Utilisation de la biologie synthétique à l'ingénieur cellules vivantes Interface avec les matériaux programmables

L’objectif global de ces procédures est d’utiliser E. coli synthétiquement conçu pour contrôler et manipuler les surfaces de matériaux programmables en combinant des stratégies de modification génétique et de fonctionnalisation de surface. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans des domaines tels que la médecine moléculaire et la surveillance de l’environnement. En utilisant des cellules génétiquement programmées pour interpréter un environnement local et modifier un matériau fonctionnalisé en conséquence, nous fournissons un outil modulaire pour une grande variété d’applications.

Le principal avantage de cette technique est que les cellules vivantes sont capables d’agir comme des capteurs dynamiques capables de lire, de traiter et d’enregistrer les conditions qui les entourent via des interfaces fonctionnalisées. Après avoir préparé les solutions et recueilli le surnageant enrichi en biotine d’E. coli producteur de biotine, conformément au protocole textuel, ajoutez 1,4 microlitre de solution SPDP à 20 microlitres de solution de streptavidine ou de SA. Enveloppez le tube dans une feuille d’aluminium et incubez-le à température ambiante pendant une heure et demie pour permettre au réticulant SPDP de se lier à l’AS par l’intermédiaire d’un groupe aminés, formant un AS activé par le pyridyldithio. Après l’incubation, ajoutez 2,4 microlitres de solution de DTT dans le tube et incubez l’échantillon à température ambiante pendant une heure pour permettre un clivage de la pyridine-2-thione entraînant une SA activée par le sulfhydryle. Ensuite, ajoutez 7,5 microlitres de solution SCC à 72 microlitres de solution HRP, enveloppez-le dans du papier d’aluminium et incubez-le à température ambiante pendant une heure et demie.

Il en résulte une HRP activée par le maléimide liée à un groupe amine. Mélangez 17 microlitres de solution de biotine LC-LC avec 200 microlitres de solution BSA, enveloppez le tube dans une feuille d’aluminium et incubez l’échantillon à température ambiante pendant une heure et demie. Cette étape permet à la biotine de se conjuguer à la BSA via une liaison amide.

Transférer la solution SA-SPDP, la solution HRP-SMCC et la solution de biotine conjuguée BSA dans des concentrateurs centrifuges séparés dans des tubes de spin. Centrifugez le SA-SPDP à 10 000 fois g jusqu’à ce que le volume du tube atteigne 100 microlitres ou pendant 16 minutes, puis remplissez le tube de centrifugation à 500 microlitres à l’aide de PBS-EDTA avant de répéter l’essorage et l’ajout de PBS-EDTA cinq fois de plus. Après avoir fait tourner la solution à 100 microlitres, conservez le bouillon à quatre degrés Celsius.

Pour le HRP SMCC, centrifugez les tubes à 10 000 fois g jusqu’à ce que le volume atteigne 25 microlitres ou pendant 16 minutes. Remplissez le tube de spin à 4500 microlitres à l’aide de PBS avant de répéter l’essorage et l’ajout de PBS cinq fois de plus. Après avoir fait tourner la solution à 100 microlitres, conservez le bouillon à quatre degrés Celsius.

Pour la biotine BSA, centrifugez l’échantillon à 10 000 fois g jusqu’à ce que le volume atteigne 100 microlitres ou pendant 12 minutes, puis remplissez le tube de centrifugation à 500 microlitres en utilisant du PBS. Après avoir répété la rotation et l’ajout de PBS quatre fois de plus, centrifugez le tube jusqu’à ce que le volume atteigne 100 microlitres ou pendant 12 minutes, puis ajoutez 100 microlitres de PBS dans le tube et stockez le stock à quatre degrés Celsius. Ensuite, combinez 25 microlitres de la HRP de 10 milligrammes par millilitre avec 25 microlitres de solution SA de 10 milligrammes par millilitre et stockez le tube à quatre degrés Celsius pendant la nuit, puis préparez deux aliquotes de biotine BSA dans du PBS en ajoutant 10 microlitres de biotine BSA à 490 microlitres de PBS.

Pipeter 100 microlitres de la solution dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Enveloppez l’assiette dans du papier d’aluminium et incubez-la à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de 05 %Tween 80 et BPS dans les puits.

Incuber la plaque à température ambiante pendant deux minutes, puis aspirer et décanter le liquide. Après avoir répété le lavage trois fois, ajoutez 200 microlitres de la solution de tubage à 0,5 % dans chacun des puits, puis incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après une autre série de lavages comme précédemment, mélangez 12 millilitres de solution de boyau 05 % avec 7,5 microlitres de 05 % Tween 80, puis utilisez cette solution pour diluer la solution mère SA-HRP un à 10 000.

