Name: Utilisation de la biologie synthétique à lingénieur cellules vivantes Interface avec les matériaux programmables (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Découvrez comment utiliser E. coli génétiquement modifié pour contrôler des surfaces matérielles programmables via la biologie synthétique. Cette méthode combine modification génétique et fonctionnalisation de surface pour créer des capteurs dynamiques.

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Les auteurs remercient le soutien de l&#39;attribution FA9550-13-1-0108 de l&#39;Air Force Office de la recherche scientifique des Etats-Unis. Les auteurs reconnaissent en outre le soutien de l&#39;attribution N00014-15-1-2502 de l&#39;Office of Naval Research des Etats-Unis, le financement de l&#39;Institut de technologie de critique et de sciences appliquées à Virginia Polytechnic Institute et l&#39;Université d&#39;Etat, et de la National Science Foundation Graduate Research Programme de bourses, le numéro d&#39;attribution 1607310.

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Nous avons présenté une nouvelle stratégie pour l&#39;interfaçage des cellules modifiées vivant avec une surface de matériau fonctionnalisé. Ceci a été accompli en mettant au point une lignée de cellules capables de synthétiser des taux élevés de la biotine lors de l&#39;induction avec de l&#39;IPTG. Les niveaux élevés de biotine peuvent ensuite être utilisés pour modifier la surface fonctionnalisée. Les protocoles détaillés comment ingénieur de la lignée cellulaire E. coli et comment créer deux surfaces foncti...

Ici, nous rapportons les procédures pour l&#39;élaboration d&#39;un substrat programmable apte à répondre à un signal chimique à partir d&#39;une lignée cellulaire d&#39;ingénierie. 1 Nous faisons cela en créant une interface de biotine-streptavidine qui répond à la biotine produite par Escherichia coli synthétiquement ingénierie (E. coli) des cellules. Auparavant, les surfaces programmables ont été conçus pour une large gamme d&#39;applications de détection de la toxine 2 et le point-of-care diagnostic 3 à la défense et à la sécurité. 4 Alors que les surfaces programmables peuvent être utiles en tant que capteurs et actionneurs, ils peuvent être plus «intelligents» en les dotant de la capacité d&#39;adaptation aux différents défis environnementaux. En revanche, même les micro - organismes simples, tels que E. coli, ont adaptabilité inhérente et sont capables de répondre aux problèmes des solutions complexes et souvent inattendues. Cette capacité d&#39; adaptation a permis E.coli, les populations contrôlées par leurs réseaux de gènes complexes, de manière rentable d&#39;obtenir des ressources, 5 créer des produits à valeur ajoutée, 6 et même puissance robotique micro-échelle. 7 En couplant les avantages adaptatifs de cellules vivantes avec l&#39;utilisation de surfaces programmables, nous pouvons créer un substrat intelligent capable de répondre à différentes conditions environnementales. La biologie synthétique a permis aux chercheurs de nouvelles capacités pour programmer le comportement des organismes vivants. En orchestrant les cellules pour contenir les réseaux de régulation nouveaux gènes, les chercheurs peuvent concevoir des cellules qui présentent une gamme de comportements programmés. 8, 9 Au - delà de la recherche fondamentale, ces comportements peuvent être utilisés pour des applications telles que le contrôle de l&#39; assemblage des matériaux et la production biologique des produits à valeur ajoutée. 10 Ici, nous détaillons comment nous avons utilisé les outils de la biologie synthétique engineer une souche de E. coli qui synthétise la biotine lors de l&#39; induction. Cette souche a été développée en utilisant des méthodes d&#39;enzyme de restriction de clonage pour assembler un plasmide, pKE1-lad-bioB. Ce plasmide, lorsqu&#39;il est transformé dans la souche E. coli K-12 MG1655, lui confère des cellules ayant la capacité d&#39;exprimer des niveaux élevés de bioB, une enzyme essentielle pour la synthèse de la biotine. Lorsque les cellules transformées ont été induites avec de l&#39;isopropyl β-D-thiogalactopyranoside 1 (IPTG) et muni d&#39;un précurseur de la biotine, de la desthiobiotine (BTD), des taux élevés de biotine ont été produites. l&#39;interaction de liaison de biotine avec la streptavidine est l&#39;une des plus fortes liaisons non covalentes trouvés dans la nature. A ce titre, l&#39;interaction biotine-streptavidine est à la fois bien caractérisés et très utilisés dans la biotechnologie. 11 Dans ce manuscrit, nous présentons deux stratégies utilisant l&#39;interaction biotine-streptavidine à détecter et à détecter la biotine produite cellulaire avec une surface fonctionnalisée. nousse référer à ces surfaces contrastées que les systèmes de contrôle &quot;directs&quot; &quot;indirects&quot; et. Dans le schéma de contrôle indirect, la biotine produite cellulaire est en concurrence avec la biotine qui a été conjugué et immobilisé sur une surface de polystyrène pour les sites de liaison streptavidine. En outre, la streptavidine est conjuguée à la peroxydase de raifort (HRP). HRP modifie 3, 3 &#39;, 5, 5&#39;-tétraméthylbenzidine (TMB), pour produire un signal optique, qui peut être 12 surveillée par la quantification de l&#39;absorption spectrale ( par exemple, une densité optique) à 450 nm (DO 450). Ainsi, le système de contrôle indirect permet aux chercheurs de mesurer la biotine produite cellulaire en surveillant la attentuation du signal OD 450. Le système de contrôle direct exploite l&#39;événement streptavidine-biotine en immobilisant streptavidine directement à une surface du matériau et permettant la biotine produite cellulaire et HRP biotinylé à concourir pour les sites de liaison streptavidine. Encore une fois, lales niveaux relatifs de la biotine produite cellulaire sont surveillées en mesurant un signal OD 450. Pris ensemble, les cellules modifiées et des surfaces fonctionnalisés nous permettent de contrôler les propriétés d&#39;une surface programmable en induisant des réseaux dans les cellules vivantes. En d&#39;autres termes, nous avons créé un système qui tire parti de la capacité d&#39;adaptation des organismes vivants et la fiabilité et la spécification d&#39;une interface de matériel d&#39;ingénierie en reliant ces systèmes.

