez les motoneurones exprimant le biocapteur en excitant le monomère Umikinoko-Green avec un laser argon de 488 nanomètres.

Réglez ensuite son émission entre 495 et 525 nanomètres et appuyez sur enregistrer. Pour une mesure FRET excitez mUKG, le donneur de la paire Fret, avec le laser de 488 nanomètres. L’utilisation simultanée de deux photomultiplicateurs permet de détecter la fluorescence émise par le donneur et la fluorescence émise par l’accepteur monomère Kusibira-Orange.

Au début de l’expérience, optimisez le gain et le décalage du photomultiplicateur, où la fluorescence mUKG est enregistrée, et maintenez-les constantes tout au long de la session. Pour définir le décalage, modifiez la couleur de l’image en fonction des valeurs d’intensité à l’aide de la table de correspondance Q. Lors du balayage avec le laser désactivé, utilisez le curseur de décalage afin que les pixels d’arrière-plan aient une intensité légèrement supérieure à zéro.

À l’aide de la même table de correspondance, allumez le laser. Pendant le balayage, utilisez le curseur de gain pour maximiser le rapport signal/bruit, en prenant soin d’éviter les pixels saturés. Dans la fenêtre d’acquisition de logiciels, sélectionnez le mode d’acquisition xyt et une taille de champ d’image de 512 x 64 pixels dans le menu déroulant.

Ensuite, réglez l’enregistrement des changements de tension des neurones spinaux embryonnaires pour acquérir un seul plan XY toutes les 30 millisecondes pendant une minute. Pour évaluer l’effet de l’administration de riluzole sur la dépolarisation membranaire dans le même neurone, acquérir un nouvel ensemble de données cinq minutes après l’ajout d’eau de poisson contenant cinq micromolaires de riluzole. Dans ce film, des enroulements spontanés, des réponses motrices qui consistent exclusivement en une contraction de tout le corps amenant le bout de la queue vers la tête ont été enregistrés au stade de 20 à 24 hpf dans un milieu de poisson régulier.

Ce film montre les enroulements spontanés d’un embryon suite à l’incubation dans cinq riluzole micromolaires. Pour tester si les altérations de l’activité électrique des motoneurones spinaux étaient à la base des changements induits par le réluzole dans la fréquence d’enroulement spontanée, le potentiel membranaire dans les motoneurones spinaux embryonnaires a été étudié de manière totalement non invasive en mesurant le rapport d’intensité de fluorescence de la paire FRET donneur-accepteur du biocapteur Mermaid. Les motoneurones spinaux primaires exprimant le biocapteur ont été identifiés et leurs activités de dépolarisation spontanée basale ont été enregistrées.

Parallèlement à la réduction de la fréquence des mouvements d’enroulement de la queue, l’administration de riluzole a réduit la fréquence des événements de dépolarisation spontanée. Une fois maîtrisée, cette approche permettrait aux chercheurs d’étudier les propriétés électriques des réseaux neuronaux d’embryons intacts, ce qui préserve pleinement la complexité des interactions entre les cellules du système fonctionnel en développement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la corrélation entre l’activité électrique des neurones de la colonne vertébrale et la fréquence des enroulements spontanés de la queue.