Pipeter 80 microlitres de SA-HRP dilué dans chaque puits d’une plaque à 96 puits, puis ajouter 20 microlitres de l’échantillon de biotine préparé dans chaque puits de la plaque. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius pendant une heure. Cette étape permet une liaison compétitive entre la biotine libre et la biotine BSA immobilisée pour les sites de liaison SA-HRP.

Ensuite, après avoir lavé la plaque trois fois comme précédemment, préparez une solution de 20 millilitres d’acétate de sodium 50 millimolaires, de 1 % de TMB et de 3 % de peroxyde d’hydrogène dans un rapport de 1 000 à 10 pour un. Ajoutez 200 microlitres de la solution dans chaque puits de la plaque, enveloppez-la dans du papier d’aluminium et incubez-la à température ambiante pendant 15 minutes. Pipetez 50 microlitres de deux molaires d’acide sulfurique dans chaque puits pour arrêter la réaction, puis utilisez un lecteur de plaque pour mesurer l’OD 450.

Après la préparation des solutions selon le protocole de texte, ajoutez 7,5 microlitres de biotine LC-LC à 72 microlitres de HRP. Enveloppez la solution dans du papier d’aluminium et incubez l’échantillon à température ambiante pendant une heure et demie en l’agitant. Cette étape provoque la conjugaison de la biotine à la HRP via une liaison amide.

Transférez la solution dans un concentrateur centrifuge à l’intérieur d’un tube de centrifugation et centrifugez la solution à 10 000 fois g jusqu’à ce que le volume atteigne 100 microlitres ou pendant 12 minutes, puis utilisez du PBS pour remplir le tube de centrifugation à 500 microlitres et répétez la centrifugation et l’ajout de tampon quatre fois. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de 0,17 microgramme par millilitre de SA dans PBS dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Enveloppez l’assiette dans du papier d’aluminium et incubez-la à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Pour laver les puits de la plaque, pipetez 200 microlitres de 05 %Tween 80 dans chaque puits. Incuber la plaque à température ambiante pendant deux minutes et décanter le liquide. Après avoir répété le lavage trois fois de plus, ajoutez 200 microlitres de la solution de tubage à 0,5 % dans les puits.

Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant une heure avant de laver les puits trois fois comme auparavant. À l’aide de la solution de biotine HRP lavée et concentrée préalablement préparée, diluez la solution mère de biotine HRP de un à 10 000, puis ajoutez 80 microlitres de la solution dans les puits d’une plaque de 96 puits. Ajouter 20 microlitres d’échantillon de biotine préparé dans chaque puits de la plaque et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant une heure pour permettre une liaison compétitive entre la biotine libre et la biotine HRP pour les sites de liaison SA immobilisés.

Après avoir lavé les puits trois fois comme précédemment, préparez une solution de 20 millilitres d’acétate de sodium à 50 millimolaires, de 1 % de TMV et de peroxyde d’hydrogène à 3 % dans un rapport de 1 000 à 10 pour un. Ajoutez 200 microlitres de la solution dans chaque puits de la plaque, couvrez-le de papier d’aluminium et incuberez-le à température ambiante pendant 15 minutes, puis ajoutez 50 microlitres de deux molaires d’acide sulfurique dans chaque puits pour arrêter la réaction. Enfin, utilisez un lecteur de plaques pour mesurer l’OD 450.

Les cellules inductibles d’E. coli MG1655 de type sauvage ont été cultivées et surveillées dans un milieu minimal ainsi que dans un milieu minimal complété par du DTB et/ou de l’IPTG. Ces graphiques montrent la lecture de DO 600 mesurée toutes les cinq minutes pendant 24 heures. Dans cette expérience, la protéine fluorescente mCherry a été utilisée à la place du gène bioB afin que le profil d’induction puisse être mesuré lorsque des cellules modifiées étaient induites avec IPTG.

Ces résultats démontrent l’efficacité du réseau de gènes inductibles. Voici les signaux optiques à OD 450 en réponse à des concentrations variables de biotine pour les schémas de surface fonctionnalisés indirects et directs. Dans cette expérience, des produits de cellules modifiées induites ont été utilisés pour modifier chimiquement la surface fonctionnalisée.

Les différentes concentrations de biotine sont présentées telles que mesurées par le schéma de contrôle indirect de surface fonctionnalisée pour les cellules de type sauvage, les cellules non induites contenant le plasmide pKE1-lacI-bioB et les cellules induites contenant le plasmide pKE1-lacI-bioB. Une fois maîtrisées, les cellules peuvent être génétiquement modifiées en deux jours, tandis que les techniques de fonctionnalisation de surface directes et indirectes peuvent être effectuées en cinq heures si elles sont exécutées correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’éviter la contamination de la culture cellulaire bactérienne et de couvrir les surfaces pendant la fonctionnalisation pour éviter le photoblanchiment.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de fonctionnaliser les surfaces pour les schémas de contrôle direct et indirect. N’oubliez pas que travailler avec du bromure d’éthidium peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port de gants, doivent toujours être prises lors de cette procédure.