<table><tbody><tr><td>LB Bouillon, Miller&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-795-027</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9744500</td><td></td></tr><tr><td>la carbenicilline.</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26481</td><td></td></tr><tr><td>M9, sels minimaux, 5x</td> acides <td>casaminés Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1424-100</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium, anhydre</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium, dihydraté</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose (D-glucose), anhydre</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>NEB Turbo Cell Line</td><td>New England Biolabs</td><td>C2984L</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucléotide Amorces</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>25N, purification DSL</td></tr><tr><td>Q5 Polymérase haute fidélité</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Tampon de réaction</td><td>New England Biolabs</td><td>B9027S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Solution Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioexpress</td><td>E-3120-125</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromure, 1 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1302-10</td><td></td></tr><tr><td>Kits d’extraction de gel</td><td>Epoch Biolabs</td><td>2260250</td><td></td></tr><tr><td>Kit Miniprep d’ADN plasmidique GenCatch</td><td>Epoch Biolabs</td><td>2160250</td><td></td></tr><tr><td>AatII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0117S</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Tampon Cutsmart</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>ColiRolle Verre Placage Billes</td><td>EMD Millipore</td><td>7101-3</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyle &bêta ;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Desthiobiotin (DTB)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16129</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidyl Trans-4-(maléimidylméthyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC)&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S1534</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Propionate de succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) (SPDP)&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S1531</td><td></td></tr><tr><td>NHS-LC-LC-biotine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21343</td><td></td></tr><tr><td>Raifort peroxydase (HRP)&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31490</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 10x solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399500</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine (SA)&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21145</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothréitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétaacétique (EDTA)&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164-500</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-4</td><td></td></tr><tr><td>3, 3', 5, 5'-tétraméthylbenzidine (TMB)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC229280050</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 500 Concentrateurs centrifuges&nbsp ;</td><td>Viva Products</td><td>VS0192</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium, anhydre</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de polystyrène à 96 puits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>266120</td><td></td></tr></tbody></table>

utilisation de la biologie synthétique à l&#39;ingénieur cellules vivantes interface avec les matériaux programmables

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

Nous avons développé une interface abiotiques-biotiques qui permet aux cellules d&#39;ingénierie pour contrôler les propriétés du matériau d&#39;une surface fonctionnalisée. Ce système est réalisé par la création de deux modules: une souche synthétiquement modifié génétiquement de cellules de E. coli et une interface de matériau fonctionnalisé. Dans cet article, nous détaillons un protocole pour l&#39; ingénierie génétique des comportements sélectionnés au sein d&#39; une souche de E. coli en utilisant des stratégies de clonage moléculaire. Une fois développée, cette souche produit des niveaux élevés de la biotine lorsqu&#39;il est exposé à un inducteur chimique. De plus, nous protocoles de détail pour la création de deux différentes surfaces fonctionnalisés, dont chacun est en mesure de répondre à la biotine synthétisé cellulaire. Pris ensemble, nous présentons une méthodologie pour la création d&#39;un système abiotiques-biotiques lié qui permet aux cellules de contrôle de la composition des matériaux et de l&#39;assemblage sur des substrats inanimés conçu.

Les résultats représentatifs sont présentés dans les figures ci-jointes cinq. Tout d&#39; abord, nous présentons le processus de clonage graphiquement (figure 1) , de sorte que le lecteur puisse suivre visuellement les étapes essentielles pour la création de la souche de E. coli synthétiquement ingénierie. Afin de caractériser la dynamique des populations des cellules, nous fournissons une courbe de croissance (Figure 2) générée en mesurant la d...

Ce document présente une série de protocoles pour le développement de cellules modifiées et des surfaces fonctionnalisés qui permettent synthétiquement par génie E. coli pour contrôler et manipuler les surfaces des matériaux programmables.

Utilisation de la biologie synthétique à l&#39;ingénieur cellules vivantes Interface avec les matériaux programmables

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

L'objectif général de ces procédures est d'utiliser des souches d'E.coli modifiées synthétiquement afin de contrôler et de manipuler des surfaces de matériaux programmables, en combinant des stratégies de modification génétique et de fonctionnalisation de surface. Cette méthode peut contribuer à répondre à des questions clés dans des domaines tels que la médecine moléculaire et la surveillance environnementale. En utilisant des cellules génétiquement programmées capables d'interpréter un environnement local et de modifier en conséquence un matériau fonctionnalisé, nous mettons à disposition un outil modulaire applicable à un large éventail d'utilisations.L'avantage principal de cette technique est que les cellules vivantes sont capables d'agir comme des capteurs dynamiques capables de lire, traiter et enregistrer les conditions environnantes via des interfaces fonctionnalisées. Après avoir préparé les solutions et collecté le surnageant enrichi en biotine à partir d’E.coli producteur de biotine selon le protocole décrit dans le texte, ajoutez 1,4 microlitre de solution SPDP à 20 microlitres de solution de streptavidine (SA). Enveloppez le tube dans du papier d’aluminium et incubez-le à température ambiante pendant une heure et demie afin de permettre au réactif bifonctionnel SPDP de se lier à la SA via un groupe amino, formant ainsi une SA activée par le pyridyldithiol. Après l’incubation, ajoutez 2,4 microlitres de solution de DTT au tube et incubez l’échantillon à température ambiante pendant une heure afin d’induire un clivage de la pyridine-2-thione, conduisant à une SA activée par un groupement sulfhydryle. Ensuite, ajoutez 7,5 microlitres de solution SCC à 72 microlitres de solution d’HRP, enveloppez le mélange dans du papier d’aluminium, et incubez-le à température ambiante pendant une heure et demie.Cela donne une HRP activée par le maléimide liée par un groupe amino. Mélangez 17 microlitres de solution de biotine LC-LC avec 200 microlitres de solution de BSA, enveloppez le tube dans du papier d’aluminium et incubez l’échantillon à température ambiante pendant une heure et demie. Cette étape permet à la biotine de se conjuguer à la BSA via une liaison amide.Transférez la solution SA-SPDP, l'HRP-SMCC et la solution de biotine conjuguée à l'albumine sérique de bœuf (BSA) dans des concentrateurs centrifuges séparés placés dans des tubes de centrifugation. Centrifugez le SA-SPDP à 10 000 × g jusqu'à ce que le volume du tube atteigne 100 microlitres ou pendant 16 minutes, puis complétez le tube de centrifugation jusqu'à 500 microlitres à l'aide de PBS-EDTA avant de répéter la centrifugation et l'ajout de PBS-EDTA cinq fois supplémentaires. Après avoir concentré la solution à 100 microlitres par centrifugation, conservez le stock à quatre degrés Celsius.Pour la SMCC HRP, centrifuger les tubes à 10 000 fois g jusqu'à ce que le volume atteigne 25 microlitres ou pendant 16 minutes. Compléter le tube à centrifuger jusqu'à 4500 microlitres à l'aide de PBS avant de répéter la centrifugation et l'ajout de PBS encore cinq fois. Après avoir centrifugé la solution jusqu'à un volume de 100 microlitres, conserver le stock à quatre degrés Celsius.Pour la biotine BSA, centrifuger l'échantillon à 10 000 fois g jusqu'à ce que le volume atteigne 100 microlitres ou pendant 12 minutes, puis compléter le tube à centrifuger jusqu'à 500 microlitres à l'aide de PBS. Après avoir répété quatre fois supplémentaires la centrifugation et l'ajout de PBS, centrifuger le tube jusqu'à ce que le volume atteigne 100 microlitres ou pendant 12 minutes, puis ajouter 100 microlitres de PBS au tube et conserver la solution mère à quatre degrés Celsius. Ensuite, mélanger 25 microlitres de la solution de HRP à 10 milligrammes par millilitre avec 25 microlitres de la solution de SA à 10 milligrammes par millilitre et conserver le tube à quatre degrés Celsius pendant la nuit, puis préparer deux aliquots de biotine BSA dans du PBS en ajoutant 10 microlitres de la solution mère de biotine BSA à 490 microlitres de PBS.Prélvez 100 microlitres de la solution et déposez-les dans chaque puits d'une plaque de 96 puits. Enveloppez la plaque dans du papier d'aluminium et incubez-la à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de Tween 80 à 05 % et de BPS dans les puits.Incubez la plaque à température ambiante pendant deux minutes, puis aspirez et éliminez le liquide. Après avoir répété le lavage trois fois, ajoutez 200 microlitres de la solution de caséine à 0,5 % dans chacun des puits, puis incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après un autre cycle de lavages comme précédemment, mélangez 12 millilitres de solution de caséine à 0,5 % avec 7,5 microlitres de Tween 80 à 0,5 %, puis utilisez cette solution pour diluer la solution mère de SA-HRP au 1/10 000.Introduisez 80 microlitres de SA-HRP diluée dans chaque puits d'une plaque 96 puits, puis ajoutez 20 microlitres de l'échantillon de biotine préparé dans chaque puits de la plaque. Incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant une heure. Cette étape permet une liaison compétitive entre la biotine libre et la biotine BSA immobilisée pour les sites de liaison de SA-HRP.Ensuite, après avoir lavé la plaque trois fois comme précédemment, préparez une solution de 20 millilitres contenant de l'acétate de sodium 50 millimolaire, 1 % de TMB et 3 % de peroxyde d'hydrogène dans un rapport de 1 000 à 10 à un. Ajoutez 200 microlitres de la solution dans chaque puits de la plaque, enveloppez-la dans du papier d'aluminium et incubez-la à température ambiante pendant 15 minutes. Pipetez 50 microlitres d'acide sulfurique deux molaire dans chaque puits pour arrêter la réaction, puis utilisez un lecteur de plaque pour mesurer l'OD à 450 nm.Après avoir préparé les solutions conformément au protocole décrit dans le texte, ajouter 7,5 microlitres de biotine LC-LC à 72 microlitres de HRP. Envelopper la solution dans du papier d'aluminium et incuber l'échantillon à température ambiante pendant une heure et demie sous agitation. Cette étape permet la conjugaison de la biotine au HRP par une liaison amide.Transférez la solution dans un concentrateur centrifuge à l’intérieur d’un tube de centrifugation et centrifugez-la à 10 000 ×g jusqu’à ce que le volume atteigne 100 microlitres ou pendant 12 minutes, puis utilisez du PBS pour compléter le volume du tube de centrifugation jusqu’à 500 microlitres et répétez la centrifugation et l’ajout de tampon quatre fois. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de 0,17 microgramme par millilitre de SA dans du PBS dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Enveloppez la plaque dans du papier d’aluminium et incubez-la à 37 degrés Celsius pendant une heure.Pour laver les puits de la plaque, pipetez 200 microlitres de Tween 80 à 0,5 % dans chaque puits. Incubez la plaque à température ambiante pendant deux minutes, puis versez délicatement le liquide. Après avoir répété le lavage trois fois supplémentaires, ajoutez 200 microlitres de la solution de trempage à 0,5 % dans les puits.Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant une heure avant de laver les puits trois fois comme précédemment. À l'aide de la solution de biotine HRP lavée et concentrée préparée auparavant, diluer la solution mère de biotine HRP au 1/10 000, puis ajouter 80 microlitres de cette solution dans les puits d'une plaque 96 puits. Ajouter 20 microlitres de l'échantillon de biotine préparé dans chaque puits de la plaque et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant une heure afin de permettre une liaison compétitive entre la biotine libre et la biotine HRP pour les sites de fixation de la streptavidine (SA) immobilisés.Après avoir lavé les puits trois fois comme précédemment, préparez une solution de 20 millilitres de 50 millimolaire d'acétate de sodium, 1 % de TMV et 3 % de peroxyde d'hydrogène selon un ratio de 1 000 à 10 à un. Ajoutez 200 microlitres de la solution dans chaque puits de la plaque, recouvrez-la de papier d'aluminium et incubez à température ambiante pendant 15 minutes, puis ajoutez 50 microlitres d'acide sulfurique deux molaire dans chaque puits pour arrêter la réaction. Enfin, utilisez un lecteur de plaques pour mesurer l'OD à 450.Les cellules sauvages de type E.coli MG1655 modifiées de manière ingénierie ont été cultivées et surveillées dans un milieu minimal ainsi que dans un milieu minimal supplémenté en DTB et/ou en IPTG. Ces graphiques montrent les mesures de DO 600 prises toutes les cinq minutes pendant 24 heures. Dans cette expérience, la protéine fluorescente mCherry a été utilisée à la place du gène bioB afin de pouvoir mesurer le profil d'induction lorsque les cellules modifiées étaient induites par l'IPTG.Ces résultats démontrent l'efficacité du réseau génique inductible. Les signaux optiques à une densité optique de 450 nm, en réponse à des concentrations variables de biotine, sont représentés ici pour les deux schémas de surface fonctionnalisée, indirect et direct. Dans cette expérience, les produits de cellules génétiquement modifiées induites ont été utilisés pour modifier chimiquement la surface fonctionnalisée.Les différentes concentrations de biotine sont présentées telles qu'elles ont été mesurées par le biais du schéma de contrôle indirect sur une surface fonctionnalisée, pour des cellules de type sauvage, des cellules non induites contenant le plasmide pKE1-lacI-bioB et des cellules induites contenant le plasmide pKE1-lacI-bioB. Une fois maîtrisée, la modification génétique des cellules peut être réalisée en deux jours, tandis que les techniques de fonctionnalisation directe et indirecte de la surface peuvent chacune être effectuées en cinq heures si elles sont correctement exécutées. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir d'éviter toute contamination de la culture de cellules bactériennes et de couvrir les surfaces pendant la fonctionnalisation afin d'éviter le photoblanchiment.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment fonctionnaliser des surfaces pour les schémas de contrôle directs et indirects. N'oubliez pas que le travail avec le bromure d'éthidium peut être extrêmement dangereux, et que des précautions, telles que le port de gants, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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